Extracto
Antecedentes
Debido a que algunos marcadores definitivos están disponibles para las células madre del cáncer hepático (HCSCs), basado en física en lugar de propiedades inmunoquímicas, se aplicó un nuevo método para enriquecer HCSCs.
Metodología
Después de las células tumorales hepáticas (CTH) fueron aislados por primera vez de modelo de HCC diethylinitrosamine inducida F344 rata utilizando Percoll centrifugación en gradiente discontinuo (PDGC) y se purificó mediante tripsinización diferencial y el apego diferencial (DTDA), que fueron separados en cuatro fracciones mediante centrifugación en gradiente de Percoll continua (PCGC) y designan secuencialmente como fracciones I a IV (FI-IV). Características morfológicas, los niveles de ARNm y proteínas de marcadores de células madre, las capacidades de proliferación, diferenciación inducida,
in vitro
capacidades migratorias,
in vitro
capacidades de quimio-resistentes, y
in vivo
capacidades malignos se determinaron para las células de cada fracción.
los resultados
a medida que la densidad de células aumentó, 22,18%, 11,62%, 4,73% y el 61,47% de los HTC cultivo primario fueron segregados en FI-FIV, respectivamente. Las células de F III (densidad entre 1,041 y 1,062 g /ml) mostraron una mayor relación núcleo-citoplasma y un menor número de orgánulos y expresaron mayores niveles de marcadores de células madre (AFP, EpCAM y CD133) que las células de otras fracciones (
P & lt;
0,01). Además,
, las células de F III mostraron in vitro
una mayor capacidad de auto-renovación, diferenciarse en los HTC maduros, el tránsito a través de membranas, arañazos estrechos, y llevar a la resistencia a la quimioterapia que hicieron las células de cualquier otra fracción;
in vivo
, la inyección de sólo el 1 × 10
4 células de F III podrían generar tumores no sólo en el tejido subcutáneo, sino también en los hígados de los ratones desnudos.
Conclusiones
a través de nuestro nuevo método, las células HCSC-como se enriquecieron con éxito en F III. Este estudio contribuirá en gran medida a dos importantes áreas de interés biológico:. Aislamiento CSC y terapia HCC
Visto: Liu W-h, Wang X, N, Tao K-s, Wang T, Tang L-J, et al. (2012) Enriquecimiento eficiente de cáncer hepático células madre como las provenientes de HCC modelo de rata primaria a través de un gradiente de densidad de centrifugación centrada en el método. PLoS ONE 7 (4): e35720. doi: 10.1371 /journal.pone.0035720
Editor: Kwan hombre, la Universidad de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 3 Febrero 2012; Aceptado: March 20, 2012; Publicado: 25 Abril 2012
Derechos de Autor © 2012 Liu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 81170419, 81172061, 8100309). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Durante la última década, la noción de que los tumores son mantenidos por sus propias células madre, las denominadas células madre del cáncer (CSC), ha creado una gran expectación en la comunidad de investigación [1]. Células madre cancerosas son células tumorales generalmente inactivos o ciclos lentos que tienen la capacidad para reconstituir los tumores [1]. Se cree que participan en la resistencia del tumor a la quimioterapia /terapia de radiación y la recaída y progresión tumoral. Los CSC son importantes porque son responsables de la resistencia al tratamiento. La obtención de una mayor comprensión de-CSC específico rasgos ofrecerá puntos de vista con respecto a las primeras etapas de la tumorigénesis para ayudar en la prevención de este fenómeno y para mejorar la selectividad de las terapias antitumorales. La existencia de células madre cancerosas fue propuesta por primera vez hace más de 40 años [2]; sin embargo, fueron recientemente aislados de tumores sólidos, incluyendo tumores de mama [3], de próstata [4], el cerebro [5] y de colon [6]. A pesar de que los CAC se han aislado de algunos tipos de tumores, existe un gran debate en torno a este tema.
El carcinoma hepatocelular (HCC) es un tipo muy maligno de tumor sólido asociado con la metástasis frecuentes y mal pronóstico [7]. Células madre cancerosas hepáticas aisladas (HCSCs) representan un
in vitro
modelo adecuado para el desarrollo de estrategias terapéuticas dirigidas a la erradicación de la subpoblación tumorigénico dentro de HCC. Es por esta razón que la identificación y comprensión de HCSCs son cruciales. Para aislar HCSCs, una variedad de técnicas de separación están disponibles. Un método común para las CSC de aislamiento ha sido caracterizar su fenotipo de la superficie celular y el uso de marcadores para seleccionar negativamente o positivamente para las células particulares. Se ha informado de células tumorales hepáticas (CTH) con las teclas + o propiedades madre-como EpCAM + fenotipo tienen CD133 [8]; sin embargo, se ha demostrado que exhiben plasticidad limitada. En la actualidad, un marcador específico para el aislamiento de HCSCs sigue siendo controvertido. Se necesita urgentemente un método alternativo para aislar HCSCs. Otro método para la separación CSC se basa en el flujo de salida de diferencial de colorantes fluorescentes, tales como rodamina 123 o Hoechst 33342. Recientemente, el aislamiento de células población lateral (SP) utilizando colorante Hoechst 33342 se ha convertido en un método útil para la obtención de células madre cancerosas de diversos tumores. En un estudio anterior de nuestro grupo, hemos enriquecido HCSCs de la línea celular MHCC97 basado en el flujo de salida de la rodamina 123 o Hoechst 33342 [9]. Sin embargo, todavía hay algunas limitaciones asociadas con este método, tales como la detección de células madre de falsos positivos y el requisito de instrumentos especiales. La última opción para el aislamiento de células madre cancerosas se basa en métodos de separación física, tales como separación por gradiente de densidad. En un estudio anterior, se lograron aislar células madre del hígado fetal /progenitoras (FLSPCs) a partir de células de hígado fetal de cultivo primario a través de centrifugación en gradiente de densidad centrado en un método de tres pasos [10].
En el presente estudio, nuestro propósito es determinar si HCSCs se pueden obtener mediante la explotación de sus propiedades físicas. Para este propósito, hemos aplicado nuestro método de tres pasos establecida con un ligero ajuste para aislar HCSCs de CTH primarios. Los CTH se aislaron primero utilizando Percoll centrifugación en gradiente discontinuo (PDGC), después se purificó basa en tripsinización diferencial y diferenciado adherencia (DTDA), y finalmente en capas por Percoll centrifugación en gradiente continuo (PCGC). HTC se separaron por tanto en cuatro subpoblaciones. La tercera subpoblación, que contenía las células menor cantidad, con una densidad que oscila entre 1,041 y 1,062 g /ml, mostró la más alta expresión de marcadores de células madre, la mayor capacidad para proliferar y formar colonias
in vitro
, el mayor capacidad de migrar
in vitro
, la capacidad más fuerte para ser resistentes a la quimioterapia, y la capacidad más rico para generar tumores en ratones NOD /SCID. Todos estos resultados indican que la población de la tercera capa de los gradientes pcgc poseía características CSC. Esta nueva estrategia para aislar HCSCs hará grandes contribuciones en dos áreas principales: se proporcionará nuevos conocimientos relacionados con el aislamiento de otros tipos de células madre cancerosas; y que nos permitirá investigar la contribución de HCSCs en HCC.
Materiales y Métodos
1 Procedimiento para la separación de los HTC
1.1 Construcción de un modelo de HCC por diethylnitrosamine (DEN ) la inducción
.
Doce varones ratas Fisher 344 (Laboratorio Nacional de recursos Animales roedores, Shanghai, china) en el grupo de prueba se trataron con 0,05% DEN (Sigma Co, Nueva York, EE.UU.) en el agua de bebida durante 6 semanas y luego se cambiaron a agua potable normal [11]. Otros doce macho Fisher 344 ratas en el grupo de control se les dio una dieta normal. A las 10, 14 y 18 semanas después de la inducción DEN, se sacrificaron cuatro ratas de cada grupo. Las muestras de tejido del hígado de cada grupo fueron procesados de manera rutinaria y se tiñeron con hematoxilina y eosina (H & amp; E) para examen histológico. Todos los experimentos con animales se realizaron estrictamente de acuerdo con los protocolos de estudio de los animales [12] y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de Investigación en la Cuarta Universidad Médica Militar.
1.2 Identificación de HCC por inmunohistoquímica.
para identificar mejor el tipo de tumores hepáticos que se produjeron en las ratas, los niveles de expresión de AFP y CK19 fueron examinados por inmunohistoquímica. secciones embebidas en parafina fueron desparafinados con xileno y una serie de concentración de etanol, se bloquearon con suero de cabra al 20%, y se tiñeron con una AFP de conejo anti-rata primaria o CK-19 anticuerpo (dilución 1:200; Santa Cruz, CA). Cabra anti-conejo secundaria de anticuerpos IgG se utilizaron para la tinción de AFP o CK-19. Estas secciones también se contratiñeron con 2- (4-diamidinophenyl) dihidrocloruro -6-indolecarbamidine (DAPI) (dilución 1:100; Sigma) para detectar los núcleos. Los controles negativos fueron teñidas y sin anticuerpos primarios. Las secciones teñidas se examinaron bajo un microscopio de fluorescencia (FV1000MPE, Olympus Corporation, Tokio, Japón). Las tasas positivas para AFP y CK-19 se determinaron en todas las secciones.
1.3 Aislamiento de los HTC por PDGC.
nódulos HCC individuales fueron retirados de cada rata en el grupo de prueba. CTH primas se aislaron de acuerdo con Hohne et al. [13] con modificaciones menores. En pocas palabras, los nódulos de HCC se picada en medio E de William (Sigma Co, Louis, MO, EE.UU.) con 0,1% de colagenasa tipo IV y 0,005% de tripsina (Sigma Co, Louis, MO, EE.UU.) y se incubaron durante 20 minutos a 37 ° C en un baño de agua con agitación. Después de la incubación, los sobrenadantes de las células liberadas se pasaron a través de una malla de nylon 100 micras y se centrifugaron a 1000 xg durante 8 min. Los sedimentos se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) (Invitrogen Co, EE.UU.) para obtener los HTC primas. Estos CTH primas se prepararon como suspensiones de células individuales y se separan en diferentes fracciones usando PDGC (30%, 50% y 70% de Percoll). Se recogieron las células en la interfase de 30% y 50% de Percoll y se cultivaron en placas de 6 pocillos que contienen medio de William E suplementado con 10% vol /vol de suero bovino fetal (Invitrogen Co, EE.UU.), 5 mg /ml de insulina (Sigma Co , Louis, MO, EE.UU.), hidrocortisona 5 mM, 100 U /ml de penicilina y estreptomicina 100 mg /ml a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO
2. Cuando las células adherentes extendieron como una colonia monocapa 20 días más tarde, se recogieron las células monoclonales mediante la digestión local con cilindros de clonación y los trasladó a una nueva placa de cultivo para continuar con el proceso de cultivo.
1.4 Purificación de los HTC por DTDA .
Para obtener los HTC puros, las células en cultivo se trataron de la siguiente manera. Sobre la base de los resultados de un estudio anterior de nuestro grupo [10], las células de diferentes tamaños pueden ser tripsinizadas dentro de períodos de tiempo distintos. Se ha encontrado cuando las células se digieren con tripsina al 0,25% durante 10 min, las células muy grandes se tratan con tripsina y excluidos, mientras que otras células permanecen. Este método se conoce como "tripsinización diferencial". Curiosamente, cuando las células se trataron con tripsina completamente para subcultivo durante un período de 120 min, las células grandes no se adhieren a las placas y se eliminaron fácilmente. Este fenómeno se conoce como "adherencia diferencial". HTC se purificaron a través de estos dos stepsHTCs.
1.5 Separación de los HTC por PCGC.
El protocolo se realizó de acuerdo con los métodos de nuestro estudio anterior [10]. En pocas palabras, para crear gradientes continuos, una solución de Percoll 40% se centrifugó a 20.000 × g durante 90 min usando un rotor cabeza angular. A continuación se dejó el tubo en reposo durante 30 min, y la suspensión celular se depositó suavemente en la parte superior de los gradientes preformados. El tubo que contiene las células se centrifugó a 500 xg durante 15 min usando un rotor de cubeta oscilante. Desde la parte superior a la parte inferior del tubo, ya que las densidades de células aumentaron de forma continua, se recogieron cuatro fracciones de células y las fracciones I-IV (FI-IV) (Figura 1A) designado.
(A) Los tumores pequeños (flechas negras) fueron causadas por las 10 semanas de inducción DEN. (B) El hígado había sido casi completamente reemplazada por tumores de gran tamaño 18 semanas después de la inducción DEN. (C) de visión baja magnificación de un H & amp; E-sección teñida de tejido tumoral. (D) de visión de alta magnificación de un H & amp; E-sección teñida. (E) de visión baja magnificación de una sección teñida-AFP. (F) de visión de alta magnificación de una sección teñida-AFP. (G) aumento de la vista inferior de una sección teñida-CK-19. (H) de visión de alta magnificación de una sección teñida-CK-19. (I, J) Imágenes de los HTC cultivo primario. (K, L) Imágenes de los HTC purificados por DTDA. magnificaciones originales: 100 × (C, I-L), 200 × (D, E, G), 400 × (F, H) guía empresas
2 comparación morfológica entre las diferentes fracciones
. electrón
2.1 Transmisión microscopía (TEM).
Las células recién aisladas de cada fracción se fijaron con 2,5% glutaraldehído a 4 ° C durante 4 h, después se aclararon con PBS frío y se fijaron además en 1% de osmio tetróxido a temperatura ambiente durante 2 h. Las muestras se deshidrataron primero usando un gradiente de etanol y acetona, entonces embebido en resina Epon812 y acetona (v /v, 1:01) durante 30 min, seguido de resina Epon812 100% durante 1 h. La resina Epon812 se solidificó a 37 ° C durante 24 h y a 60 ° C durante 48 h. Los cortes ultrafinos se prepararon utilizando un ultramicrotomo LKB (Ultrotome NOVA; LKB, Broma, Suecia) y se tiñeron con acetato de uranilo y citrato de plomo para su examen por TEM (JEM-2000Ex, JEOL Ltd., Japón)
2.2 inmunofluorescencia. (SI) de la tinción con faloidina.
a fin de analizar las diferencias morfológicas entre las células recién aisladas de cada fracción, se utilizó la tinción phalloidin. Las células se trataron primero con un anticuerpo primario faloidina (dilución 1:100; Santa Cruz, CA) y luego con una cabra conjugado con FITC anti-conejo anticuerpo secundario fluorescente (dilución 1:100; Santa Cruz, CA) durante 2 h. La morfología general de las células se observó bajo un microscopio de fluorescencia, y se calcularon los números de cilios y seudópodos.
3 Comparación de los marcadores entre diferentes fracciones
3.1 citometría de flujo (FCM).
Las células recién aisladas de cada fracción se prepararon a una concentración de 10
6cells /ml utilizando medio de William e (que contiene 20% de FBS) y se incubaron durante 15-30 minutos a temperatura ambiente para bloquear no específica sitios. Estas células luego se lavaron dos veces con PBS y re-suspenden en 990 l de PBS. Posteriormente, 10 l de anticuerpos, incluyendo CD133 (PE-conjugado, Biolegend, EE.UU.) y EpCAM (FITC-conjugado, Biolegend, EE.UU.), se añadieron a cada suspensión celular. Después de 30 min de incubación a 4 ° C en la oscuridad, las células se lavaron dos veces con PBS, se fijaron en 0,1% de formaldehído y se analizaron utilizando el sistema FACSCaliburTM (BD Sistemas Immunocytometry, San Jose, CA).
3,2 Si el análisis.
Después de que las células recién aisladas de cada fracción adherida a un portaobjetos de cultivo, se lavaron dos veces con PBS, se fijaron con 4% de paraformaldehído durante 20 min, y se sumergieron en PBS durante 10 min, seguido por la exposición a 0,01% de Triton X-100 a temperatura ambiente durante 10 min. Las células se trataron con 6% de suero de cabra (Santa Cruz, CA) a temperatura ambiente durante 30 min para bloquear las reacciones inmunes no específicos y luego con CD133 primario (dilución 1:200; Santa Cruz, CA), AFP (dilución 1: 200; Santa Cruz, CA) y CK-19 (dilución 1:200; anticuerpos a 4 ° C durante la noche Santa Cruz, CA). Después las muestras se lavaron dos veces con PBS, se incubaron con PE fluorescente /conjugado con FITC de cabra anti-conejo secundaria de anticuerpos (dilución 1:100; Santa Cruz, CA) durante 2 h. Posteriormente, las muestras se trataron con DAPI (dilución 1:100; Sigma) durante 15 min. Se observó la fluorescencia de las muestras usando un microscopio de fluorescencia (FV1000MPE, Olympus Co, Tokio, Japón).
3.3 Cuantitativo en tiempo real de reacción en cadena de la polimerasa (QRT-PCR).
El ARN total se extrajo de las células recién aisladas de cada fracción utilizando el reactivo TRIzol (Molecular Research Center, Cincinnati, OH) y transcripción inversa en ADNc con transcriptasa inversa Superscript II de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA). Una cantidad igual de ADNc a partir de cada muestra se amplificó con cebadores específicos (Tabla 1). PCR se realizó utilizando SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) durante 40 ciclos. Los parámetros de los ciclos de la PCR fueron 10 minutos a 95 ° C, 15 segundos a 95 ° C, y 30 segundos a 60 ° C, con una etapa de disociación final de 15 segundos a 95 ° C, 20 segundos a 60 ° C, y 15 segundos a 95 ° C utilizando el sistema en tiempo real PCR Bio-Rad MyIQ5 (Bio-Rad, California, EE.UU.). Cada muestra se ensayó por triplicado. los niveles de mRNA se normalizaron usando GAPDH como referencia interna.
4 La diferenciación inducida por el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF)
Todas las células de cada fracción fueron cultivadas por separado en suero comercial medio libre (Sigma Co, Louis, MO, EE.UU.) suplementado con HGF a una concentración de 20 ng /ml. Después de todas las células en placas de 96 pocillos (1 x 10
3 células /pocillo) se cultivaron durante 14 d, que se recogieron y la identificación exacta se realizó como sigue. La diferenciación se evaluó mediante la detección de la expresión de CD133 células madre cancerosas marcador específico de FCM y el marcador de HCC AFP por IF. Los protocolos detallados fueron como los descritos anteriormente.
5 Funcional comparación entre diferentes fracciones
5.1 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2, bromuro de 5-difeniltetrazolio (MTT) ensayo.
las capacidades proliferativas de las células recién aisladas de cada fracción se determinó usando el ensayo de MTT. Brevemente, las células se cultivaron en placas de 96 pocillos a una densidad de 1 × 10
3 células /pocillo. A los 2, 4, 6, 8, 10, 12 y 14 días de cultivo, MTT (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.) disuelta en PBS se añadió a cada pocillo a una concentración final de 5 mg /ml, y la muestras se incubaron a 37 ° C durante 4 h. cristales de formazano azul oscuro insolubles en agua que se formaron durante la escisión de MTT en células que metabolizan de forma activa se disolvieron en dimetilsulfóxido (DMSO) (Gibco /Invitrogen, Nueva York, EE.UU.). La densidad óptica se midió a una longitud de onda de 490 nm con un lector de microplacas 680 Bio-Rad (Bio-Rad, California, EE.UU.).
5.2 Prueba de formación de colonias.
Las células recién aisladas de cada fracción se inocularon por separado en cada pocillo (10 células por pocillo) de placas de 96 pocillos (Corning Life Sciences, Acton, MA) suplementado con 100 a 200 l de medio E de William además de factor inhibidor de leucemia (LIF) a una concentración de 10 g /ml. La viabilidad celular se evaluó mediante tinción con azul de tripano (Sigma-Aldrich) en varios puntos temporales. Después de 4 semanas de cultivo, cada pocillo se examinó mediante microscopía de luz, y se contó el número total de colonias de células. Las imágenes de las colonias se registraron utilizando un microscopio (Nikon Eclipse TS100, Nikon, Kingston upon Thames, Reino Unido) y una cámara digital (fotónica C4742-95, Hamamatsu, Welwyn Garden City, Hertfordshire, Reino Unido) bajo condiciones de contraste de fase.
5.3 ensayo de migración Transwell.
un total de 1 × 10
5 células en 0,5 ml de medio libre de suero E Williams de cada fracción fueron sembradas en un niño de 8 micras de poro membrana de tamaño de policarbonato cámara de Boyden inserta en un aparato de transwell (Costar, Cambridge, MA) recubiertas con Matrigel. Se añadió un total de 600 l de medio E de Williams que contenía 20% de FBS a la cámara inferior. Después de incubación durante 24 horas a 37 ° C en un 5% CO
2 incubadora, las células de la superficie superior del inserto se eliminaron frotando con un hisopo de algodón. Las células que habían migrado a la superficie inferior del inserto se fijaron en 100% de metanol durante 2 min, se tiñeron en 0,5% de cristal violeta para 2 min, se enjuagaron en PBS y se sometieron a inspección a través de microscopía. Los valores para la invasión y la migración se obtuvieron mediante el recuento bajo un microscopio de luz invertida (Olympus Corporation, Tokio, Japón) en 5 campos seleccionados al azar.
5.4
in vitro
ensayo de cero.
cada pocillo de placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos se sembró con células a una densidad final de 100.000 células por pocillo, y se mantuvieron estas células a 37 ° C bajo 5% de CO
2 para 24 h para permitir que se adhieran y para formar monocapas confluentes. Estas monocapas confluentes fueron luego anotó con una punta de pipeta estéril para dejar un rasguño de aproximadamente 0,4-0,5 mm de ancho. El medio de cultivo se retiró de inmediato (junto con cualquier célula desalojadas). El medio retirado se sustituyó con medio fresco de William E. Todos los ensayos de cero se realizaron por triplicado. cierre de Scratch se controló mediante la recopilación de imágenes digitales en el comienzo del experimento y a intervalos regulares durante el proceso de migración celular para cerrar el cero, y las imágenes se compararon para cuantificar la tasa de migración de las células. Las imágenes digitales fueron capturados utilizando un microscopio invertido (Nikon Eclipse TS100, Nikon, Kingston upon Thames, Reino Unido) y una cámara digital (fotónica C4742-95, Hamamatsu, Welwyn Garden City, Hertfordshire, Reino Unido) durante la primera fase.
5,5 quimioterapéutico experimento.
Para confirmar
in vitro
quimio-resistencia, 1,5 × 10
5 células de cada fracción se sembraron en placas de 24 pocillos y se trataron con paclitaxel (10 ng /ml) durante 24 h. La dosis óptima de paclitaxel usado en este estudio se adoptó de acuerdo con nuestros experimentos preliminares. se utilizó para la detección de apoptosis de las células, un kit de detección de apoptosis con anexina V-FITC /PI (Immunotech Co., Marsella, Francia Anexina V-FITC /PI tinción Kit). Brevemente, se recogieron las células tratadas con paclitaxel, se lavaron en PBS frío, se incubaron durante 15 min con fluoresceína conjugado de anexina V y PI de acuerdo con los protocolos del fabricante, y se analizaron por FCM.
Formación
5,6 Tumor en NOD /los ratones SCID.
Treinta y seis NOD /SCID ratones machos (6-8 semanas de edad) obtenidos a partir del centro de animales de laboratorio de Xiehe Universidad médica de Beijing (Pekín, china) se mantuvieron en condiciones de patógenos limitado al animal centro de recursos de la Cuarta Universidad médica Militar (Xi'an, china). Estos ratones fueron divididos al azar en seis grupos: F0, FI, FII, F III VIF, y la línea celular HeG2 control. Por lo tanto, cada grupo se suministra con 6 ratones. Las células fueron inyectadas en ratones NOD /SCID por vía subcutánea, en diferentes cantidades (1 × 10
5 y 1 × 10
4). El crecimiento tumoral se monitorizó cada 2 días después de la segunda semana de la inoculación. Todos los ratones fueron sacrificados 60 días después de la inyección. Todos los tejidos tumorales resultantes se recogieron, se fijaron en 4% de formaldehído, y embebidos en parafina para H & amp; E tinción para evaluar la histología del tumor. Los tumores fueron clasificados de acuerdo a su tamaño. La existencia de ningún tumor macroscópico se definió como negativo (-); un diámetro del tumor de & lt; 0,2 cm como positivo (+); un diámetro de 0,2-0,5 cm como moderadamente positivo (++); y un diámetro de & gt; 0,5 cm como fuertemente positiva (+++)
6 estadístico El análisis
software
SPSS 14,0 se utilizó para todas las evaluaciones estadísticas.. Todos los datos se expresan como la media ± error estándar de experimentos separados (n≥3, donde n representa el número de experimentos independientes). Los datos fueron analizados para la significación estadística mediante ANOVA de una vía.
P
. & Lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Resultados
formación
1 HCC y los HTC aislamiento
Cuando las ratas fueron sacrificadas 10 semanas después de la inducción DEN , sólo los tumores de pequeño tamaño pueden ser encontrados (Figura 1A). A las 18 semanas después de la inducción DEN, la mayoría de los tejidos del hígado de las ratas habían sido reemplazados por tejidos tumorales con superficies rugosas (Figura 1B). Sobre la base de las evaluaciones de los tres patólogos independientes, H & amp; E tinción se verifica que los tumores eran todos carcinoma hepático derivados (Figura 1 C, D). Para identificar más del tipo de los tumores, se seleccionaron un marcador de HCC (AFP) y otro marcador para el colangiocarcinoma (CK-19) para teñir secciones de tejido de los mismos tumores. La mayoría de las células tumorales dentro de nódulos tumorales teñidas positivamente para AFP (68,7 ± 6,21%) (Figura 1E, F). En contraste, se encontró que casi no las células que se tiñeron positivamente para CK-19 sobre un área grande (1,12 ± 0,13%) (Figura 1G, H). En resumen, los tumores se tiñeron positivamente para la AFP y negativamente para CK-19. Este hallazgo indica que estos tumores eran casi origen hepático, que es coherente con los resultados de H & amp; E tinción. Los CTH aisladas de tejidos HCC primarios crecieron lentamente al principio, con que se forman sólo unas pocas colonias, y se muestran morfología heterogénea (Figura 1I, J). A través de la purificación DTDA, los HTC proliferaron rápidamente y fueron mucho más homogénea (Figura 1K, L). Por lo tanto, estos HTC podrían ser utilizados para experimentos posteriores.
2 Fraccionamiento de los HTC por PCGC
En un estudio anterior, hemos encontrado que la centrifugación de Percoll al 40% durante 90 minutos dio lugar a la formación de un gradiente continuo óptimo [10]; Por lo tanto, en el presente estudio, hemos aplicado esta metodología para fraccionar los HTC. En estas condiciones, de acuerdo con la distribución de los sedimentos celulares, se dividió la población CTH (F0) en cuatro fracciones principales (fracción I-IV, FI-IV). Con base en el monitoreo de la densidad de los granos de la etiqueta de plástico, cuatro fracciones celulares se eliminaron suavemente individualmente del tubo, desde la parte superior a la parte inferior (Figura 2A). Recuento celular reveló que 22,18 ± 2,13%, 11,62 ± 1,06%, 4,73 ± 0,38% y 61,47 ± 6,24% de las células fueron separados en FI-FIV, respectivamente, lo que significa que FIV contenía las mayoría de las células, y las células menor cantidad (menos de se encontraron 5% de células) en F III (Figura 2A). Sobre la base de histogramas punto de parcelas obtenidas a partir de FACS, antes de la separación, las células en F0 fueron heterogéneos en tamaño, mientras que después de la separación, el tamaño de las células en cada fracción se convirtió en algo más homogénea. Como era de esperar, el análisis FCM de cada subpoblación reveló un aumento en la granularidad celular [FSC (dispersión frontal) /SSC (dispersión lateral)] con el aumento de densidad de Percoll (Figura 2B). Así, de FI para FIV, las células aumentaron continuamente de tamaño.
(A) Ilustración esquemática de la gradiente continuo Percoll utilizado para el fraccionamiento y los porcentajes de células segregadas en cada fracción. (B) punto de parcelas histogramas resultantes de análisis FACS que muestra las densidades de células en cada fracción. (C) La microscopía óptica de las células de cada fracción en la fase. (D) imágenes de TEM y los diámetros de las células de cada fracción. (E) Imágenes de células teñidas por faloidina reflejan las diferentes morfologías de las superficies celulares. magnificaciones originales: 100 × (C), 6000 x (D), 400 × (E) guía empresas
3 comparación morfológica de las células de la FI-VIF
Las células de cada fracción. se cultivaron por separado en medio de William E. Las células de F III fueron los primeros en adherirse a las placas, que tuvo lugar en menos de 2 horas, seguido de las células de FI y FII en 2,5 h, y las células de FIV y F0, que requiere más de 3 h. En
in vitro
condiciones de cultivo, las células de forma heterogénea en tamaño F0 pudieron observarse fácilmente. Después de la separación, se encontró que las células de FI y FII eran las más pequeñas, seguido de F III, y las células de FIV fueron las más grandes (Figura 2C).
Las imágenes TEM muestran fenómenos similares como se observa en la Los resultados obtenidos a través de microscopía de luz. Las células F0 exhiben una gran variedad de diámetros, que van desde 6 micras a 30 micras (Figura 2D). Los diámetros de las células de FI y FII eran las más pequeñas, seguido de F III, y los diámetros de las células de FIV fueron las más grandes (Figura 2D). Mientras tanto, las células de F III presentan la más alta relación núcleo-citoplasma y los orgánulos menor cantidad; en contraste, las células de FIV mostraron la más baja relación núcleo-citoplasma y la mayoría de los orgánulos (Figura 2D). Esto indicó que las células de F III fueron los más inmaduros.
Además, se tiñeron las células de cada fracción utilizando faloidina. En microscopía de fluorescencia, las células de F III fueron ligeramente más brillantemente teñidas por faloidina y se muestran más cilios o pseudópodos en sus superficies que hizo las células de cualquier otra fracción (Figura 2E). Sin embargo, el análisis estadístico indicó que la diferencia no fue significativa (
P Hotel & gt; 0,05).
4 Expresión de marcadores de células madre
Para determinar las propiedades de las células madre de en cada fracción, dos marcadores de células madre relativamente ampliamente aceptadas fueron detectados por FCM inmediatamente después de la separación. Tanto EpCAM y CD133 fueron más altamente expresado en las células recién aisladas de F III en comparación con las otras fracciones (
P
& lt; 0,01) (Figura 3A, C). El porcentaje de células EpCAM-positivas en F III fue tan alta como 81,5 ± 7,96%, y el porcentaje de células CD133 positivas fue aún mayor, en 84,7 ± 8,53%. En contraste, la expresión de ambos marcadores de células madre en las células recién aisladas de VIF era más bajo:. 7,1% ± 0,64% para EpCAM y 5,7% ± 0,63% para CD133 (Figura 3A, C)
(A) La expresión de marcadores de células madre (EpCAM y CD133) en cada fracción determinada por FCM. (B) Sobre la base de SI (verde, núcleos en azul), se encontraron células CD133 positivas (rojo, núcleos en azul) y AFP y células CK-19-positivas que deben incluirse en diferentes proporciones. (C) Gráfico de columnas que refleja los datos obtenidos a través de la FCM. (D) Gráfico de columnas que refleja los datos generados por el SI. resultados (E) QRT-PCR de marcadores específicos en las células recién aisladas de cada fracción. F0 representa los HTC no fraccionadas; FI-IV indica las fracciones I a IV después de la separación. * Se refiere a
P Hotel & lt; 0,01 en comparación con cualquier otra fracción. Aumento original:. 100 × (B) guía empresas
Para identificar adicionalmente las propiedades de las células madre de de cada fracción, se detectó la expresión de CD133 usando SI. El porcentaje de células CD133-positivo fue el más alto de F III, al 83,2% ± 8,01%, y la más baja de VIF, en el 4,6% ± 0.42%, (Figura 3 B, C). También seleccionamos un marcador hepática tumor (AFP) y un marcador de tumor biliar (CK-19) para identificar las células de cada fracción. Después de la segregación, el porcentaje de células positivas para AFP en F III fue la más alta (89,6% ± 8,27%), siendo mucho más alta en cualquier otra fracción (
P
& lt; 0,01) (Figura 3B, D). Sin embargo, sólo unas pocas células en FI se determinó que eran CK-19 positivo (6,1% ± 0,54%), y casi no hay células en F0, F II, F III y FIV expresan CK-19 (Figura 3 B, C).
El fenómeno descrito anteriormente fue cuantitativamente verifica por medio de QRT-PCR. Los niveles relativos de EpCAM y AFP mRNA fueron más altos en las células de F III (
P Hotel & lt; 0,01), siendo casi cuatro veces más alta que la observada en las células de F0. En contraste, los niveles de ARNm de AFP y EpCAM fueron los más bajos en las células de FIV (
P
& lt; 0,01), siendo la mitad de los niveles en células de F0 (Figura 3E). De acuerdo con los resultados de IF, CK-19 mRNA sólo pudo ser detectada en las células débilmente de FI (pliegue relativo fue de 0.103 ± 0.012); Sin embargo, CK-19 mRNA apenas se pudo detectar células de F0, F II, F III y FIV (Figura 3E). Además, el marcador hepática madura ALB se expresa moderadamente en las células de VIF, expresa muy débilmente en células de F0, FI y FII, y se expresa casi nada en las células de F III. Se puede especular que las células de FIII eran mucho más inmaduras que las células de cualquier otra fracción (
P
& lt; 0,01)
5 La diferenciación inducida de células de cada fracción
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