Extracto
La trabectedina (Yondelis, ET-743) es una de origen marino alcaloide tetrahidroisoquinolina. Se deriva originalmente del tunicado marino del Caribe
Ecteinascidia turbinata
y actualmente producido sintéticamente. Trabectedina es activo frente a una variedad de líneas de células tumorales que crecían en cultivo. El presente estudio se centró en el efecto de la trabectedina en la proliferación celular, la progresión del ciclo celular, la apoptosis y la formación de esferoides en las células madre de cáncer de próstata (CSC). Grupo de diferenciación (CD) 133
+ alto /CD44
+ se aislaron células madre cancerosas de próstata de alto desde el DU145 y PC-3 línea celular de cáncer de próstata humano mediante citometría de flujo. Se estudiaron los efectos inhibidores del crecimiento de la trabectedina y sus mecanismos moleculares en células madre cancerosas de próstata humanos y no los CAC. DU-145 y PC-3 CSC se trataron con 0,1, 1, 10 y 100 nM para la trabectedina 24, 48 y 72 h y las tasas de inhibición de crecimiento se examinaron utilizando el ensayo de formación de esferas. análisis de ensayo de inmunofluorescencia y Anexina-V se realizaron para la detección de la muerte celular. También se evaluaron los efectos dependientes de la concentración de trabectedina en el ciclo celular. Las células se expusieron a las diferentes dosis de trabectedina para 24, 48 y 72 h para evaluar el efecto de la trabectedina en el número y diámetro de los esferoides. Según los resultados, la trabectedina indujo citotoxicidad y apoptosis en el IC
50 dosis, lo que resulta en un aumento de la expresión significativa de la caspasa-3, caspasa-8, caspasa-9, p53 y disminuir la expresión de bcl-2 en dosis-dependiente manera. Los análisis del ciclo celular reveló que la trabectedina induce la detención del ciclo celular /M-fase G2 dependiente de la dosis, sobre todo en tratamientos de dosis alta. estudios de cultivo tridimensional mostraron que la trabectedina redujo el número y el diámetro de los esferoides de DU145 y PC3 células madre cancerosas. Además, hemos encontrado que la trabectedina interrumpe las interacciones célula-célula a través de E-cadherina en prostasphere de DU-145 y PC-3 células madre cancerosas. Nuestros resultados mostraron que la trabectedina inhibe la proliferación celular y acelera eventos apoptóticos en células madre cancerosas de la próstata; y puede ser un agente terapéutico potencial efectivo contra el cáncer de próstata
Visto:. Acikgoz E, T Guven, Duzagac F, R Uslu, Kara M, Soner C., et al. (2015) G2 Mejorado /M Detención, caspasa apoptosis relacionada reducido E-cadherina dependiente de adhesión intercelular por la trabectedina en cáncer de próstata Células Madre. PLoS ONE 10 (10): e0141090. doi: 10.1371 /journal.pone.0141090
Editor: Shian-Ying Sung, Universidad de Medicina de Taipei, Taiwán
Recibido: 23 de julio de 2015; Aceptado: 3 de octubre de 2015; Publicado: 20 Octubre 2015
Derechos de Autor © 2015 Acikgoz et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
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financiación:.. los autores no tienen ningún soporte o financiación reportar
Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El cáncer de células madre (células madre cancerosas) hipótesis establece que los tumores contienen sólo una pequeña subpoblación de células con un potencial de auto-renovación y diferenciación. CSC se cree que son responsables de la iniciación del tumor y el mantenimiento del crecimiento del tumor y la supervivencia celular después de la quimioterapia debido a su resistencia a las terapias contra el cáncer convencionales [1]. Durante el desarrollo de tumores temprano, CSC puede someterse a una división celular auto-renovación simétrica en dos células madre cancerosas hijas idénticas, sino también generar poblaciones a granel de no CSC por la división celular asimétrica [2]. La mayoría de las células en los tumores a granel han limitado potencial tumorigénico y metastásico en comparación con células madre cancerosas. Para un tratamiento más eficaz del cáncer, puede ser necesario dirigirse tanto a células madre cancerosas y poblaciones no CSC.
CSC se han aislado previamente usando marcadores de superficie celular CSC-específicas, tales como CD44, CD133, CD24, integrina α2β1 y dehydrogenase1 aldehído. CD133 y CD44 son las células más comúnmente utilizado
- marcadores de superficie
para la identificación de células madre cancerosas. CD133 es un miembro de glicoproteínas transmembrana pentaspan. Fue descrita por primera vez en hematopoyéticas y células neurales madre /progenitoras y también es un marcador de células madre cancerosas en muchos tumores sólidos [3, 4]. CD44 es una glicoproteína de superficie celular multi-estructural y multi-funcional en todas partes. Está implicado en la adhesión celular, la migración y la metástasis de una variedad de células tumorales y la regulación stemness de células madre cancerosas [5]. Se ha demostrado previamente que un CD44
+ /α2β1
alta /CD133
+ fenotipo representan las células de cáncer de próstata tumorigénicos candidato [6]. Por lo tanto, CD133
+ /CD44
+ células podrían ser objetivos potenciales de la terapia antitumoral en el futuro.
monocapa convencional en dos dimensiones (2D) estudios en cultivos celulares han tenido éxito en la explicación del comportamiento de Los CSC. Por otra parte, in vitro imita tridimensional (3D) modelo de cáncer de las características del entorno in vivo y por lo tanto proporciona una mejor oportunidad de entender los mecanismos de células madre de cáncer cruciales y para desarrollar nuevas aplicaciones terapéuticas clínicos [7]. In vitro, células madre cancerosas tienden a formar espontáneamente agregados celulares tridimensionales, denominados esferoides que representan las propiedades de diferenciación de células madre cancerosas y se utilizan para contribuir a la generación de tumores, la progresión y la resistencia a la quimioterapia en varios estudios. Se ha demostrado que la E-cadherina es la molécula de adhesión importante mediar la interacción célula-célula apretado y se ha correlacionado con una formación de esferoides compacto en líneas celulares de cáncer de próstata [8, 9].
trabectedina es un tetrahidroisoquinolina marina alcaloide. La trabectedina se ha aislado del tunicado marino del Caribe
Ecteinascidia turbinata Opiniones y actualmente se produce sintéticamente [10]. Trabectedina tiene una potente actividad citotóxica contra una variedad de tipos de tumores en varios tumores sólidos
in vitro
y
in vivo
. Se está pasando por las fases I y II de los ensayos clínicos en Europa y los Estados Unidos con la promesa de un medicamento contra el cáncer para el tratamiento de una amplia gama de tumores [11]. Sin embargo contra el cáncer actividad y mecanismo de acción aún no está claro. Se ha demostrado que la trabectedina se une a la la posición N2 de guanines en el surco menor del ADN, el ADN hacia el surco mayor flexión e interfiere con varios factores de transcripción y vías de reparación del ADN [11]. También se sabe que la trabectedina induce daño en el ADN. Esto altera la función normal de los procesos de reparación del ADN y de transcripción, lo que resulta con una detención de la proliferación, diferenciación y muerte celular. [11, 12, 13]. La actividad anti-proliferativa de la trabectedina es dependiente de la dosis: a concentraciones bajas (1 a 10 ng /ml), trabectedina produce perturbaciones del ciclo celular con una tasa de disminución de la progresión de la fase S y la acumulación de células en fase G2. A concentraciones más altas (10 a 100 ng /ml), proceso de transcripción independiente conduce a la apoptosis a través de la activación de diferentes vías de transducción de señales que implican la liberación mitocondrial de citocromo c, JNK y caspasa 3 activación [14]. Las actividades citostáticas y pro-apoptóticos de la trabectedina resultan de la activación de la intrínseca y /o rutas apoptóticas extrínsecos. La vía intrínseca se caracteriza por permeabilización de la membrana externa mitocondrial y liberación de citocromo-c en el citoplasma; un proceso regulado por la familia Bcl-2 de proteínas. El trabajo previo sugiere que la trabectedina desencadena la liberación del citocromo c de la mitocondria, que normalmente se inhibe por la sobreexpresión de Bcl-2 [14].
Recientemente, nuevas evidencias han demostrado que las células madre cancerosas juegan un papel crítico en el desarrollo de resistencia a los medicamentos, y la metástasis reaparición. Por lo tanto, es importante investigar y encontrar nuevos fármacos que de forma selectiva y eficaz atacar y matar células madre cancerosas. El estudio tuvo como objetivo investigar los efectos de la trabectedina en CD133
+ alto /CD44
+ células madre cancerosas de próstata de alto en el sistema de cultivo 2D y 3D.
Materiales y Métodos
Cultivo de células condiciones y reactivos
hormona humana y líneas celulares de cáncer de próstata resistentes a los medicamentos, PC-3 y DU145 se purchsed de la American Type Culture Collection (Manasas, VA, EE.UU.) y se cultivaron en medio RPMI 1640 (
Lonza
,
Basilea
,
Suiza |) medio de cultivo que contiene 10% de suero bovino fetal inactivado por calor (Gibco, Invitrogen Life Technologies, Paisley, Reino Unido), 1% de penicilina y estreptomicina ( Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.). Las células fueron cultivadas en 25 cm
2 frascos de poliestireno (Corning Life Sciences, UK) y mantenido en una incubadora a 37 ° C en una atmósfera húmeda en presencia de 5% de CO
2. Crecimiento y morfología se comprobaron microscópicamente diariamente para asegurar la salud celular. Las células se dividieron mediante pasajes cuando habían alcanzado aproximadamente un 80% de confluencia. Las células en matraces semiconfluentes se recogieron usando tripsina al 0,05% (Sigma-Aldrich) y se centrifugaron (Nuve NF200; Laboratorio y la tecnología de esterilización, Ankara, Turquía) después de la adición de RPMI 1640 para la inactivación de la tripsina. Después de la centrifugación se resuspendieron en medio de cultivo. Trabectedina fue proporcionado por PharmaMar (Madrid, España) y se preparó como una solución madre 2 mM en sulfóxido de dimetilo (DMSO). La concentración de DMSO en el ensayo no excedió de 0,1% y no fue citotóxica para las células tumorales. Los anticuerpos utilizados fueron anti-caspasa-3 (1: 100 diluida; 3510-100, Biovision, Inc., Milpitas, CA, EE.UU.), anti-caspasa-8 (1: 100 diluida; 250576, Abbiotec, EE.UU.), anti- caspasa-9 (1: 100 diluido; SantaCruz Biotechnology, EE.UU., sc-17784), anti-p53 (1: 100 diluido; 3036R-100, BioVision, Inc.), anti-bcl2 (1: 100 diluyó; SantaCruz Biotechnology, EE.UU., sc-135757), anti-E-cadherina (1: 100 diluido; Bios, EE.UU., bs-1519R), de cabra anti-inmunoglobulina de conejo isotiocianato G-fluoresceína (FITC) (1: 100 diluida; sc-2012, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, EE.UU.) y la inmunoglobulina de pollo anti-conejo Alexa Fluor
® 594 (1: 100 diluida; Invitrogen, EE.UU., A21442)
clasificación de células activadas por fluorescencia. (FACS)
Antes de la cosecha, las líneas celulares se cultivaron hasta una confluencia del 80%. Por FACS (FACSAria; BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.), las células fueron separadas utilizando la solución de disociación celular no enzimática (Sigma-Aldrich) y se resuspendieron en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS, Invitrogen, EE.UU.). Aproximadamente 5x10
4 células se incubaron con un anticuerpo (diluido 1: 100 en FACS se lava con 0,5% de albúmina de suero bovino; NaN3 2 mM y EDTA 5 mM) durante 15 min a 4 ° C. Un isotipo y la concentración coincidente con ficoeritrina (PE) marcado con anticuerpo de control (Miltenyi Biotec Ltd., Woking, Surrey, Reino Unido) fue usado y las muestras se marcaron con marcado con PE CD133 /1 (clon AC133 /1; Miltenyi Biotec Ltd. ) y marcado con FITC CD44 (clon G44-26; BD Biosciences). Después de 3-5 minutos, las células se lavaron y posteriormente se volvieron a suspender. Las células fueron ordenados para ser CD 133
/CD44
alta población de alto (células de clasificación) y no la clasificación homólogos utilizando un citómetro de flujo FACSAria, con análisis post-especie realiza para confirmar la pureza de la población. poblaciones de células según se cultivaron en dos configuraciones diferentes, cultura monocapa 2D o 3D esferoides de tumor multicelulares.
análisis de viabilidad de las células
La viabilidad de las células después del tratamiento se determinó utilizando el Muse ™ Contar y kit de Viabilidad (Cell Analyzer Muse ™; Millipore, Billerica, MA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células se sembraron por triplicado en placas de 6 pocillos a una densidad de 1 x 10
4cells /pocillo. Después de 24 h de incubación, las células fueron expuestas a concentraciones crecientes de trabectedina (0,1, 1, 10, 100 nM). A continuación, las placas se incubaron a 37
° C en un 5% de CO
2 incubadora durante 24, 48 y 72 h. Después de la incubación, se recogieron todas las células y se diluyeron con solución salina tamponada con fosfato (PBS). 50 l de suspensión de células se añadió luego en 450 l MUSE contar y reactivo de Viabilidad (10x dilución), se incubaron durante 5 min a temperatura ambiente, y se analizaron usando el Cell MUSE Analyzer. Los datos se presentan como la viabilidad proporcional (%) comparando el grupo tratado con trabectedina las células no tratadas, la viabilidad de los cuales se supone que es 100%.
analiza la muerte de la célula
La distribución de las células apoptóticas se determinó utilizando el MUSE Anexina V & amp; Kit Dead Cell (Merck KGaA) según las instrucciones del fabricante. En pocas palabras, después del tratamiento con trabectedina, se recogieron todas las células y se diluyeron con PBS que contenía 1% de albúmina de suero bovino (BSA) como un tampón de dilución hasta una concentración de 5x10
5 células /ml. 100 l de anexina V /reactivo muertos y 100 l de una suspensión de células se mezclaron en un microtubo y en la oscuridad durante 20 min a temperatura ambiente. Las células se analizaron entonces usando el analizador de células Muse (Merck Millipore). La proporción de apoptosis se determinó mediante la identificación de cuatro poblaciones: (i) células nonapoptotic, no sometidos a apoptosis detectable: Anexina V (-) y 7-AAD (-); (Ii) las células apoptóticas temprano, Anexina V (+) y 7-AAD (-); (Iii) las células apoptóticas tarde, Anexina V (+) y 7-AAD (+); (Iv) células que han muerto a través de la vía nonapoptotic: Anexina V (-) y 7-AAD (+). Las muestras fueron determinados por la cámara de análisis Muse (Merck Millipore).
análisis del ciclo celular
ciclo celular análisis se realizaron utilizando un kit de ciclo celular Muse ™ de Millipore de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células fueron cultivadas en placas de 6 pocillos tratados con varias concentraciones de trabectedina (0,1, 1, 10, 100 nM); después se recogieron por tripsinización y se lavaron dos veces con PBS. Las células se fijaron con 1 ml de etanol al 70% frío a -20 ° C durante 5 h y se trataron con 200 l de reactivo ciclo celular Muse y se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad. El porcentaje de células en G0 /G1, S y G2 /M fases se calculó utilizando un analizador de células Muse (Millipore, EE.UU.).
Esfera de formación y de formación de colonias ensayos
La formación de esferoides potencial de CD133
alta /CD44
alta células madre cancerosas de próstata humana se evaluó en 3D condiciones de cultivo no adherente. Inicialmente, el CD133
alta /CD44
altos células madre cancerosas prostáticas humanas fueron cultivadas como una monocapa después de lo cual se contaron, se resuspendieron y se sembraron con 1x10
4 células por pocillo en una placa de 6 pocillos pre-recubierto con una capa fina de 3% agar Noble (w /v) (Difco Laboratories, Inc .; BD Diagnostic Systems, Detroit MI, EE.UU.) en medio RPMI 1640 que contiene 10% de FBS y se incubaron a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% CO
2. medios de cultivo celular se sustituyó cada 2-3 días con medio fresco para eliminar los desechos celulares y los esferoides que no fueron bien formada. Después de que el inicio de la formación de esferoides de tumor multicelulares, se añadió la trabectedina a diversas concentraciones de trabectedina (0,1, 1, 10, 100 nM) y se incubó durante 24, 48 y 72 h. El número y el diámetro de las colonias dentro de cada pocillo se fotografiaron y se contaron todos los días bajo el microscopio (Olympus BX-51; Olympus, Hamburgo, Alemania) y las imágenes de los campos representativos fueron capturados. Cada muestra se analizó por triplicado y todos los experimentos se realizaron tres veces.
Inmunofluorescencia tinción
Tras el tratamiento con dosis IC
50 de la trabectedina, se colocaron las células en cubreobjetos recubiertos de lisina, se fijaron en 4% de paraformaldehído durante 15 min. Posteriormente, las células se permeabilizaron con 0,1% Triton X-100 durante 10 minutos a temperatura ambiente, se lavó tres veces con PBS, se bloquearon con PBS que contiene 5% de albúmina de suero bovino durante 1 h y se incubaron con anticuerpos primarios contra la caspasa-3, caspasa 8, caspasa-9 p53, bcl-2 y e-cadherina durante la noche a 4 ° C. A continuación, las células se trataron con el anticuerpo secundario durante 1 h a temperatura ambiente en una cámara humidificada. Las células inmunoteñidas se montaron en medio que contiene DAPI de montaje y se visualizaron mediante un microscopio de fluorescencia equipado con una cámara (Olympus BX-51 y la prueba digital Olympus C-5050).
El análisis estadístico
Los experimentos se llevaron a cabo por triplicado. El análisis estadístico se realizó mediante el uso de análisis de varianza de una sola vía, seguido por el test post hoc de Tukey Dunett o de. p & lt; 0,05 fue considerado para indicar una diferencia estadísticamente significativa
Resultados
Pureza y las tasas de clasificación de CD 133
alta /CD44
alta ordenados y no ordenados subpoblación
DU145 y PC-3 células de cáncer de próstata humano se clasifican para la expresión CD133 y CD44 superficie con FACS (Fig 1A y 1B). Los resultados mostraron que las tasas de DU-145 células madre cancerosas y no células madre cancerosas fueron 3,2 ± 5,4% (Fig 1A) y 96,8 ± 5,4% (Fig 1B), respectivamente. En las células PC-3, las tasas fueron 3,9 ± 5,4 para las células de clasificación y 96.1 ± 5.4 para las células no-clasificación. Se realizó un análisis post-tipo para determinar la pureza de las poblaciones de células ordenados; el cual resultó ser & gt;. 85%
(A) DU-145 células madre cancerosas se aislaron de DU-145 línea celular de próstata humana. (B) Los CCC PC-3 fueron aisladas de DU-145 línea celular de próstata humana. CD133
altos /CD44
altas poblaciones presentan en P6. CD, grupo de diferenciación; FACS, la clasificación de células activadas por fluorescencia.
El aumento de citotoxicidad de CD133 CD44
células madre cancerosas alta /alta de la próstata con trabectedina
Para determinar el efecto de la trabectedina en la viabilidad de las células humanas epiteliales de próstata (RWPE-1), células de cáncer de próstata (DU-145 y PC-3), CSC próstata (DU-145 y PC-3 células madre cancerosas) y la población mayor (DU-145 no células madre cancerosas y PC-3 no CSC) se expusieron a concentraciones crecientes de trabectedina (0,1 a 100 nM) para 24, 48 y 72 h, y el porcentaje de células viables en las muestras se determinaron por ensayo de viabilidad celular.
trabectedina reduce célula viabilidad en la línea celular de próstata humano DU145, DU-145 células madre cancerosas y DU-145 no células madre cancerosas en un tiempo-y de manera dependiente de la concentración (figura 2). Después de 24 h de tratamiento, la media máxima concentración inhibitoria (IC
50) se encontraron valores de la trabectedina a ser de 100 nM en DU-145 no células madre cancerosas; mientras que IC
50 valor de la trabectedina en línea de células DU-145 y células madre cancerosas no se pudo obtener (figura 2A). Después de 48 h de tratamiento, el IC
50 valores de la trabectedina se encontró que eran 10 nM, 100 nM y 9,2 nM, respectivamente, en la línea de células DU-145, DU-145 células madre cancerosas y DU-145 no células madre cancerosas (Fig 2B). Después de 72 h de tratamiento, el IC
50 valores de la trabectedina se encontró que 1 nM, 9,3 nM y 1 nM, respectivamente, en la línea de células DU-145, DU-145 células madre cancerosas y DU-145 no células madre cancerosas (Figura 2C) .
la citotoxicidad se determinó por el analizador de células Muse ™. Los resultados se expresan como la media de 3 experimentos diferentes (± SD) (p & lt; 0,001 en comparación con el control no tratado).
trabectedina disminuyó la viabilidad celular en la línea PC-3 humana de células de próstata, PC- 3 células madre cancerosas y PC-3 no células madre cancerosas en un tiempo-y de manera dependiente de la concentración (figura 2). IC
valor 50 de la trabectedina no se pudo conseguir a los tres grupos durante 24 h. Después de 48 h de tratamiento, el IC
Se encontraron 50 valores de la trabectedina a ser de 100 nM en la línea celular PC-3 y PC-3 no los CAC; mientras que IC
50 valor de la trabectedina en PC-3 células madre cancerosas no se pudo obtener (figura 2B). Después de 72 h de tratamiento, el IC se encontraron
50 valores de la trabectedina a ser de 9 nM, 10 nM y 8 nM, respectivamente, en la línea celular PC-3, PC-3 células madre cancerosas y PC-3 no células madre cancerosas (Figura 2C). Aunque, trabectedina redujo la viabilidad de las células madre cancerosas y no células madre cancerosas de una manera dependiente de la concentración, la viabilidad de las células RWPE-1 fue significativamente mayor que las células de cáncer de próstata después de la exposición a la trabectedina, lo que indica que las células madre de cáncer de próstata eran más sensibles a la trabectedina de células RWPE-1 epiteliales normales de la próstata.
muerte celular por apoptosis inducida trabectedina ambas células madre cancerosas y no las CSC
Para examinar si las células sufren apoptosis, línea de células DU-145 no tratada o tratada trabectedina-, DU -145 células madre cancerosas, DU-145 no CSC, la línea celular PC-3, PC-3 células madre cancerosas, PC-3 células madre cancerosas no fueron expuestas a concentraciones crecientes de trabectedina y evaluada por el Muse ™ Anexina V y ensayo de Dead Cell (figura 3 ). Anexina V y el análisis de la célula muerta de células pueden distinguir las células en cuatro grupos, a saber, viable (anexina V (-) y 7-AAD (-), la apoptosis temprana Anexina V (+) y 7-AAD (-), a finales de la apoptosis, Anexina V (+) y 7-AAD (+) y Anexina necrótico V (-).. y 7-AAD (+) trabectedina apoptosis inducida significativamente en todos los grupos de una manera dependiente de la concentración análisis estadísticos mostraron una diferencia significativa entre las células tratadas de trabectedina en comparación con el control (p & lt; 0,001).
(a) línea de células DU-145, (B) DU-145 células madre cancerosas, (C) DU-145 no los CAC, (D) línea celular PC-3, (e) PC-3 células madre cancerosas, (F) PC-3 no CSC. las células se trataron con 0,1, 1, 10 y 100 nM trabectedina durante 48 h. Después se recogieron las células el tiempo de incubación y la externalización fosfatidilserina se evaluó usando Anexina V . protocolo que describe sobre la base de Anexina V reactividad y la intensidad de la fluorescencia 7-AAD, las células se pueden clasificar en cuatro categorías:. muerto, vivo, apoptosis temprana y la apoptosis tardía /muertos trabectedina fue mostrado para inducir la muerte celular por apoptosis en el cáncer células madre principalmente con el aumento de la apoptosis temprana (verde), las células y la aparente disminución en el porcentaje de células vivas. Trabectedina también indujo significativamente las células apoptóticas totales (amarillo) de una manera dependiente de la dosis. Los datos representan la media ± SEM de tres experimentos diferentes. La significación estadística se determinó con análisis de varianza de una sola vía, seguido por el test post hoc de Tukey Dunett o de. p & lt; 0,05 fue considerado para indicar una diferencia estadísticamente significativa
Los resultados mostraron que la exposición trabectedina a concentraciones crecientes produjo una mayor población de células apoptóticas tempranas.. Sobre la base de nuestros datos, concluimos que la trabectedina induce la muerte celular por apoptosis en todos los grupos analizados con un marcado incremento en la apoptosis temprana a las 48 horas. La trabectedina indujo la apoptosis totales en línea de células DU-145 (figura 3A), DU-145 CSC (figura 3B), DU-145 no CSC (figura 3C), PC-3 línea celular (Figura 3D), PC-3 CSC (Fig 3E) y PC-3 no CSC (Fig 3F) de una manera dependiente de la dosis.
caspasa-3, caspasa-8, caspasa-9, p53 y bcl-2 asociada a flavopiridol modular apoptosis
la tinción de inmunofluorescencia para la caspasa-3, caspasa-8, caspasa-9, p53 y Bcl-2 compatibles nuestros resultados y dieron información sobre la ruta apoptótica en cuestión. En línea de células DU-145 (Fig 4A), DU-145 células madre cancerosas (figura 4B) y DU-145 no CSC (Fig 4C) tratados 10 nM trabectedina resultó en un aumento significativo en la tinción de inmunofluorescencia de la caspasa-3, caspasa-8 , caspasa-9 y p53. Por el contrario, la tinción de inmunofluorescencia de bcl-2 visiblemente se disminuyó en comparación con el control. Observaciones similares se registraron en la línea celular PC-3, PC-3 células madre cancerosas y PC-3 no los CAC: tinción de inmunofluorescencia de la caspasa-3, caspasa-8, y p53 se incrementaron y se redujo la tinción de inmunofluorescencia de Bcl-2. No se observaron cambios significativos en la tinción de inmunofluorescencia de la caspasa-9
.
(A) DU-145, (B) DU-145 células madre cancerosas, (C) DU-145 no células madre cancerosas. Tras el tratamiento con 10 nM trabectedina; caspasa-3, caspasa-8, caspasa-9, p53 y bcl-2 se visualizaron utilizando anticuerpo secundario conjugado con FITC (verde). tinción nuclear fue visualizado utilizando DAPI (azul). Las imágenes son representativos de tres experimentos independientes. La barra de escala representa 50 micras.
Regulación del ciclo celular con el tratamiento con trabectedina en dosis altas
Para evaluar si la inhibición del crecimiento trabectedina inducida de las células es mediada por alteraciones en el ciclo celular, examinado el efecto de la trabectedina en la distribución del ciclo celular mediante el kit de ensayo de células muertas. Aumento de tiempo de incubación como resultado un aumento de la cantidad de células en G2 /M en todos los grupos; particularmente con dosis altas (10 y 100 nm)
tratamientos.
Después de 48 h de 0,1 nM poblaciones de células tratamiento trabectedina en la fase G0 /G1, S y G2 /M fases fueron 55,3, 27,6 y 17,1%, respectivamente en la línea de células DU-145, y el 58,3, el 23,1 y el 18,6%, respectivamente, en DU-145 células madre cancerosas. Después de la incubación de 1 nM trabectedina, los porcentajes fueron de 54,0, 21,2 y 24,8%, respectivamente, en células DU-145; y 50.1, 26.9 y 23.0%, respectivamente, en DU-145 células madre cancerosas. La incubación con 10 trabectedina nM dio lugar a los porcentajes de 35,7, 29,8 y 34,5%, respectivamente, en la línea celular DU-145 y 37,0, 32,5 y 30,4%, respectivamente, en DU-145 células madre cancerosas (Fig 5A y 5B). Cuando las células fueron tratadas con 100 nM trabectedina, los porcentajes de las tres clases de células fueron 28,0, 29,5 y 42,5%, respectivamente, en la línea celular DU-145; y 38,1, 21,8 y 40,0%, respectivamente, en DU-145 células madre cancerosas. En DU-145 no células madre cancerosas, las poblaciones de células en G0 /G1, S y G2 /M fases fueron 56.2, 24.4, 19.4%, respectivamente, después de 48 h de incubación con 0,1 nM trabectedina. Los porcentajes de las tres clases de células con 1 nM de incubación trabectedina fueron 50,1, 19,3, 30,6%; con trabectedina 10 nM y 37,2, 22,9 y 39,9% (Figura 5C); con 100 nM trabectedina 25.5, 29.1, 45.4%, respectivamente, después de 48 h de incubación.
(A) DU-145, (B) DU-145 células madre cancerosas, (C) DU-145 no los CAC, (D) PC-3, (E) de PC-3 no los CAC, (F) PC-3 células madre cancerosas. Las células fueron tratadas con 10 nM trabectedina durante 48 h. El porcentaje de células en G0 /G1, S y G2 /M fases se calcula entonces usando un analizador de células Muse. Los histogramas de un experimento representativo muestran el efecto de la trabectedina en el perfil del ciclo celular. En particular, la trabectedina influenciada significativamente las células en la fase G2 /M, en particular en el tratamiento de dosis alta. Los datos mostrados aquí son de un experimento representativo repitió tres veces con resultados similares.
Después de 48 h de tratamiento con 0,1 nM de trabectedina, las poblaciones de células en la fase G0 /G1, S y G2 /M fases fueron 57,0 , 24.6 y 18.4%, respectivamente, en la línea celular PC-3, y 69,4, 12,7 y 17,8%, respectivamente, en PC-3 no células madre cancerosas. La incubación con 1 nM trabectedina, los porcentajes de las tres clases de células fueron 45,8, 25,5 y 28,6%, respectivamente, en la línea celular PC-3 y 48,7, 22,9 y 28,3%, respectivamente, en PC-3 no células madre cancerosas. La incubación con 10 nM trabectedina, los porcentajes de las tres clases de células fueron 49,5, 17,7 y 32,7% (figura 5D), respectivamente en la línea celular PC-3 y 35,8, 31,1 y 33,0% (Fig 5E), respectivamente, en PC- 3 sin fines de células madre cancerosas. La incubación con 100 nM trabectedina, los porcentajes fueron de 43,8, 18,9 y 37,3%, respectivamente, en la línea celular PC-3 y 28,0, 26,4 y 45,6%, respectivamente, en PC-3 no células madre cancerosas. Observaciones similares se registraron en PC-3 células madre cancerosas. La exposición de estas células a las concentraciones de trabectedina de 0,1, 1, 10 y 100 nM dio lugar a 76,4, 62,7, 50,3, 45,8 detención% en la fase G0 /G1, respectivamente; y 15.0, 22.0, 27.6 detención, el 26,3% (respectivamente) en la fase S, y 8.6, 15.3, 20.9 detención, el 27,9% (respectivamente) en la fase G2 /M (figura 5F). Estos resultados indican que la inhibición del crecimiento observado en todos los grupos tratados con trabectedina se asocia principalmente con la detención en la fase G2 /M.
capacidad de las células madre cancerosas y no las CSC
Comparación de la formación de esferoides
DU-145 Los CSC y PC-3 y no los CAC se cultivaron en 3D condiciones de cultivo no adherentes. la formación de esferoides se evaluó bajo un microscopio de contraste de fase. CD133
alta /CD44
altos células madre cancerosas de la próstata humana (figura 6A y 6B) fueron capaces de formar esferoides; mientras que las CSC no falló (figura 6C y 6D).
A) DU-145 células madre cancerosas, B) PC-3 células madre cancerosas, (C) DU-145 no los CAC, (D) PC-3 no Los CSC. CD133
alta /CD44
altos células madre cancerosas de próstata humanos fueron capaces de formar esferoides; mientras que las CSC no falló.
La inhibición de la formación de esferas con trabectedina
DU-145 células madre cancerosas y PC-3 células madre cancerosas tumoroids formados en el día cinco y tres, respectivamente. Los primeros esferoides se incubaron durante 24, 48 y 72 h y las células se trataron con 0,1, 1, 10 y 100 nM trabectedina. Se determinó el número y el diámetro de las colonias en cada pocillo cada día bajo el microscopio. Las mediciones de tamaño y números tumoroid revelaron una citotoxicidad dependiente de la dosis en tumoroids tratados en comparación con los controles no tratados. Trabectedina redujo el número y el diámetro de esferoides de células madre cancerosas DU145 y PC3 células madre cancerosas de una manera dependiente de la dosis y el tiempo (figuras 7 y 8). Con el aumento de dosis de trabectedina, no se observó aumento de la muerte celular para acompañar a la disolución de esferoides de células madre cancerosas DU145 y PC3 células madre cancerosas.
(A) DU-145 CSC, (B) PC-3 células madre cancerosas. La capacidad de formación de esferas de CD133
alta /CD44
alta DU-145 y PC-3CSCs se suprime notablemente en una forma dependiente de la dosis desde el principio de la constitución esferoide. Después de que el inicio de la formación de esferoides de tumor multicelulares, se añadió la trabectedina a diversas concentraciones de trabectedina (0,1, 1, 10, 100 nM) durante 24, 48 y 72 h. Una disminución significativa se observó en el diámetro de la formación de esferoides. Los resultados son representativos de los datos recogidos a partir de al menos tres experimentos.
(A) DU-145 células madre cancerosas, (B) PC-3 células madre cancerosas. Después de que el inicio de la formación de esferoides de tumor multicelulares, se añadió la trabectedina a diversas concentraciones de trabectedina (0,1, 1, 10, 100 nM) durante 24, 48 y 72 h. El número de esferoides de 15-20 campos al azar fueron contados y calculado. La trabectedina reducido el número de esferoides de células madre cancerosas DU145 y PC3 células madre cancerosas en una forma dependiente de la dosis y el tiempo.
Expresión
E-cadherina se redujo en CD133
CD44
altos células madre cancerosas de la próstata con alta /trabectedina
Para investigar el papel de la trabectedina en la expresión de la adhesión célula-célula de e-cadherina mediada en DU-145 y PC-3 células madre cancerosas cultivadas en tres dimensiones condiciones in vitro, se analizó la tinción de inmunofluorescencia de E- cadherina. Nuestros resultados mostraron que los ensayos de inmunofluorescencia después del tratamiento de DU-145 y PC-3 células madre cancerosas con IC
50 dosis de trabectedina, la expresión de E-cadherina significativamente disminuyó en comparación con el control (Figura 9).
(A) DU -145 células madre cancerosas, (B) PC-3 células madre cancerosas. Después de la formación de esferoides de tumor multicelulares, DU-145 células madre cancerosas y PC-3 CSC esferoides fueron tratados con trabectedina. La trabectedina interrumpe las interacciones célula-célula E-cadherina mediada en esferoides multicelulares de DU-145 y PC-3 células madre cancerosas. E-cadherina se visualizaron utilizando Alexa Fluor
® 594 anticuerpo secundario conjugado (rojo) Los núcleos se tiñeron con DAPI (azul). Barra de escala: 100 micras
Discusión
Nuestro estudio es el primero en demostrar los efectos preventivos del cáncer de trabectedina en células madre cancerosas de la próstata humana.. Estudios recientes de cáncer han puesto de manifiesto que una población minoritaria de las células en los tumores de graneles es responsable de la iniciación del tumor, el crecimiento y la resistencia a los tratamientos convencionales. La mayoría de fármacos contra el cáncer bajo investigación, mientras que matar la mayor parte de las células tumorales, en última instancia, no logran eleminate CSC, que causa de la recurrencia del tumor y la metástasis. Por lo tanto, la atención se ha centrado en definir nuevo fármaco contra el cáncer para la prevención del cáncer y la terapia de células madre cancerosas mediante la eliminación.
La trabectedina tiene el potencial de ser un agente quimioterapéutico eficaz para el desarrollo de nuevas estrategias de tratamiento que se dirigen específicamente células madre cancerosas de la próstata. Nuestros datos sugieren fuertemente que la trabectedina inhibe el crecimiento de células madre cancerosas de la próstata de una manera dependiente de la dosis, a través de la detención del ciclo celular y la apoptosis.