Extracto
Estamos aquí evaluó el potencial actividad anti-cáncer colorrectal en un erastin, un canal de aniones dependiente de voltaje ( VDAC) compuesto -vinculante. Nuestro
in vitro
estudios mostraron que erastin ejerce potentes efectos citotóxicos contra múltiples líneas celulares de cáncer colorrectal humano, posiblemente a través de la inducción de estrés oxidativo y la apoptosis celular dependiente de caspasa-9. Además, se observó la apertura mitocondrial poro de transición de permeabilidad (MPTP) en las células cancerosas tratadas con erastin, que se evidenció por VDAC-1 y D-ciclofilina (CYP-D) asociación, la despolarización mitocondrial y la liberación del citocromo C. Los inhibidores de caspasa, el eliminador de ROS MnTBAP, y bloqueadores de MPTP (sanglifehrin A, ciclosporina A y el ácido bongkrékico), así como la precipitación mediada por shRNA de VDAC-1, todos significativamente atenuada citotoxicidad erastin inducida y la apoptosis en células de cáncer colorrectal. Por otra parte, la sobre expresión de VDAC-1 aumentada producción erastin inducida por ROS, la apertura de MPTP, y la apoptosis de células de cáncer colorrectal.
in vivo
estudios demostraron que la inyección intraperitoneal de dosis a erastin bien tolerado-HT-29 el crecimiento de xenoinjertos drásticamente inhibida en ratones inmunodeficientes combinada severa (SCID). En conjunto, estos resultados demuestran que erastin es citotóxico y pro-apoptótica a células de cáncer colorrectal. Erastin puede investigarse más a fondo como un nuevo agente anti-cáncer colorrectal
Visto:. Huo H, Z Zhou, Qin J, Liu W, Wang B, Gu Y (2016) Erastin Interrumpe mitocondrial permeabilidad del poro de transición (MPTP ) e induce la muerte apoptótica de las células del cáncer colorrectal. PLoS ONE 11 (5): e0154605. doi: 10.1371 /journal.pone.0154605
Editor: Cong Cao, Universidad de Suzhou, China
Recibido: 23 Marzo de 2016; Aceptado: 16 Abril de 2016; Publicado: 12 de mayo de 2016
Derechos de Autor © 2016 Huo et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos están dentro del papel
Financiación:. Este estudio fue apoyado por la Fundación de Ciencias del hospital de la IX personas afiliadas a Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (N ° 2.015.521, de YG). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal es el principal contribuyente de la mortalidad relacionada con el cáncer tanto en china [1] y en todo el mundo [2,3]. Se estima que más de 100.000 nuevos casos de cáncer colorrectal son diagnosticados cada año, lo que causa más de 50.000 muertes al año [4]. La quimioterapia ha sido ampliamente utilizado para el tratamiento del cáncer colorrectal, sin embargo resistencia a los medicamentos y /o toxicidad fuera del objetivo limitar la eficacia de los fármacos actuales quimio-[5,6,7]. Por lo tanto, nuestro grupo [8,9] y otros [10,11] se han centrado en el desarrollo de nuevos y agentes anti-cáncer colorrectal más eficientes.
mitocondrial poro de transición de permeabilidad (MPTP) es un multi- complejo de proteína de canal situada en la mitocondria, cuya función principal es la de mantener el equilibrio de la cadena respiratoria mitocondrial [12]. MPTP se compone principalmente de tres proteínas: incluyendo dependiente de voltaje del canal de aniones (VDAC) en la membrana mitocondrial a cabo (OMM), la adenina nucleótido translocasa de 1 (ANT-1) en la membrana mitocondrial interna (IMM) y la matriz de la localización de la ciclofilina-D ( Cyp-D) [12]. Se ha demostrado que varios estímulos inducirán ANT-1 y Cyp-D asociación y la apertura de MPTP, lo que conduce a especies de oxígeno reactivas (ROS) de producción, el agotamiento de ATP y moléculas pro-apoptóticas (
i
.
e
. citocromo c) la liberación [12,13]. se activarán a partir de entonces, las caspasas (principalmente la caspasa-9) y la apoptosis celular [12,13].
Los estudios recientes han identificado una primera en su clase VDAC de unión de moléculas pequeñas, a saber erastin [14,15] . Se ha demostrado que erastin es selectivamente citotóxica para ciertas líneas celulares de cáncer [14,15,16,17]. Por ejemplo, Yagoda et al., Demostró que se une a erastin VDAC, lo que resulta en el daño oxidativo letal para las células del cáncer [18]. El papel potencial de erastin en células de cáncer colorrectal, y los mecanismos de señalización subyacentes no se han estudiado. En el presente estudio, mostramos que erastin era citotóxica y pro-apoptótica de las células del cáncer colorrectal, posiblemente a través de la interrupción de MPTP.
Materiales y Métodos
2.1. Cultivo de células
Tal como se describe [8,9], las líneas celulares de cáncer colorrectal, incluyendo HT-29, DLD-1 y Caco-2, fueron adquiridos de banco de células de la Academia China de Ciencias (CAS) Shanghai Biológica Instituto (Shanghai, china). Las células se mantuvieron en FBS que contiene medio RPMI /DMEM. línea de células epiteliales de colon humano NCM460 fue proporcionada por el centro de la célula de Fudan IBS (Shanghai, China). Las células se cultivaron en medio F12 de nutrientes de Ham (Gibco) [19].
2,2. Reactivos y productos químicos
Erastin se adquirió de Selleck (Shanghai, China). Los bloqueadores de MPTP incluyendo sanglifehrin A, ciclosporina A y el ácido bongkrékico se adquirieron de Sigma (Shanghai, China). El anti-oxidante MnTBAP también era de Sigma. El inhibidor específico z-DEVD-fmk de la caspasa-3 y el inhibidor específico z-LEHD-fmk de la caspasa-9 se adquirieron de Calbiochem (Darmstadt, Alemania). Todos los anticuerpos utilizados en este estudio se obtuvieron de Santa Cruz Biotech (Shanghai, China).
2,3. la viabilidad celular ensayo
La supervivencia celular MTT se midió por el ensayo de 3- [4,5-dimethylthylthiazol-2-il] -2,5 difeniltetrazolio (MTT, Sigma) [9]. Diferentes densidades de siembra se optimizaron en el comienzo de los experimentos.
2,4. El azul tripán tinción ensayo
análisis con azul
tripano fue descrito en nuestros estudios anteriores [9]. En pocas palabras, después de aplicado el tratamiento erastin, el número de células muertas (azul de tripano positivos) fue contado. La relación de la muerte (%) se calculó por el número de las células teñidas con azul de tripano dividido por el número total de las células.
2,5. Colonia ensayo de formación de
Después del tratamiento erastin, las células (2 × 10
3) se suspendieron inicialmente en medio de cultivo con agar% 0,25 (Sigma). A continuación, la suspensión celular se planked en la parte superior de un 0,25% de agar pre-solidificado en una placa de cultivo de 100 mm. El medio se sustituyó cada dos días. Después de 10 días de incubación, las colonias se tiñeron de supervivencia y de forma manual contado.
2.6. BrdU ensayo de incorporación de
Las células (3 × 10
3 por pocillo) se sembraron en placas de 96 pocillos, después de tratamiento aplicado, la proliferación celular se evaluó a través de la incorporación de BrdU ELISA ensayo colorimétrico (Roche, Indianapolis, IN ) con el protocolo del fabricante. El valor ELISA OD de grupo de tratamiento se normalizó a la de grupo de control sin tratar.
2,7. ensayo de apoptosis celular a través de Anexina V tinción
Después del tratamiento, la apoptosis celular se detectó mediante el ensayo de anexina V FACS como se informó anteriormente [9]. Se registró el número de células teñidas con anexina V.
2.8. La cuantificación de la apoptosis mediante el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA)
Como se describe [8,9], la apoptosis de las células de ELISA de Detección Kit Plus (Roche, Palo Alto, CA) se utilizó para cuantificar la apoptosis de células de acuerdo con la el protocolo del fabricante.
2.9. ensayo de la actividad de caspasa
Después del tratamiento, las proteínas citosólicas se extrajeron en el tampón descrito [8,9]. Veinte g de extractos citosólicos por muestra se añadieron a tampón de ensayo de caspasa con sustratos de la caspasa-3 /-8 /-9 (Roche, Shanghai, China). La liberación de 7-amido-4- cumarina (trifluorometil) (AFC) se cuantificó a través de un sistema de Fluoroskan ajustado a un valor de excitación de 355 nm [8,9]. Los resultados se expresaron como unidades de fluorescencia relativa /g de proteína.
2,10. Western Blot
Brevemente, las alícuotas de 30 g de proteínas de lisados de cada muestra se separaron por electroforesis en gel de poliacrilamida SDS al 10% y se transfirieron a membranas de PVDF (Millipore, Bedford, MA). Después del bloqueo, las membranas se incubaron con el anticuerpo primario durante la noche a 4 ° C, seguido de incubación con el anticuerpo secundario durante una hora a temperatura ambiente. El perno se visualizó mediante ECL máquina (aumento de quimioluminiscencia). Cada banda se cuantificó mediante el software ImageJ, y el valor se normalizó a cada banda de control de carga.
2.11. especies reactivas de oxígeno (ROS) de detección
intracelular de ROS se midió por citometría de flujo a través de ensayo de oxidación de dichlorofluorescin (DCF). DCFH-DA entra pasivamente en las células y se escinde por esterasas celulares inespecíficas y se oxida en presencia de ROS. Después del tratamiento, las células (3 × 10
5 por muestra) se incubaron con DCFH-DA (5 mM) durante una hora a 37 ° C. Posteriormente, las células se lavaron con PBS y se mantuvieron en 1 ml de PBS, ROS fluorescencia se analizó utilizando el sistema Fluoroskan anteriormente.
2,12. La detección de la reducción potencial mitocondrial (ΔΨ
m)
Tal como se describe [20], el ΔΨ
m se midió a través de JC-10 colorante fluorescente. Cuando el potencial mitocondrial está disminuyendo, monomérico JC-10 se forma en el citosol, que exhibe fluorescencia verde [20]. Brevemente, el tratamiento erastin después de aplicado, las células se tiñeron con 5 mg /ml de JC-10 (Invitrogen) durante 10 min, y se detecta inmediatamente en un sistema Fluoroskan ajustado a un valor de excitación de 485 nm [20].
2,13. inmunoprecipitación mitocondrial (mito-IP) guía
Las células se trataron con tripsina, y se prepararon fracciones mitocondriales a través de un kit de mitocondrias /citosol Fraccionamiento (Biovision, Shanghai, China) según las instrucciones del fabricante. Doscientos mg de lisados celulares de fracciones mitocondriales fueron pre-aclaró con 20 l de proteína A /G PLUS-agarosa (Santa Cruz) durante 1 hora. El sobrenadante se hizo girar durante la noche con 0.25 g de anti-ANT-1 (Santa Cruz Biotech). A continuación, los lisados se centrifugaron durante 5 min a 4 ° C en un micro-centrífuga para eliminar los agregados no específicos. La proteína A /G PLUS-agarosa (35 l) se añadió a los sobrenadantes durante 4 horas a 4 ° C. Los sedimentos se lavaron seis veces con PBS, se resuspendieron en tampón de lisis, y luego analizaron por Western Blot [20].
2,14. caída estable de VDAC-1 por lentiviral shRNA
Los dos conjuntos de VDAC-1 ARN de horquilla corta lentivirus-envasados (shRNA-1 y shRNA-2, las secuencias que no se solapan) fueron diseñados, sintetizados y verificados por Genechem (Shanghai, China). Ten l /ml de partículas lentivirales se añadieron a las células HT-29 durante 12 horas. Después, el medio que contiene lentivirus se reemplazó por medio completo, y se cultivaron las células durante otras 24 horas. Después, se añadió puromicina (5,0 mg /ml, Sigma) para seleccionar colonias resistentes de forma estable durante 2-3 semanas. Expresión de VDAC-1 se detectó mediante transferencia Western. Las células de control se trataron con lucha sin sentido shRNA partículas lentiviral (Santa Cruz Biotech).
2.15 La sobreexpresión de VDAC-1 y de forma estable células selección
El humano de longitud completa VDAC-1 ADNc, comprado a Genechem (Shanghai, china), fue sub-clonado en pSuper-puro-bandera (un regalo del laboratorio del Dr. Bi) [21]. El vector vacío (pSuper-puro-flag) o VDAC-1 construcción que expresa se transfectó en HT 29 células a través de Lipofectamine 2000 protocolo (Invitrogen). Los clones se seleccionaron de manera estable a través de puromicina (5 mg /ml). Después de 12-14 días de selección, de forma estable las células se sometieron a ensayo de Western Blot de VDAC-1 de expresión.
2,16.
in vivo se realizaron en
eficacia antitumoral de evaluación
estudios de crecimiento tumoral en ratones modelo de xenoinjerto de inmunodeficiencia combinada severa (SCID). Todos los ratones fueron adquiridos de la Animalario de Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (Shanghai, China). Brevemente, 2 × 10
6 HT 29-viables células en 100 l de medio de crecimiento (por ratón) se inocularon por vía subcutánea, y ratones portadores de ~ 100 mm
3 tumores se dividieron aleatoriamente en tres grupos con 10 ratones por grupo . Los ratones fueron tratados diariamente con 10 o 30 mg /kg de peso corporal de erastin (inyección intraperitoneal, durante 4 semanas) o control de vehículo (solución salina). Los volúmenes tumorales se calcularon mediante la fórmula modificada elipsoide: (π /6) x AB
2, donde A es la más larga y B es el eje perpendicular más corto de una masa tumoral [22,23]. pesos corporales Los ratones también se registraron cada semana. puntos finales siempre se utilizaron para minimizar el sufrimiento ratones. Los animales fueron observados en bases diarias. Se registraron; signos como la locomoción significativa reducción, diarrea severa, piloerección severo o pérdida súbita de peso (20% & gt). Si los animales llegaron a estos criterios de valoración que se sacrificaron por desangrado bajo anestesia 2,2,2-tribromoetanol (4 mg /10 g de peso corporal, Sigma). Todas las inyecciones se realizaron por el método de anestesia 2,2,2-tribromoetanol. Los estudios en animales han sido aprobados por la Jiao Tong-School Shanghai Universidad de Comité Institucional de Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC) y Ética de Medicina (Persona de contacto: Dr. Jun Wang, 2014126).
2,17. El análisis estadístico
Todos los datos se normalizaron a los valores de control de cada ensayo y se presentan como media ± desviación estándar (SD). Los datos fueron analizados por ANOVA de una vía seguido de la prueba F de Scheffe utilizando el software SPSS 16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). Importancia fue elegido como p & lt; 0.05.
Resultados
3.1. Erastin ejerce citotóxico, pero no los efectos citostáticos a células de cáncer colorrectal cultivadas
Para probar la actividad de erastin sobre la supervivencia celular de cáncer colorrectal, las células HT-29 fueron tratadas con concentraciones crecientes de erastin (0,1 a 30 mM). Se realizó el ensayo de MTT. Como se muestra en la figura 1A, erastin potentemente inhibida HT-29 la supervivencia celular, que se evidencia por la reducción de MTT OD. Erastin mostró un efecto dependiente de la dosis (Fig 1A), y 30 mM de erastin muestra el efecto más dramático (Fig 1A). Erastin llevó al menos 48 horas para ejercer efecto citotóxico significativo en células HT-29 (Fig 1A). El efecto citotóxico por erastin también se demostró mediante el ensayo de tinción con azul de tripano (Fig 1B) y el ensayo de formación de colonias (Fig 1C). Erastin tratamiento (1-30 mM) aumentó significativamente el número de positivos azul de tripano ( "muerto") células HT-29 (figura 1B), la disminución de la supervivencia whiling HT-29 colonias (Figura 1C).
El cáncer colorrectal células (HT-29, DLD-1 y Caco-2 líneas) o NCM460 células epiteliales del colon fueron tratados con el control del vehículo (DMSO al 0,1%, "Ctrl") o se indique concentraciones de erastin de tiempo aplicada, la supervivencia celular se ensayó mediante el ensayo de MTT (A y e) y el ensayo de formación de colonias (C); Se registró el porcentaje de positivos azul de tripano (células "muertas") (B); La proliferación celular se ensayó mediante el ensayo de incorporación de BrdU (D y F). Para cada ensayo, n = 5. Los datos presentados son la media ± SD. Los experimentos se repitieron tres veces con resultados similares obtenidos. * P & lt; 0,05 frente a grupo de "Ctrl".
Curiosamente, erastin (1-30 mM) apareció ineficaces en la inhibición de la proliferación de células HT 29, y la incorporación de BrdU no se ha modificado en las células HT-29 después de erastin citotóxico (1-30 mM) de tratamiento (Fig 1D). Por lo tanto, el efecto citotóxico por erastin es poco probable debido a la inhibición de la proliferación. resultados de MTT en la figura 1E mostraron que erastin (1-30 mM) también fue citotóxico para las otras dos líneas celulares de cáncer colorrectal: DLD-1 y CaCo2. Sin embargo, el mismo tratamiento erastin fue en general seguro a las células epiteliales de colon no cancerosos NCM460 (Fig 1E). Una vez más, la incorporación de BrdU, el indicador de la proliferación celular, no se vio afectada por erastin (10 mM) en las células DLD-1 y CaCo2, ni en NCM460 células epiteliales (Fig 1F). Basándose en estos resultados, se muestra que erastin ejerce citotóxico, pero no citostático, la actividad de células de cáncer colorrectal cultivadas.
3,2. Erastin induce la producción de ROS y la apoptosis dependiente de caspasas en células de cáncer de colon cultivadas
A continuación, se evaluó la actividad potencial de erastin sobre la apoptosis celular. Como se describe en nuestros estudios anteriores [8,9], se realizaron varios ensayos de apoptosis. Los resultados del ensayo de caspasa mostraron que la actividad de la caspasa-3 y caspae-9 fue significativamente mayor en las células HT-29 después de erastin citotóxico (1-30 mM) de tratamiento (figura 2A), lo que indica activación de la vía mitocondrial de la apoptosis [24]. Por otra parte, la actividad de la caspasa-8, un indicador de extrínseco activación de la vía apoptótica [25,26], se mantuvo sin cambios en células HT-29 erastin tratados (Fig 2A). Cell activación apoptosis por erastin también fue confirmada por el ensayo de Anexina V FACS (Fig 2B) y la histona de ADN apoptosis ensayo ELISA (Fig 2C). dependiente de la dosis Erastin aumento del porcentaje de Anexina V y la histona DNA ELISA OD en células HT-29 (Figura 2B y 2C).
células de cáncer colorrectal (HT-29, DLD-1 y Caco-2 líneas) o NCM460 células epiteliales de colon se trataron con control de vehículo (0,1% DMSO, "Ctrl") o indicaron concentraciones de erastin de tiempo aplicada, apoptosis de las células se examinó mediante ensayos enumerados (AC, G y H); la producción de ROS se examinó también (D y I). células HT-29 se pre-trataron con z-DEVD-fmk ( "zDEVD", 50 M), Z-LEHD-FMK ( "zLEHD", 50 M) o MnTBAP (10 M) durante 1 hora antes de aplicar erastin estimulación , la supervivencia celular y la muerte celular se ensayaron mediante el ensayo de MTT (e) y azul de tripano de ensayo (F), respectivamente. Para cada ensayo, n = 5. Los datos presentados son la media ± SD. Los experimentos se repitieron tres veces con resultados similares obtenidos. * P & lt; 0,05 frente a grupo de "Ctrl".
#p & lt; 0.05 vs. grupo de erastin solamente (E y F).
Desde erastin es un compuesto de unión VDAC-, que puede interrumpir la cadena respiratoria mitocondrial y causar la producción de ROS [18]. Estamos próximos a prueba el nivel de estrés oxidativo en las células HT-29 erastin tratados. Los resultados en la figura 2D demostraron claramente que erastin aumentó el nivel de ROS en células HT-29. Para estudiar el papel de la apoptosis y la producción de ROS en la citotoxicidad inducida por erastin, se aplicaron varios inhibidores farmacológicos. Como se muestra en la figura 2E y 2F, el inhibidor específico z-DEVD-fmk de la caspasa-3, la caspasa-9 inhibidor específico z-LEHD-FMK, o el eliminador de superóxido MnTBAP [27] todo aliviado citotoxicidad erastin inducida por HT-29 células (Fig 2E y 2F). En otras dos líneas celulares de cáncer colorrectal, erastin (10 M) también indujo la caspasa-9 (Fig 2G) y la activación de la apoptosis (Fig 2H), así como la producción de ROS (Fig 2I). Tales efectos de erastin de nuevo, no se observaron en las células epiteliales de colon NCM460 (Figura 2G-2I). Por lo tanto, erastin induce la producción de ROS y la apoptosis dependiente de caspasas en células de cáncer colorrectal.
3.3. Erastin induce apertura MPTP en células de cáncer colorrectal cultivadas
Desde erastin es un compuesto VDAC de unión a [18], se evaluó a continuación, el estado de MPTP en células de cáncer colorrectal erastin tratados. En primer lugar, la inmunoprecipitación mitocondrial (Mito-IP) de ensayo [28,29] demostró que ANT-1 y Cyp-D forma un complejo en las células tratadas con erastin HT-29 (Fig 3A), que se conoce como la etapa inicial de la apertura MPTP [12,13]. En segundo lugar, el nivel de citosol citocromo C también se incrementó en 29-HT células después del tratamiento erastin (Fig 3B), que es un evento conocido después de la apertura MPTP [12,13]. Además, el aumento de la intensidad de fluorescencia verde JC-10 indicó pérdida del potencial mitocondrial (ΔΨm) (figura 3C). Todos estos resultados indican claramente que la apertura del MPTP después del tratamiento erastin en células HT-29. Tenga en cuenta que los resultados similares por erastin se obtuvieron también en otras dos líneas celulares de cáncer colorrectal (datos no mostrados)
.
HT-29 células fueron tratadas con erastin aplicada durante el tiempo indicado, la apertura MPTP se evidenció por VDAC-1 mitocondrial -ant-1 asociación (A), el citocromo C ( "cito-C") de liberación (B) y JC-10 aumento de intensidad (C). células HT-29 se pre-trataron con sanglifehrin A (SFA, 2,5 M), ciclosporina A (CsA, 0,5 M) o ácido bongkrékico (BA, 5 mM) antes de la erastin (10 mM) de tratamiento, la supervivencia celular (D) y apoptosis (E) se analizaron después. De forma estable 29-HT células que expresan VDAC-1 shRNA-1 /-2 o control de mezcla aleatoria shRNA ( "scr shRNA") fueron tratados con erastin (10 mM), VDAC-1 de expresión (F), la supervivencia celular (G) y la apoptosis ( H) se ensayaron. assocaited-ANT-1 Cyp-D (A), la expresión de citocromo C citosol (B) y VDAC-1 de expresión (F) se cuantificaron. Para cada ensayo, n = 4. Los datos presentados son la media ± SD. Los experimentos se repitieron tres veces con resultados similares obtenidos. * P & lt; 0,05 frente a grupo de "Ctrl".
#p & lt; 0.05 vs. grupo de erastin solamente (D y E) o el grupo "scr shRNA" (G y H). "Trans" es sinónimo de control de transfección (FH).
Para estudiar el papel de MPTP en la citotoxicidad erastin-causado, aplicamos varios bloqueadores farmacológicos conocidos MPTP, incluyendo sanglifehrin A (SFA) [30], ciclosporina A (CsA) [31] y el ácido bongkrékico (BA) [28,32]. Como se ha demostrado, pre-tratamiento con estos bloqueadores MPTP significativamente atenuada erastin inducida HT-29 la muerte celular (Fig 3D) y la apoptosis (Fig 3E). Para apoyar aún más nuestra hipótesis, se aplicó la estrategia shRNA desmontables selectivamente y de forma estable VDAC-1, el componente clave de MPTP y proteína de unión de erastin [12]. Dos establemente HT-29 líneas que expresan distintos shRNA VDAC-1 (-1 /-2) fueron establecidos (Figura 3F). Es importante destacar que la citotoxicidad inducida por erastin (Figura 3G) y la apoptosis (Figura 3H) se inhibieron significativamente en células HT-29-silenciado VDAC-1. Estas evidencias farmacológicas y genéticas sugieren que la citotoxicidad inducida por erastin contra las células de cáncer colorrectal requiere VDAC-1 vinculante y posterior apertura MPTP.
3.4. VDAC-1 sobreexpresión potencia la citotoxicidad de erastin
Para apoyar aún más el papel clave de VDAC-1 en la citotoxicidad inducida por erastin, expresamos de forma exógena VDAC-1 en células HT-29. resultados de transferencia Western de la figura 4A confirmaron VDAC-1 sobre-expresión en células establemente HT-29 con VDAC-1 constructo. Como resultado, se aumentaron reducción de viabilidad erastin inducida (Fig 4B) y la apoptosis (Fig 4C). Estudios adicionales mostraron que la sobre expresión de VDAC-1 facilitado la producción erastin inducida por ROS (Fig 4D) y JC-10 aumento OD (el indicador de apertura MPTP, Fig 4E). Curiosamente, hemos demostrado que las células epiteliales de colon NCM460 expresaron bajo nivel de VDAC-1 (figura 4F). Sin embargo, cuando nos expresamos sobre-VDAC-1 en las células NCM460 (figura 4F), estas células se volvieron vulnerables a erastin (figura 4G). Por lo tanto, estos resultados confirman además que VDAC-1 es un determinante clave de la actividad de erastin.
HT-29 células de manera estable o células epiteliales de colon NCM460 que expresan el vector vacío (pSuper-puro, "Vec") o VDAC-1 cDNA ( "VDAC-1") fueron tratados con erastin diseñado para tiempo aplicada, VDAC-1 de expresión, la supervivencia celular y la apoptosis se analizaron mediante el ensayo de Western blotting (a y F), el ensayo de MTT (B y G) y el ADN de la histona ensayo ELISA (C), respectivamente; También se analizaron la producción de ROS (D) y JC-10 intensidad (E). Para cada ensayo, n = 4. Los datos presentados son la media ± SD. Los experimentos se repitieron tres veces con resultados similares obtenidos. VDAC-1 de expresión se cuantificó (F) * p & lt.; 0,05 frente a grupo de células "Ctrl Vec" (B-E).
#p & lt; 0,05 vs grupo erastin de células "Vec" (B-E). "Trans" es sinónimo de control de transfección (D y E).
3.5. administración Erastin suprime HT-29 el crecimiento de xenoinjertos en ratones SCID
El
in vivo
actividad por erastin también se probó. Se aplicó ratones SCID HT-29 modelo de xenoinjerto. La curva de crecimiento tumoral resultados semanales en la figura 5A demostraron que la inyección intraperitoneal erastin drásticamente inhibida HT-29 el crecimiento de xenoinjertos en ratones SCID. Erastin de
in vivo
actividad fue nuevamente dependiente de la concentración. Erastin a 30 mg /kg fue más potente que 10 mg /kg en la supresión de HT-29 xenoinjertos (Fig 5A). Cabe señalar que el peso corporal de ratones no fue significativamente diferente entre cada uno grupos (figura 5B). Tampoco nos damos cuenta de cualquier signo de toxicidad aparente en estos ratones. Estos resultados indican que estos animales fueron bien tolerados a los regímenes de erastin aquí. Además, el crecimiento del tumor diaria, calculada como mm
3 /día, disminuyó con la administración erastin (Figura 5C). Al final de los experimentos, los pesos de xenoinjertos erastin-administrado también eran mucho más baja que la de los ratones de control del vehículo (Fig 5D). Estos resultados mostraron que la administración erastin inhibe el crecimiento tumoral HT-29
in vivo
.
HT-29 ratones portadores de tumores SCID se administraron por vía intraperitoneal con erastin (10/30 mg /kg peso corporal o " bw ", todos los días, durante 4 semanas) o control de vehículo (solución salina), volúmenes de los tumores (a) y los pesos de los ratones del cuerpo (B) se registraron semanalmente durante cinco semanas; el crecimiento del tumor Daily también se calculó (C). A la terminación de los experimentos, todos los xenoinjertos fueron aislados y ponderada (D). Para cada ensayo, n = 10. Los datos presentados fueron la media ± SD. Los experimentos se repitieron dos veces con resultados similares obtenidos. * P & lt; 0,05 frente a grupo de "vehículo".
#p & lt; 0,05 frente a grupo de erastin a 10 mg /kg de peso corporal.
Discusión
En el presente estudio, hemos demostrado que erastin ejerció efecto citotóxico potente contra varias células de cáncer colorrectal humano posiblemente a través de la inducción de estrés oxidativo y la caspasa-9 apoptosis de las células dependiente. Se observó la apertura MPTP en las células cancerosas tratadas con erastin, que se evidenció por VDAC-1 y asociación Cyp-D, la liberación mitocondrial despolarización y citocromo C. Los inhibidores de caspasa, el eliminador de ROS MnTBAP, y bloqueadores de MPTP (sanglifehrin A, ciclosporina A y el ácido bongkrékico), así como la precipitación mediada por shRNA de VDAC-1, todos significativamente atenuada citotoxicidad erastin inducida y la apoptosis en células de cáncer colorrectal. Por otra parte, la sobre expresión de VDAC1 potenciada citotoxicidad de erastin. Basándose en estos resultados, proponemos que erastin une a VDAC1 para interrumpir la función mitocondrial normal, causando la apertura MPTP, y, finalmente, conduce a la activación de la apoptosis de la caspasa-9-dependiente en células de cáncer colorrectal.
Cabe señalar que erastin era no citotóxico a las células epiteliales de colon NCM460. Tampoco se pudieron detectar cualquier caspasa-9 de activación ni MPTP disfunción significativa en las células tratadas con NCM460 erastin. Una posible razón podría ser que estas células epiteliales no cancerosas expresan muy bajo nivel de VDAC (-1), por lo tanto, las células no fueron objeto de erastin (ver figura 4). Como cuestión de hecho, cuando exógenamente sobre-expresado VDAC-1 en las células NCM460, estas células, al igual que las células cancerosas, se hizo vulnerable a erastin (ver figura 4). Otra posibilidad es que las células cancerosas son todas las células de crecimiento rápido, que posiblemente requieren alto nivel de la cadena respiratoria mitocondrial para producir ATP. Estas células podrían ser más sensibles a VDAC o interrupción MPTP. El hecho de que sólo se refiere a erastin células cancerosas indica que podría ser un candidato ideal para el tratamiento contra el cáncer.
Aunque varios estudios han investigado el potencial actividad anticancerígena por erastin
in vitro
[ ,,,0],14,16,33], el
in vivo
evidencias siguen faltando. En el presente estudio, hemos demostrado que la inyección intraperitoneal de erastin dosis bien toleradas (10 o 30 mg /kg, diariamente) inhibió drásticamente HT-29 el crecimiento de xenoinjertos en ratones SCID. Es importante destacar que, el
in vivo
erastin regímenes no afectó a los pesos de los ratones, ni tampoco se induce ninguna toxicidad significativa a los animales de experimentación. Estos resultados preclínicos sugieren que erastin podría ser un agente anti-cáncer colorrectal prometedor.
Conclusiones
En resumen, erastin interrumpe MPTP e induce la muerte apoptótica de las células del cáncer colorrectal. Erastin puede investigarse más a fondo como un nuevo agente anti-cáncer colorrectal.