Extracto
características genotípicas y fenotípicas distintivas del cáncer de ovario a través de la transición epitelio-mesenquimal (EMT) se han correlacionado con la resistencia a los medicamentos y la recurrencia de la enfermedad. Hemos investigado si la reversión terapéutica de la EMT podría volver a sensibilizar a las células de cáncer de ovario (OCC) a la quimioterapia existente. Nos informan de que epimorphin, una proteína morfogenética, tiene un control central sobre mesenquimales frente decisión linaje de células epiteliales de los OCC putativos. La exposición a epimorphin indujo cambios morfológicos que recuerda de mesenquimales-a-epitelial de transición (MET), pero de una manera dependiente de la dosis, es decir, a 10 mg /ml de las células epimorphin obtener una morfología más mesenquimales-como mientras que en 20 mg /ml de epimorphin las células muestran una morfología epitelial. Los últimos cambios fueron acompañados por supresión de los marcadores mesenquimales, como vimentina (↓ ~ 8 veces,
p Hotel & lt; 0,02), TWIST1 (~ 7 veces ↓,
p Hotel & lt; 0,03), distroglucano (~ 4 veces ↓,
p Restaurant & lt; 0,01) y Palladin (↓ ~ 3 veces,
p Hotel & lt; 0,01). Por el contrario, las elevaciones significativas de KLF4 (↑ ~28 veces,
p Hotel & lt; 0,002), β-catenina (~ 6 veces ↑,
p Hotel & lt; 0,004), EpCAM (~ 6 veces ↑,
p Hotel & lt; 0,0002) y ocludina (↑ ~ 15 veces,
p Hotel & lt; 0,004) ARNm como parte del compromiso con el linaje de células epiteliales se detectaron en respuesta a 20 mg /ml de epimorphin exógeno. Los cambios en los niveles de mRNA ocludina fueron acompañados por un paralelo, aunque más débil expresión a nivel de proteínas (~ 5 veces ↑,
p
& lt; 0,001). Del mismo modo, también se obtuvo adquisición de propiedades de tipo epitelial, incluyendo mucin1, CK19, y la expresión del gen β-catenina, después del tratamiento epimorphin. Además, se encontró que la producción de MMP3 que ser reducido mientras que la secreción de laminina fue fuertemente amplificada a MET epimorphin inducida. Estos resultados sugieren que hay una ventana de dosificación para acciones de epimorphin en la diferenciación celular, en el que se puede o bien suprimir o mejorar la diferenciación epitelial de OCC. Es importante destacar que, la inducción de fenotipos epiteliales-como por epimorphin condujo a una mayor sensibilidad al carboplatino. En general, se demuestra que se pueden revertir la epimorphin OCCs lejos de su fenotipo mesenquimal y hacia un fenotipo epitelial, mejorando de este modo su sensibilidad a un agente quimioterapéutico de primera línea
Visto:. Yew KH, Cuervo J, J Hirst, Pressetto Z, Godwin AK (2013) Epimorphin inducida por MET sensibiliza a las células del cáncer ovárico a Platinum. PLoS ONE 8 (9): e72637. doi: 10.1371 /journal.pone.0072637
Editor: Chunming Liu, de la Universidad de Kentucky, Estados Unidos de América
Recibido: Abril 10, 2013; Aceptado: 11 Julio 2013; Publicado: 9 de septiembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Yew et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El estudio fue apoyado en parte por una subvención para el proyecto de programa de Fondo de Investigación del cáncer de Ovario (http://www.ocrf.org), una subvención del programa Académico de Kansas Bioscience eminente autoridad, y una subvención del Instituto Nacional del cáncer (R01CA140323) de AKG Los autores también desean agradecer el apoyo de la Universidad de Kansas Centros de Cáncer (KUCC) (P30 CA168524) recursos compartidos y la Universidad de Kansas Asociación de Dotación. A.K.G es el Distinguido Presidente Cancilleres en Ciencias Biomédicas de KUCC. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer de ovario
epitelial (EOC) es una causa principal de muerte en las mujeres, a menudo debido al reconocimiento de la última etapa y la recaída del tumor agresivo. Alta morbilidad del paciente es atribuible en parte al crecimiento recurrente de células tumorales de ovario residuales que se vuelven resistentes a los tratamientos de quimioterapia estándar, y luego proliferan y se extienden de manera agresiva o metástasis en múltiples sitios. Estudios recientes han revelado que las células de cáncer de ovario con características epiteliales son de hecho más sensibles a los regímenes de quimioterapia, en comparación con las células tumorales con rasgos mesenquimales [1], [2], [36]. Sin embargo, cuando estas células se someten a-epitelial-mesenquimal transición (EMT), se vuelven menos sensibles a los regímenes terapéuticos convencionales [1] - [3], [36]. EMT, inducido por una amplia gama de estímulos y citoquinas, se ha convertido prominente implicado como un medio por el que diferencian EOC se someten a una conversión fenotípica que se asocia con la pérdida de las características epiteliales (por ejemplo, ocludina) y la adquisición de marcadores mesenquimales (por ejemplo, vimentina). Por lo tanto, la inversión de la EMT (es decir, MET) puede hacer que las células tumorales sean más susceptibles a los fármacos contra el cáncer de primera línea y potencia los efectos apoptóticos de ciertos agentes quimioterapéuticos.
Epimorphin, también conocido como sintaxina-2, es un importante mediador de numerosos procesos fundamentales en el desarrollo embrionario, y con frecuencia desempeñan un papel crucial en la región de las interacciones epitelio-mesénquima [4] - [8]. Estudios posteriores han demostrado también que epimorphin media patrón epitelial y morfogénesis en muchos tejidos, tales como conductos pancreáticos [5], la glándula mamaria [6], pulmón [7], y epitelio del intestino delgado [8]. Mientras epimorphin parece estar expresado en el ovario y testículo de los mamíferos [9], el mecanismo exacto por el cual este morfógeno mesenquimales ejerce su efecto regulador sobre las gónadas restos humanos en gran parte desconocido.
A pesar de que el receptor cognado epimorphin y su señalización corriente abajo mecanismo aún no han sido identificados, epimorphin se ha encontrado que se unen a alpha v receptores en las células epiteliales mamarias integrina [10] y receptores de EGF en las células epiteliales intestinales [11] que activan factores de transcripción proteína de unión a CCAAT /potenciador (C /EBP y β) [12], [15] y NF-kappa B [13]. Curiosamente, el factor de 4 (KLF4) krueppel-como, un factor de transcripción zinc-finger expresa en las células epiteliales de varios órganos [16], se ha demostrado que se unen directamente al promotor C /EBPb [17] e interactuar con NF-kB subunidad p65 [18], que regulan la diferenciación del epitelio pulmonar durante la organogénesis [19] y epiteliales mamarias de ramificación [20], respectivamente. Otras investigaciones han indicado que epimorphin puede inducir la morfogénesis epitelial mediante la regulación de activador de plasminógeno de tipo uroquinasa (uPA) [13], [14], así como involucrina y citoqueratina [15].
Dado el papel propuesto de epimorphin como una factor de pro-epitelial en diversos tejidos [5] - [8], se evaluó si epimorphin de señalización puede ser capaz de inducir las células de cáncer de ovario con rasgos mesenquimales hacia el linaje de células epiteliales y si esta conversión podría llevar a una mayor sensibilidad a los agentes de quimioterapia estándar .
Materiales y Métodos
Reactivos
suero bovino fetal, SYBR Green, tinte de referencia para la PCR cuantitativa, y de cóctel inhibidor de la proteasa se obtuvieron de Sigma-Aldrich (St. Louis , MO). Medio RPMI 1640 se obtuvo de Gibco /Invitrogen. RNeasy Mini Kit, Sensiscript® de la transcriptasa inversa Kit, Kit QIAamp DNA Micro, y Kit QIAquick Gel Extraction fueron todos adquiridos de Qiagen (Valencia, CA). AmpliTaq Gold con GeneAmp PCR Buffer 10X y MgCl
2 solución se obtuvieron de Applied Biosystems (Foster City, CA).
Cultivo celular y tratamiento
Las células de cáncer de ovario humano (OCC) , A1847, A2780 y OVCAR10 se han descrito anteriormente [21] y se utilizaron en todos los experimentos. Las células fueron cultivadas en medio RPMI-1640 suplementado con 10% (v /v) de suero de ternera fetal, 2 mM L-glutamina, 0,2 unidades /insulina humana ml, 50 unidades /ml de penicilina, 50 mg /ml de estreptomicina a 37 ° C bajo una condición humidificada de 95% de aire y 5% de CO
2. A1847 y A2780 se sembraron a una densidad de 5 × 10
4 células /ml en placas de 24 pocillos y se trataron con 10 mg /ml o 20 mg /ml de epimorphin (amp I +; D Systems, Minneapolis, MN) seguido de 3 días de incubación en medio que contiene suero al 1%.
SYBR Green real-Time PCR cuantitativa
ARN total fue extraído de OCCs epimorphin tratados y no tratados y se digirió con ADNasa. RNA fue sometido a transcripción inversa. entonces cDNA se amplificó utilizando un Bio-Rad CFX96 ™ (Hercules, CA) sistema de detección en tiempo real. A menos que se especifique lo contrario, cada mezcla de reacción contenía 10 veces más oro Buffer, 25 mM de MgCl
2, 2,5 mM dNTPs, 10 veces más SYBR Green, AmpliTaq Gold polimerasa, referencia Dye, dH
2O, plantilla de ADN y 10 M de cada cebador. La amplificación se realizó por la activación inicial de la polimerasa durante 10 minutos a 95 ° C, y 40 ciclos de desnaturalización a 95 ° C durante 15 s, hibridación a 60 ° C durante 20 s y elongación durante 30 segundos a 72 ° C (Tabla S1). El valor umbral de fluorescencia se calculó utilizando el software del sistema en tiempo real CFX96 ™. El cálculo de la variación relativa de los niveles de mRNA se realizó utilizando el método delta-delta [22], con la normalización para la limpieza de genes RPL13A.
fluorescencia de células activadas (FACS)
Epimorphin tratos y las células de cáncer de ovario no tratados se fijaron con paraformaldehído al 2% tamponada con fosfato durante 30 min a TA. Después de la fijación, las células se permeabilizaron con 1X FACS ™ permeabilización de Solución 2 (BD Biosciences, San Jose, CA) durante 30 min a RT, se bloquearon con albúmina de suero bovino durante 30 min y después se incubaron con el ratón FITC-conjugado anti-humano-EpCAM (BD Biosciences, San Jose, CA) y el ratón conjugado con FITC anti-humano-vimentina (Abcam, Cambridge, MA) en la oscuridad durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las células se enjuagaron con PBS y fluorescencia imágenes digitales fueron capturados utilizando BD Biosciences LSR II. software de BD FACSDiva ™ Versión 6 se aplicó a caracterizar y monitorear el desempeño de los citómetros. entonces el software FlowJo se utilizó para el análisis de citometría de flujo de datos. controles manchados individuales se utilizaron para establecer parámetros de compensación y muestras sin teñir utilizados para fijar puertas negativos.
Inmunoticción
Si no se trata y las células epimoprhin tratados cultivadas en cubreobjetos de placas de vidrio (Fisher Scientific, Pittsburgh , PA) a una densidad de 4 × 10
4 células se fijaron con etanol durante 30 min a 4 ° C. Después de la fijación, las células se permeabilizaron con (-20 ° C) acetona fría durante 3 minutos a temperatura ambiente, se bloquearon con 1% de albúmina de suero bovino durante 1 hora, y después se incubaron con β-catenina (L54E2) mAB de ratón (Alexa Fluor® 488 conjugado;. Cell Signaling Tech, Danvers, MA) en una cámara húmeda durante la noche a 4 ° C. Al día siguiente, las células se enjuagaron con PBS. Después de varios lavados, las células que contienen cubreobjetos se montaron en portaobjetos en Vectashield® medio de montaje con DAPI (Vector Labs, Inc, Burlingame, CA). Fluorescencia imágenes digitales fueron capturados utilizando un microscopio Nikon Eclipse 80
i
(Melville, NY) unido con un adaptador de cámara Nikon Q-imagen. MetaMorph software Image Analysis (versión 7.7.0.0) se utilizó para adquirir y analizar imágenes.
SDS-PAGE y análisis de transferencia Western
Las proteínas se separaron en un Tris-HCl Ready Gel 10% ( Bio-Rad, Hercules, CA), transferido a membranas de nitrocelulosa, y se incubó con anticuerpo monoclonal de ratón [ab6276] para ß-actina a una dilución de 1/5000, monoclonal de ratón [ab28081] a la mucina-1 a una dilución de 1/1000 , monoclonal de ratón [ab7754] para citoqueratina 19 (CK-19) a una dilución de 1/1000 o policlonal de conejo [ab31721] para ocludina a una dilución de 1/250 durante 2 horas a RT. Todos los anticuerpos de transferencia de Western se obtuvieron de Abcam (Cambridge, MA). Después de la incubación, las membranas se lavaron 3 veces durante 15 min en tampón de lavado (PBS-0,05% de Tween 20) y se incubaron con un anti-ratón secundario (β-actina, mucina-1, vimentina, palladin, y citoqueratina 19) o anti- conejo (ocludina) anticuerpo acoplado a peroxidasa de rábano picante (vector Labs, Burlingame, CA) durante 1 hora a RT. A continuación, las membranas se lavaron 3 veces durante 15 min en tampón de lavado, y la inmunorreactividad se normalizó por quimioluminiscencia (Amersham, ECL + Plus Kit) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las membranas se expusieron a películas de formación de imágenes científicas Kodak (Rochester, NY) dentro de 1 min para la detección. densidades de píxeles de imágenes de transferencia se calcularon utilizando software Image-J (NIH). Los cambios en los niveles de proteína se normalizaron a los controles y se expresaron como factor de cambio en relación con los controles.
Medición de citoquinas
A la pantalla de la secreción de matriz extracelular inducida por epimorphin, A1847 OCC (4 × 10
4 células /ml en placas de 24 pocillos) con medio solo (control negativo), 10 mg /ml o 20 mg /ml de epimorphin durante 3 días. La laminina (Millipore, Temecula, CA) y MMP3 (R & amp; D Systems, Minneapolis, MN) secreción en los sobrenadantes de cultivo se midieron por ELISA tipo sándwich de acuerdo con el protocolo de los fabricantes. Los puntos de datos se expresan como la concentración media de ensayos por duplicado a 450 nm
Tratamientos farmacológicos, la viabilidad celular Ensayo y nexina muerte celular de Ensayo
A1847, A2780 & amp.; OVCAR10 se sembraron a una densidad de 2 × 10
4 células /ml en placas de 48 pocillos y se cultivaron con epimorphin a una concentración de 20 mg /ml durante 3 días. Epimorphin tratados y no tratados células fueron cultivadas con una dosis de carboplatino en serie (Selleck Chemicals, Houston, TX, EE.UU.) durante 3 días adicionales. rango de dosis Carboplatino para epimorphin-tratadas y no tratadas fueron A1847 1 M, 10 mM, 50 mM, 100 mM, 200 mM, y 400 mM. rango de dosis Carboplatino para epimorphin-tratadas y no tratadas fueron A2780 1 M, 10 mM, 50 mM, 100 mM, 150 mM, y 200 mM. intervalo de dosis de carboplatino para epimorphin-tratada y no tratada OVCAR10 fueron de 50 mM, 100 mM, 150 mM, 200 mM, 400 mM y 500 mM. La viabilidad celular se determinó midiendo la actividad metabólica usando CellTiter-Blue® por Promega y las placas se captación de imagen sobre la Tecan fluorómetro. Los datos se normalizaron luego a porcentaje de inhibición e IC
50 concentraciones de carboplatino se determinaron para epimorphin tratadas y las células no tratadas por el programa de gráficos SigmaPlot (Systat Software). La muerte celular o apoptosis se cuantificó usando el ensayo de guayaba nexina Anexina V a través de un flujo de guayaba EasyCyte HT citómetro (Guava Technologies, Hayward, CA). El ensayo nexina utiliza dos colorantes: 7-AAD, un colorante impermeable celular, como un indicador de la integridad estructural de la membrana y Anexina V-PE para detectar la fosfatidilserina en la membrana externa de las células apoptóticas. Las muestras se prepararon según las especificaciones del fabricante. Los datos se normalizaron a los controles y se representan como medias ± S. D.
Análisis estadístico
Los datos fueron analizados utilizando el Microsoft Office Excel 2010 y expresados como medias ± S. D. donde corresponda. Dos comparaciones de grupos se evaluaron mediante la prueba t de Student no pareado. Los valores de p & lt; 0,05. Se consideraron estadísticamente significativos
Resultados
Efectos morfológicos y moleculares de Epimorphin Asociados con el MET en células de cáncer de ovario
Trabajos previos han implicado como mediadores de epimorphin morfogénesis epitelial en varios órganos y células [4] - [13]. Sin embargo, se sabe poco sobre el mecanismo por el cual epimorphin mediar tales efectos en las células de cáncer de ovario. Nos primero utilizó un kit de ELISA para comparar los niveles de epimorphin en varias líneas celulares de cáncer de ovario con células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo que se utilizaron como controles positivos. La producción epimorphin endógena fue relativamente baja (intervalo: desde 0,1 hasta 0,3 ng /ml) en todas las líneas celulares de cáncer de ovario ensayados en comparación con las células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo (rango: 10 a 12 ng /ml) (datos no mostrados). Esto nos permitió determinar el momento óptimo y la dosis del tratamiento para inducir epimorphin MET en la línea celular de cáncer de ovario, A2780. Estudios recientes han demostrado que 20 ug /ml de epimorphin fue capaz de activar MEK-ERK1 /2 vía (11) e inducir la diferenciación de MMPs (13). Para evaluar la respuesta dependiente de la dosis en células de cáncer de ovario, se realizó primero un amplio dosis-respuesta (de 2 a 20 ug /ml) de epimorphin utilizando células A2780. Nos encontramos después de 3 días a 20 mg /ml de epimorphin, las células A2780 sufrieron cambios morfológicos significativos (de mesenquimal a epitelial) tal como se analizó mediante microscopía óptica de contraste de fases, inmunotransferencia y cuantitativa en tiempo real RT-PCR, mientras que 2 ug /ml de epimorphin no suscitó respuestas celulares (datos no mostrados). Seguidamente, evaluó la dosis óptima de epimorphin y encontró que tanto A2780 y A1847 tratados con la dosis más baja (10 mg /ml) de epimorphin exhibió una más estrelladas y alargada apariencia mesenquimales-como (Fig 1B & amp;. 1E). En comparación, la dosis más alta (20 mg /ml) conduce a una más redondeada epitelial-como en forma de como se visualiza por contraste de fase examen microscópico (Fig 1C & amp;. 1F). Estos resultados sugieren un efecto bifásico de epimorphin y una ventana de dosificación estrecho para revertir de manera óptima células mesenquimales a una morfología más epitelial. Además, hemos eliminado el epimorphin exógeno mediante la sustitución del cultivo de células con medio fresco a MET epimorphin inducida por una incubación adicional de 3 días. El epimorphin inducida por MET de las células de cáncer de ovario se mantuvo fenotipo epitelial tal como se analizó por un microscopio de luz de contraste de fase y PCR en tiempo real cuantitativa (datos no mostrados). Para analizar más a fondo la naturaleza de este efecto, hemos medido los niveles de alpha v-integrina, un "receptor epimorphin" en A1847 y se encontró que los niveles de estado estacionario de alpha v-integrina eran bajos, pero fueron inducidos de 9 veces en 20 mg /ml epimorphin (Fig. 2A). De manera similar a los niveles del receptor alpha v-integrina, los mediadores abajo, por ejemplo, factores de transcripción C /EBPb (↑ ~ 9 veces,
p Hotel & lt; 0,056) (Fig. 2B) y KLF4 (~28 veces ↑ ,
p
. & lt; 0,002) (figura 2C), se encontraron significativamente elevados, lo que sugiere que el C /EBPb y KLF4 pueden ser los principales reguladores de epimorphin mediada MET. Del mismo modo, los niveles de ARNm de β-catenina (↑ ~ 6 veces,
p Hotel & lt; 0,004) (Fig. 2D), ocludina (↑ ~ 15 veces,
p Hotel & lt; 0,004 ) (figura 2E) y EpCAM (↑ ~ 6 veces,
p Hotel & lt;.. 0,0002) (figura 2F) se comprobó que estaban fuertemente upregulated en la dosis más alta de epimorphin, indicando de nuevo que apoya la conversión a una epitelial fenotipo. Los marcadores moleculares de fenotipo mesenquimal, tales como TWIST1 (Fig. 2G), vimentina (Fig. 2H), distroglicano (Fig. 2I) y palladin (Fig. 2J), fueron suprimidos por 20 g /epimorphin ml pero aumentó significativamente tras la estimulación de A1847 con una dosis más baja de epimorphin, lo que implica que el cambio entre mesenquimales y epiteliales fenotipos es probable que sea dependiente de la dosis.
A2780 y A1847 se incubaron con 10 mg /ml o 20 mg /ml de epimorphin para 3 días. A-F: Epimorphin (20 mg /ml) indujo un adoquín redondeada, la apariencia epitelial-como en tanto A2780 (C) y A1847 (F). En comparación, epimorphin a 10 mg /ml conducir a una morfología más alargada mesenquimales tanto en A2780 (B) y A1847 (E) en comparación con controles no tratados (A & amp; D). Las imágenes de la morfología celular fueron capturados en un aumento de 10X, con al menos 3 imágenes por pocillo, utilizando un microscopio de contraste de fase vertical (T3.15A; Fisher Scientific) guía empresas
A y B:.-Alpha v integrina receptor (a) y C /EBPb (B) mostraron una marcada elevación de los niveles de ARNm en respuesta a 20 mg /ml de epimorphin. C-F: marcadores epiteliales, tales como KLF4 (C), β-catenina (D), ocludina (E), y EpCAM (F) se encontraron para ser upregulated por exógenos 20 mg /ml de epimorphin. G-J: Expresión de marcadores mesenquimales TWIST1 (G), vimentina (H), distroglicano (I) y palladin (J) se downregulated después del tratamiento con epimorphin (20 mg /ml). Sin embargo, se encontró que los cuatro marcadores mesenquimales (G-J) para ser upregulated de 10 mg /ml de epimorphin (medias ± SD, n = 3) [*
p Hotel & lt; 0,05 en comparación con el control].
se realizaron efectos de epimorphin en los fenotipos de expresión génica en A1847
en un esfuerzo por confirmar aún más los efectos inductivos de epimorphin sobre las modificaciones fenotípicas, inmunotransferencia y ELISA para determinar el perfil de expresión de la proteína ambos marcadores epiteliales y mesenquimales. El análisis cuantitativo de proteína ocludina en A1847 mostró que el tratamiento con epimorphin-dosis mayor aumento de la expresión de ocludina por cinco pliegues (Fig. 3) en comparación con no tratados, de acuerdo con el resultado observado con los niveles de mRNA (Fig. 2E). Del mismo modo, se obtuvieron aumentos similares para CK-19 y mucina-1 (Fig. 3), de nuevo lo que implica que A1847 epimorphin tratados se someten a cambios fenotípicos asociados con MET. Sin embargo, la expresión de los genes mesenquimales, palladin y vimentina (Figura S1) se incrementó en 1 y 2 veces, respectivamente, en el A1847 tratado con 10 mg /ml epimorphin, una vez más lo que sugiere que la inducción de la EMT o Met en respuesta a epimorphin es bidireccional, dependiendo de la dosis aplicada. A continuación realizó ELISA para determinar la liberación de proteínas asociadas con fenotipos epiteliales y mesenquimales. Curiosamente, la secreción de la laminina (Fig. 4A), una glicoproteína extracelular esencial para el desarrollo de la polaridad celular epitelial, se encontró que estaba significativamente elevado en el tratamiento de A1847 con epimorphin. A la inversa, la producción de MMP 3 (Fig. 4B), un marcador mesenquimal importante para la invasión de células de cáncer y la migración, se encontró que estaba disminuido después de /mL tratamiento epimorphin 20 mg pero fuertemente upregulated a 10 mg /ml. Tomados en conjunto, estos datos demuestran que existe un compromiso progresiva de las células tumorales de ovario hacia un linaje epitelial cuando se cultivan con una dosis suficiente de epimorphin.
expresión de la proteína de los marcadores epiteliales asociadas, por ejemplo, mucina-1, CK -19 y ocludina fueron evaluados por inmunotransferencia y las densidades de la banda fueron cuantificados por el software Image-J. Doblar aumentos en la expresión de proteínas de tratar (20 mg /ml epimorphin) frente A1847 sin tratar: aumento de 2,5 veces para CK-19; aumento de 1,5 veces para mucina-1, y el aumento de 4,5 veces para ocludina. β-actina sirvió como control de carga. (Medias ± pm DE, n = 3). [*
p Hotel & lt; 0,05 en comparación con el control]
La secreción de laminina (marcador epitelial) y MMP-3 (mesenquimales marcador) fue medida por ELISA después del tratamiento de cáncer de ovario A1847. las células de cáncer con epimorphin durante 3 días (a 10 o 20 g /ml). La exposición a epimorphin (/ml 20 g) aumentó significativamente la producción de laminina y dar lugar a una disminución de la secreción de MMP-3 en comparación con el control. En comparación, la liberación de MMP-3 se mejoró cuando A1847 tratado con la concentración más baja de epimorphin (10 g /ml), sugiriendo de nuevo epimorphin puede inducir cambios fenotípicos en las células de cáncer de ovario en una forma dependiente de la dosis (media ± SD, n = 3 ) [*
p Hotel & lt; 0,05 en comparación con el control]
epitelial diferenciación en respuesta a exógenos Epimorphin
β-catenina, un factor clave en la Wnt. vía de señalización, se ha demostrado para determinar el destino de las células epiteliales durante el desarrollo embrionario del ovario [23]. La pérdida de la β-catenina tarde en el desarrollo embrionario como resultado profundos defectos en la maduración epitelial en la edad adulta [24]. Para investigar más si la MET epimorphin mediada se asocia con aumento de la expresión endógena de β-catenina, se utilizó la inmunotinción para β-catenina para evaluar la diferenciación de células epiteliales de A1847 epimorphin tratados. Tanto A1847 sin tratar y OVCAR10 tenían pocas células β-catenina-positiva; pero mostró expansión prominente de la región en y alrededor de las uniones célula-célula, más notablemente en epimorphin tratados con A1847 y OVCAR10 (Fig. 5). Un aumento en las células β-catenina-positivo visto en A1847 epimorphin-tratada y OVCAR10 representado una forma de dosis-respuesta de estas células a 20 mg /ml epimorphin. Esta evidencia experimental apunta a un papel para epimorphin de señalización en la inducción de la diferenciación de β-catenina, que puede ser un determinante importante del compromiso de linaje epitelial en las células tumorales de ovario. Además, el análisis FACS identificó un sub-fracción de células A1847 con EpCAM regulada al alza (marcador epitelial) y downregulated vimentina (marcador mesenquimal) después del tratamiento con 20 mg /ml epimorphin (Figura S2 & amp; S3).
Si no se trata, y A1847 20 mg /ml epimorphin-tratada y OVCAR10 se analizaron para β-catenina, un marcador de la diferenciación epitelial, por inmunotinción. β-catenina (verde), DAPI (azul) y fusionar (verde de neón) en A1847 sin tratar (A-C) y OVCAR10 (G-I); A1847 tratado con epimorphin (D-F) y OVCAR10 (J-L). análisis de inmunotinción mostró un incremento en la expresión de las células β-catenina-positivo en la A1847 tratado con epimorphin (D & amp; F) y epimorphin-tratada OVCAR10 (J & amp; L). Había células positivas abundante β-catenina en y alrededor de las uniones célula-célula de A1847 epimorphin inducida y OVCAR10 (F & amp; L) en comparación con los controles sin tratar (C & amp; I).
Viabilidad de las células y anexina-V Actividad durante la apoptosis inducida por carboplatino en OCCs tratados con Epimorphin
para determinar si el carboplatino puede matar preferentemente a las células de cáncer de ovario con más morfologías de tipo epitelial, se comparó la capacidad de carboplatino para inducir la muerte celular después epimorphin- tratamiento. Como se muestra en la Figura 6, el plomo exposición carboplatino a una disminución significativa en el número de células viables después de epimorphin inducida MET para A1847 (
p
= 0,005) (Fig. 6A) y A2780 (
p
= 0,007) (Fig. 6B) en comparación con los controles. Aunque la tendencia fue similar, el cambio en la sensibilidad a OVCAR10 (Fig. 6C) con o sin epimorphin no fue estadísticamente diferente (
p
= 0,170), posiblemente debido a la falta de escala de dosis en el extremo superior de el rango para el trazado y el modelado de los datos de respuesta. se utilizó marcado con fluorocromo Anexina V para identificar las células apoptóticas [25], [26]. Como se muestra en la Figura 6D-6F, se observó la inducción de la apoptosis en los tres OCCs epimorphin tratados, incluyendo la línea celular resistente a carboplatino más, OVCAR10 en comparación con los no tratados OCC. El porcentaje de células apoptóticas aumentó en células epimorphin tratadas con concentraciones crecientes de carboplatino (Fig. 6D-6F). Estos resultados sugieren que los OCC con características mesenquimales se vuelven más sensibles a la apoptosis inducida por carboplatino después epimorphin asociados diferenciado a un estado de tipo epitelial. Es importante destacar que, cuando se evalúa con 10 mg /ml de epimorphin, que no consigue inducida MET, las tres líneas celulares de cáncer de ovario evaluados (es decir, A1847, A2780 y OVCAR10) mostraron una mayor resistencia a carboplatino, medido por CellTiter® azul (figura S4). Estos resultados ponen de manifiesto que la inversión de la EMT puede servir para ayudar aún más a sensibilizar a la enfermedad recurrente a las terapias de primera línea. Desde la proliferación celular elevada podría afectar dramáticamente la resistencia y platino carboplatino drogas dañan las células sólo durante la fase S del ciclo celular, el recuento de células usando un hemocitómetro manuales se han realizado para controlar la proliferación al final del cultivo. Poco o ningún cambio en las tasas de crecimiento de las células se observó para epimorphin tratados en comparación con los no tratados OCC (datos no mostrados)
AF:. A1847, A2780 y OVCAR10 fueron tratados con 20 mg /ml para epimorphin 3 días. Después de 3 días, tratadas epimorphin y OCC sin tratar se cultivaron por triplicado con dosis de serie de carboplatino durante 3 días adicionales. La viabilidad celular se cuantificó usando un ensayo CellTiter Blue® (A-C). La apoptosis se cuantificó utilizando un ensayo de guayaba nexina (D-F). A-C: IC
50 valores indican inducida por la pérdida de la viabilidad celular más carboplatino en los tres OCCs epimophin tratados que en los controles no tratados en una forma dependiente de la dosis. D-F: La detección de las respuestas de apoptosis se encontró para aumentar en los tres OCCs epimorphin tratadas con concentraciones crecientes de cisplatino en comparación con los de los controles no tratados. Los datos se normalizaron a los controles y se representan como medias ± S.D. [*
p Hotel & lt; 0,05 en comparación con el control]. Imágenes de células apoptóticas fueron capturados en un aumento de 10X, con al menos 3 imágenes por pocillo, utilizando un microscopio vertical de contraste de fase. (T3.15A; Fisher Scientific) guía empresas
Discusión
la creciente evidencia apoya el papel fundamental de la EMT en la orquestación de la embriogénesis, la regeneración de tejidos y metástasis del cáncer [1] - [3], [16], [27], [30] - [35]. alteración genética y morfológicas cambios son modulados durante la metástasis del cáncer, tales como la pérdida de la identidad de células epiteliales (por ejemplo, ocludina y EpCAM) y la adquisición de características mesenquimales (por ejemplo, vimentina y TWIST1) [1] - [3], [27]. En el desarrollo, la EMT y el proceso inverso, MET son un mecanismo esencial en la regulación de la plasticidad fenotípica que se caracteriza por los eventos celulares y moleculares implicados en la interconversión entre el epitelio y el mesénquima embrionario durante el montaje y remodelación. Sin embargo, en el cáncer, la plasticidad fenotípica podría afectar a la progresión tumoral y la eficacia del fármaco manteniendo la mesenquimal, fenotipo invasivo de las células tumorales que han sido sometidos a EMT en respuesta a una amplia gama de estímulos extracelulares o derivados de crecimiento.
ovárico epitelial primaria cánceres son en su mayor parte exquisitamente sensibles a las terapias a base de platino. Por otra parte, la enfermedad recurrente responde con frecuencia para rondas adicionales de quimioterapia; Sin embargo, el intervalo libre de progresión se hace más corto después de cada ciclo, a medida que aumenta la quimio-resistencia hasta que la enfermedad se vuelve incurable. Los mecanismos que conducen a la resistencia a los medicamentos son complejos; sin embargo, estudios recientes sugieren que EMT está estrechamente asociada con la respuesta al tratamiento y la supervivencia libre global o la progresión. Se cree que los factores intrínsecos derivados del microambiente tumoral inducen OCCs epiteliales que someterse profunda conversión fenotípica de epitelial (forma redonda) para mesenquimales (en forma de huso) morfología consistente con EMT [16], [27], [30] - [ ,,,0],35]. Estudios recientes han revelado que los OCC con características epiteliales son más sensibles a los regímenes de quimioterapia, en comparación con las células tumorales mesenquimales [1], [2]. Sin embargo, los OCCs epiteliales sometidos a EMT es probable que induzcan resistencia adquirida y se convierten en no responde a los tratamientos con fármacos convencionales [1] - [3], [35]. Por lo tanto, la hipótesis de que la inversión de la EMT fenotipo podría ayudar a superar la resistencia de platino-asociado.
Pocas estrategias se han utilizado para promover la conversión de las células cancerosas mesenquimales hacia un fenotipo más de tipo epitelial tal como se caracteriza por la pérdida de mesenquimales rasgos fenotípicos y la adquisición de marcadores epiteliales [28] - [30]. Park y colegas [28] han demostrado que ectópicos microRNAs expresión (miRNAs), como miR-200, pueden conducir a la regulación de la E-cadherina en líneas celulares de cáncer y la reducción de la motilidad a través de la orientación de los represores de la transcripción de cadherina E,
ZEB2 gratis (1 [SIP1] /ZFXH1B proteínas Smad-interactuando) transcripciones ZEB1 gratis (TCF8 /δEF1) y. También informaron de una correlación significativa entre la E-cadherina y la expresión de miR-200 en dos conjuntos de muestras de pacientes derivadas de cáncer primario de ovario seroso papilar [28]. Resultados similares han sido reportados cuando el miR-429 se sobreexpresa en células de cáncer de ovario metastásico [29].