humano
Extracto
En las células no cancerosas, existe proteínas fosforiladas en forma transitoria, convirtiéndose de-fosforilada por fosfatasas específicas que terminan propagación de vías de señalización. En los cánceres, la actividad fosfatasa en peligro y /o expresión se producen y contribuyen a fenotipo tumoral. La fosfatasa no receptor, PTPN13, recientemente se ha denominado un supresor tumoral putativo. Se disminuyó la expresión en el cáncer de mama se correlaciona con una disminución de la supervivencia global. Aquí nos muestran que PTPN13 regula un nuevo complejo de señalización en cáncer de mama consiste en ErbB2, Src, y EphrinB1. Para nuestro conocimiento, este complejo de señalización no se ha descrito previamente. Co-inmunoprecipitación y localización de los estudios demuestran que EphrinB1, un sustrato PTPN13, interactúa con ErbB2. Además, la mutación oncogénica V660E ErbB2 mejora esta interacción, mientras que Src quinasa media la fosforilación EphrinB1 y la posterior señalización de la MAP quinasa. Disminución de la función PTPN13 supone una mejora adicional de señalización. La asociación de las quinasas de oncogenes (ErbB2, Src), un ligando transmembrana de señalización (EphrinB1) y un supresor de tumor fosfatasa (PTPN13) sugieren que EphrinB1 puede ser una diana terapéutica relevante en los cánceres de mama que alberga mutaciones ErbB2-activación y disminución de la expresión PTPN13.
Visto: Vermeer PD, Bell H, K Lee, Vermeer DW, Wieking BG, Bilal E, et al. (2012) ErbB2, EphrinB1, quinasa Src y PTPN13 complejo de señalización MAP quinasa regula la señalización en los cánceres humanos. PLoS ONE 7 (1): e30447. doi: 10.1371 /journal.pone.0030447
Editor: Christina Lynn Addison, Ottawa Instituto de Investigación del Hospital, Canada |
Recibido: 4 Agosto, 2011; Aceptado: 16 de diciembre de 2011; Publicado: 18 Enero 2012
Derechos de Autor © 2012 Vermeer et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por 7R01DE018386-03 de los Institutos nacionales de /Instituto Nacional de Salud de Investigación Dental y Craneofacial y el Estado de Dakota del Sur cáncer traslacional subadjudicación 3SB161. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
ErbB2 (HER2) amplificación /sobreexpresión ocurre en el 20-30% de los cánceres de mama que resulta en el comportamiento del tumor agresivo y mal pronóstico [1], [2]. la activación de ErbB2 a través de hetero-dimerización con otros miembros de la familia o homo-dimerización con sí mismo (cuando se expresa en niveles altos) inicia señales intracelulares que culminan en la transcripción de muchos genes que regulan la proliferación, supervivencia, diferenciación, invasión y metástasis. De esta manera, ErbB2 juega un papel clave en la orquestación de un fenotipo de cáncer de mama agresivo [3]. El avance de las terapias dirigidas como el trastuzumab, un anticuerpo anti-ErbB2 humanizado, mejora la supervivencia de pacientes con cáncer de mama HER2 [4], [5]. Sin embargo, la mayoría de los pacientes no responden al trastuzumab (62-74%), que alberga
de novo
resistencia; los que sí responden beneficiarse en gran medida con una mayor probabilidad de sobrevivir más de cinco años o tumor que queda libre. Lamentablemente, el 25% de estos pacientes que responden inicialmente a más no responden al tratamiento [6] - [9]. Al igual que
de novo
resistencia, las vías que conducen a la resistencia a trastuzumab adquirida siguen sin estar claros [10], [11]. Si bien se han logrado avances significativos en la comprensión del papel de ErbB2 en la iniciación y progresión del cáncer de mama, la gran resistencia a la terapia con trastuzumab sugiere que existen vías de señalización adicionales que eluden ErbB2 bloqueo mediado por anticuerpos. La caracterización de estas vías y, más importante aún, las proteínas que ellos inician, definirá nuevas dianas para la intervención terapéutica que puede volver a sensibilizar a los pacientes HER2 para trastuzumab y mejorar la supervivencia.
Además de amplificación /sobreexpresión, polimorfismos en ErbB2 en el codón 655 (dentro del dominio transmembrana) están asociados con un mayor desarrollo de cáncer de mama en algunas poblaciones, lo que sugiere que los cambios en la secuencia de codificación de ErbB2 también pueden tener consecuencias funcionales asociados con el cáncer [12] - [14]. secuencias de codificación ErbB2 pueden afectar a las asociaciones con las proteínas asociadas y posteriormente alterar la señalización intracelular mediada por ErbB2. Por lo tanto, al igual que la resistencia a trastuzumab, la identificación de estas vías será fundamental para definir las terapias que bloquean o sortearlas, la mejora de la supervivencia.
Mientras dominantes funciones pro-oncogénicos como las descritas para la quinasa de ErbB2 en el cáncer de mama ocurren con frecuencia en forma sólida tumores, alteraciones en fosfatasas igualmente se producen y funcionan como supresores de tumores. Por ejemplo, la no-receptor de proteína tirosina fosfatasa, PTPN13 (también conocido como FAP1, PTPL1, PTPLE, PTPBAS, PTP1E; PTP-BL es el homólogo de ratón) [15] - [17] Recientemente se ha conocido como un supresor tumoral putativo. PTPN13 es un multi-módulo que contiene fosfatasa. Sus dominios de interacción proteína-proteína cinco PDZ median asociaciones con muchas proteínas celulares y, como tales, sugieren que las mutaciones PTPN13 pueden alterar una variedad de diferentes funciones celulares [18], [19]. PTPN13 mutaciones han, de hecho, han identificado en colorrectal [16], de cabeza y cuello [20] y el cáncer de hígado [17], [21]. Es importante destacar que, disminución de la expresión PTPN13 en cáncer de mama se correlaciona con una disminución de la supervivencia general [22]. Además, hemos encontrado previamente que la disminución de la expresión PTPN13 sinergiza con una mutación activado ErbB2 transmembrana (mNeuNT) mejorar el crecimiento del tumor y la invasión
in vivo
[23]. Mientras que en los seres humanos la amplificación /sobreexpresión de ErbB2 es oncogénico, en animales de activación de mutaciones transmembrana ErbB2 son necesarios para el crecimiento del tumor. Por lo tanto, nuestros
in vivo
estudios con ratones hacen necesario el uso de mNeuNT, un constitutivamente activa mutación transmembrana de ErbB2. Sin embargo, el hallazgo de que los polimorfismos ErbB2 humanos pueden afectar a la prevalencia del cáncer de mama sugiere que el estudio de la activación de mutaciones transmembrana ErbB2 en animales (en ausencia de la amplificación /sobreexpresión) puede resultar beneficiosa en el contexto de la enfermedad humana. Mientras que un estudio realizado por Zhu
et al.
Sugiere que PTPN13 regula la función de ErbB2 directamente por de-la fosforilación del dominio de la señal ErbB2 [24], no hemos encontrado que en nuestro sistema lo que sugiere que PTPN13 y activado ErbB2 por sí sola puede no cuenta para la señalización aguas abajo mejorada, crecimiento tumoral, invasión y evidente en nuestros estudios publicados [23]. Por lo tanto, la hipótesis de que los modificadores adicionales funcionan en la sinergia PTPN13 /ErbB2 observados. Estamos motivados, además, que un sustrato de fosfatasa PTPN13 con capacidades de señalización puede ser una de tales moléculas candidato. Por lo tanto, se analizaron EphrinB1 [25].
EphrinB1 pertenece a una familia de ligandos que se unen y activan Eph tirosina quinasas receptoras. ligandos ephrin son únicos, la unión y la activación de la señalización de sus receptores afines, y se sienten cada fosforilada e iniciar sus propias cascadas de señalización. Esta característica específica Efrina se llama "inversa" de señalización. "Reverse" señalización siguiente acoplamiento del receptor Eph constituye la vía de señalización convencional. Sin embargo, Efrinas son promiscuos en sus asociaciones y la señalización se produce después de la interacción del receptor no Ef [26], [27]. Este tipo de señalización Ephrin es no convencional.
Dado que EphrinB1 es un sustrato de la fosfatasa de PTPN13, disminución de la expresión o mutaciones PTPN13 PTPN13 funcionales (ambos de los cuales se producen en los tumores sólidos) probablemente sea el resultado en un aumento de la fosforilación y la posterior EphrinB1 señalización. En el contexto del cáncer de mama en disminución de la expresión PTPN13 se correlaciona con la supervivencia pobre, la definición de las vías activadas en ausencia de PTPN13 pueden identificar objetivos críticos para la intervención terapéutica y mejorar la supervivencia. Por lo tanto, la hipótesis de que la sinergia entre la disminución PTPN13 y el aumento de la activación de ErbB2 que impulsa el crecimiento del tumor y la invasión está mediada a través de EphrinB1 y, además, que la señalización mediada por EphrinB1 se mejora en los cánceres de mama con expresión PTPN13 comprometida. A continuación, describimos una nueva asociación entre ErbB2 y EphrinB1. La expresión de un mutante de ErbB2 activado o sobre-expresión de ErbB2 de tipo salvaje (como en los cánceres de mama Her2), junto con una disminución de la expresión o función PTPN13, no sólo mejora la formación de complejos sino que también conduce a la fosforilación EphrinB1 y la señalización aguas abajo asociado. En este informe, caracterizamos este complejo, las señales mediadas de ella, y su relevancia para el cáncer de mama. Además, se demuestra que existe este complejo en otras células epiteliales y sugieren que la señalización del complejo desempeña un papel funcional en otros tumores sólidos también.
Resultados
PTPN13 pérdida se produce en los cánceres epiteliales
la disminución de la expresión PTPN13 se correlaciona con una disminución de la supervivencia global en el cáncer de mama [22]. Nos preguntamos si existe esta correlación en todos los tipos de cánceres de mama o si era específico para un subtipo particular. Por lo tanto, se analizaron una serie de la expresión génica a partir de 200 cánceres de mama en fase inicial y 7 muestras de mama normales para PTPN13 con especial atención al subtipo especificidad. Mientras Her2, luminal A, luminal B cánceres de mama y muestras de mama normales expresan niveles relativamente altos de PTPN13, de tipo basal (BL), los tumores expresan niveles significativamente más bajos de PTPN13 ARNm (Figura 1 A, p = 0,00044 para basal vs normal). Las comparaciones de los otros subtipos con mamario normal no fueron significativas. Sin embargo, mientras que los niveles PTPN13 mRNA en Her2, luminal A y los cánceres de mama luminal B no es diferente de mama normal, los datos no eliminan la posibilidad de que las mutaciones funcionales PTPN13 se producen en estos subtipos que pueden resultar en un fenotipo similar a la encontrada en su ausencia.
(a) relativa expresión de ARNm de PTPN13 PTPN13 en tumores de mama caracterizados molecularmente. (BL) cáncer de mama expresión PTPN13 de tipo basal disminuye en relación con mama normal (p = 0,00044 para basal vs normal). (B) Análisis de transferencia Western de líneas celulares de cáncer de mama. MDA-MB231, MDA-MB468, HCC1143, HCC1954 son líneas celulares de cáncer de mama con las características del cáncer de mama BL. La línea de células BT474 tiene Her2 /ErbB2 sobre-expresión de las características del cáncer de mama. MCF7 y T47D son líneas celulares de cáncer de mama con características luminales. células HEK293 que sobre-expresan PTPN13 sirvió como control positivo. líneas celulares de cáncer (C) BL de mama, MDA-MB231 y MDA-MB468, expresando baja o alta PTPN13, respectivamente, se analizaron por Western blot. las células (D) HEK293 establemente derribado para EphrinB1 (sh EphrinB1) o control se analizaron por Western blot. (E) células MDA-MB468 se transfectaron transitoriamente con un plásmido de shRNA orientación PTPN13 (shPTPN13) o un no silenciar constructo shRNA (Non-silenciamiento) y se analizaron mediante western blot para las proteínas indicadas. células (F) HaCaT, una línea celular de queratinocitos humanos, y células UM-SCC84, una cabeza de HPV-negativa y línea celular de carcinoma de células escamosas de cuello, de forma estable derribado por PTPN13 (sh PTPN13) o líneas de control se analizaron por Western blot. células (G) HaCaT de forma estable durante PTPN13 derribado-(sh PTPN13) o sobre-expresión de la proteína HPV16 E6 (PHV16 E6) o de control se analizaron por Western blot para EphrinB1 fosforilada, fosforilados Erk1 /2, el total de Erk1 /2, y GAPDH. expresión
también examinamos PTPN13 proteínas en líneas celulares de cáncer de mama se define sub-tipos [28]. Mientras que la expresión PTPN13 varió entre líneas celulares, tres de cada cuatro de las líneas celulares BL ensayados exhibieron casi ausente proteína PTPN13 (Figura 1B). Los tumores BL comprenden un grupo heterogéneo de cánceres, pero, en general, son tumores agresivos con un mal pronóstico [29]. Por lo tanto, nuestros resultados son consistentes con los de Revillion
et al
correlativa disminución de la expresión PTPN13 y pobre supervivencia global [22]. Estos datos apoyan la hipótesis de que la pérdida de PTPN13 impactos de expresión fenotipo tumoral y sugieren que PTPN13 juega un papel en la regulación de la proliferación epitelial, la migración y /o la invasión en el cáncer de mama BL.
PTPN13 pérdida aumenta fosforilados EphrinB1 y Erk1 /2
cinco dominios PDZ
de PTPN13 mediar asociaciones con muchas proteínas, incluyendo EphrinB1 [19]. Después de la unión, PTPN13 de-fosforila EphrinB1, cerrando la señalización inversa [18], [19]. Para probar los efectos de la disminución /perdido PTPN13 sobre la fosforilación de EphrinB1, se examinaron dos líneas celulares de cáncer de mama MDA-BL: MB231, que expresa la proteína PTPN13 casi indetectable, y MDA-MB468, que expresa la proteína endógena PTPN13 (Figura 1B). Como era de esperar, una baja expresión PTPN13 (MDA-MB231) se correlaciona con un aumento de EphrinB1phosphorylation mientras que la expresión endógena PTPN13 (MDA-MB468) se correlaciona con una baja fosfo-EphrinB1 (Figura 1C). Estos datos son consistentes con EphrinB1 ser un sustrato de fosfatasa PTPN13 y sugieren que la disminución de la expresión de PTPN13 en líneas celulares de cáncer de mama BL aumenta la fosforilación de EphrinB1.
Dada la capacidad de EphrinB1 a la señal, nos preguntamos, además, si EphrinB1 fosforilada correlacionada con aumento de la señalización corriente abajo. El análisis molecular de los carcinomas de mama BL demuestra que muchos productos de los genes de la agrupación BL están asociados con la activación de MEK /ERK, por tanto, optamos por analizar el estado de fosforilación de ERK1 /2 en estas líneas celulares BL [30] - [33]. Se encontró que la disminución /expresión PTPN13 ausente (MDA-MB231) se correlaciona con un aumento de la fosforilación de Erk1 /2 (Figura 1C); mientras que la expresión endógena PTPN13 (MDA-MB468) se correlaciona con una disminución de Erk1 /2 fosforilación. Estos datos sugieren que las señales de activación EphrinB1 (fosforilación) a través de la vía de la MAP quinasa. Para probar esto, se forma estable derribado EphrinB1 en células HEK293, elegidos debido a su facilidad de transfección en relación con líneas celulares de cáncer de mama. Knock-down de los resultados en la atenuación EphrinB1 prominente de Erk1 /2 (Figura 1D) consistente con EphrinB1 mediada por la activación de ERK1 /2. Tomados en conjunto, los datos sugieren que la ausencia de resultados PTPN13 en la activación EphrinB1 mejorada y concomitante Erk1 /2 fosforilación.
Como otra prueba, fue (shRNA mediada endógeno PTPN13 transitoriamente derribado en las células MDA-MB468 , shPTPN13). Como se predijo, PTPN13 knock-down aumento de la fosforilación de EphrinB1 consistente con la regulación de la fosforilación de PTPN13 EphrinB1 (Figura 1E) [25]. Por otra parte, el aumento de EphrinB1 asociado con ErbB2 en lisados de células shPTPN13 que sugieren que los asociados EphrinB1 fosforilados más fácilmente con ErbB2 en comparación con EphrinB1 no fosforilado. Sorprendentemente, PTPN13 knock-down no afectó Erk1 /2 fosforilación, lo que sugiere que, o bien EphrinB1 no es una señal a través de la vía de la MAP cinasa en las células MDA-MB468 o que su señalización es modulada en estas células a través adicional (como todavía no definidos) componentes.
los intentos previos de nuestro laboratorio a más de expresar PTPN13 no han tenido éxito como el aumento de sus resultados de la expresión en la muerte celular, lo que limita nuestra capacidad de analizar sus efectos aguas abajo [34]. Por lo tanto, no hemos podido poner a prueba los efectos de la sobre-expresión de PTPN13 en las células MDA-MB231, que carecen de la expresión endógena. Sin embargo, dadas sus efectos en la fosforilación EphrinB1 en células de cáncer de mama, especuló que una reducción en la expresión o función PTPN13 puede ser una común y, más importante, una alteración clave en otros cánceres epiteliales. Para probar este concepto, hemos derribado PTPN13 en una línea celular de queratinocitos humanos (células HaCaT) y se analizaron sus efectos en la señalización. Disminución de la expresión PTPN13 efecto mejorado EphrinB1 y ERK1 /2 fosforilación (Figura 1F, HaCaT). Del mismo modo, knock-down de PTPN13 en la cabeza y la línea celular de carcinoma de células escamosas del cuello, UM-SCC84, traducido en una mayor EphrinB1 y ERK1 /2 fosforilación (Figura 1F, UM-SCC84). Es importante destacar que los estudios anteriores se centraron en el virus del papiloma humano (VPH): se asocian los cánceres de cabeza y cuello demuestran que se une la oncoproteína E6 de HPV16 y metas para la degradación PTPN13 [34], [35]. Por lo tanto, las células VPH positivas sirven como una prueba adicional de la función de PTPN13 en la señalización celular en el contexto de
viralmente
cáncer mediada. Por lo tanto, hemos analizado previamente caracterizadas amígdalas ratón las células epiteliales de forma estable expresión HPV16 E6 o aquellos que de manera estable derribado por PTPN13 [34], [35]. De hecho, la expresión de HPV16 E6 mejorado EphrinB1 y ERK1 /2 fosforilación, en consonancia con la disminución /perdieron la expresión PTPN13. Por otra parte, knock-down de PTPN13 en el ratón las células epiteliales de las amígdalas demostraron un efecto similar (shPTPN13, Figura 1G). En conjunto, estos datos sugieren que la disminución de la expresión PTPN13 mejora EphrinB1 y Erk1 /2 fosforilación en las células epiteliales. El hallazgo de que los virus de VPH de alto riesgo han desarrollado un mecanismo para eliminar celular PTPN13, destaca además la importancia de PTPN13 funciones reguladoras críticas de las vías de señalización celular. Los datos sugieren que la expresión PTPN13 puede ser interesante evaluar en muchos, si no todos, los tumores sólidos.
ErbB2 co-inmunoprecipitados y co-localiza con EphrinB1
Los datos anteriores sugieren que la disminución /PTPN13 perdido aumenta la activación EphrinB1 que después puede modular la fosforilación aguas abajo de ERK1 /2. Nuestro laboratorio ha demostrado previamente que la disminución /perdido PTPN13 sinergia con ErbB2, potenciando MAP quinasa de señalización [23]. Por lo tanto, nos preguntamos si la fosforilación EphrinB1 y el 2 de señalización ERK1 /resultante se realice de manera ErbB2 mediada, no convencional. Por lo tanto, nos preguntamos si los asociados EphrinB1 con ErbB2 y completamos co-precipitación y los estudios de co-localización. Se encontró que EphrinB1 y ErbB2 co-precipitado (Figura 2A) a partir de lisados derivados de líneas celulares de cáncer de mama, así como las células HaCaT. Curiosamente, knock-down de PTPN13 en las células HaCaT (shPTPN13) mejoradas desplegable de EphrinB1 con ErbB2, sugiriendo de nuevo que se asocia EphrinB1 fosforilados más fácilmente con ErbB2 que el estado no fosforilado. Además, en todos los casos múltiples formas de EphrinB1 fueron derribadas con ErbB2 (flechas Figura 2A). Especulamos estas bandas representan diferentes formas fosforiladas, según lo sugerido por Xu
et al
. En su estudio, la mutación de los residuos de tirosina EphrinB1 da como resultado la pérdida específica de las bandas EphrinB1 lo que sugiere que las bandas evidentes por Western blot representan formas fosforiladas de la proteína [36]. Alternativamente, las bandas pueden representar EphrinB1 no glicosilada o degradados como se sugiere por Makarov
et al
[37]. Aunque la identidad de estas bandas no está definido en este estudio, diferentes anticuerpos EphrinB1 verifican su co-inmunoprecipitación con ErbB2 (datos no mostrados). Es importante destacar que, mientras que cantidades variables de ErbB2 fueron derribadas en todos los lisados ensayadas (en consonancia con sus diferentes niveles de expresión de ErbB2), una cantidad similar de EphrinB1 se asoció con él. Estos datos sugieren que existe un límite a la cantidad de EphrinB1 que se asocia con ErbB2; más expresión ErbB2 no da como resultado un aumento de la asociación EphrinB1. Estos datos sugieren que la interacción está estrechamente regulada.
(A) análisis de transferencia de Western de una línea celular de queratinocitos humanos, las células HaCaT (de control, así como células abatidos para PTPN13), y líneas celulares de cáncer de mama ( MCF7, BT474, HCC1953) inmunoprecipitó (IP) para ErbB2 y inmunotransferencia (IB) para EphrinB1. Membrana se sondeó para volver a ErbB2. GAPDH se utilizó como control de carga. (B)
En Face
imágenes confocal de células HaCaT immunolocalizing EphrinB superficie (verde) y ErbB2 totales (rojo). Los núcleos se counterstained con DAPI (azul). La barra de escala 20 micras. (C) Western blot de líneas celulares de cáncer de mama: T47D, BT474 y MCF7. (D) células HEK293 transfectadas transitoriamente con ya sea de tipo salvaje o el mutante PTPN13 C /S PTPN13 analizado por transferencia de western. (E) células HEK293 transfectadas transitoriamente con ya sea solo eGFP, o una combinación de EphrinB1, ErbB2 (de tipo salvaje o mNeuNT), y PTPN13 (de tipo salvaje o C /S mutante) y se analizaron por Western blot. (F)
En face
imágenes confocal de células transfectadas en E procesados por inmunolocalización de EphrinB fosforilada (verde) y ErbB2 (rojo). Los núcleos contratinción con DAPI (azul). La barra de escala 20 micras.
Co-inmunotinción de ErbB2 endógeno y endógeno, EphrinB superficie en las células HaCaT muestra que ErbB2 y EphrinB co-localizar en las uniones célula-célula (Figura 2B). EphrinB superficie se localizó en las células no fijadas, utilizando unpermeabilized EphB1-Fc. EphB1-Fc es una quimera que consiste en la región extracelular del receptor EphB1 (un receptor cognado EphrinB) fusionado a IgG humana
1. Por lo tanto, EphB1-Fc se une a la superficie ligandos EphrinB expresadas. Estas interacciones se detectan a continuación, utilizando un anti-humanos células IgG-FITC y analizadas por microscopía confocal. Por lo tanto, mientras que la tinción de la superficie no es específico de EphrinB1alone, sugiere que las proteínas EphrinB co-localizar con ErbB2. Junto con los datos de inmunoprecipitación, estos datos sugieren que los asociados EphrinB1 con ErbB2
Para evaluar la importancia de la interacción ErbB2 /EphrinB1 en el cáncer de mama, se analizaron adicionalmente: BT474, un (ErbB2) línea celular Her2;. T47D, una línea celular luminal con alta expresión de ErbB2; MCF7, otra línea celular luminal con baja expresión de ErbB2 (Figura 1B). Curiosamente, tanto las células MCF7 T47D y expresan casi indetectable PTPN13, mientras que las células BT474 expresan endógeno PTPN13 (Figura 1B). La inmunoprecipitación de ErbB2 seguida de Western blot para EphrinB1 demuestra mejorada EphrinB1 co-IP en las células T47D que se correlacionaban con los niveles más altos de EphrinB1 fosforilada. Este hallazgo es consistente con nuestros datos anteriores que sugiere que los asociados EphrinB1 fosforilados más fácilmente con ErbB2. Además, las células T47D demuestran la fosforilación robusta de Erk1 /2, que era indetectable en las células BT474 y MCF7 (Figura 2C). Tomados en conjunto, estos datos sugieren que en líneas celulares de cáncer de mama con expresión baja /ausente PTPN13, y la expresión de alto ErbB2, la fosforilación EphrinB1 es elevada como es su asociación con ErbB2 y se correlaciona con una mejora de Erk1 /2 fosforilación. Los datos sugieren además que la falta de efecto sobre Erk1 /2 fosforilación en las células MDA-MB468 shPTPN13 (Figura 1E) puede ser debido a la expresión de ErbB2 insuficiente y /o formación de complejos con EphrinB1.
mNeuNT aumenta la formación de complejos y la señalización
Dado que ErbB2 es una tirosina quinasa y la fosforilación EphrinB1 inicia la señalización inversa, nos preguntamos si ErbB2 fosforila EphrinB1. Además, dado sus efectos en la fosforilación EphrinB1, especuló que PTPN13 regula esta activación. Para examinar esto, tanto de tipo salvaje PTPN13 (PTPN13
en peso), así como una fosfatasa mutante nulo (PTPN13
C /S) se pusieron a prueba. Además, nuestros resultados anteriores demuestran que un mutante constitutivamente activa ErbB2 transmembrana (V660E, en adelante, mNeuNT) sinergia con pérdida de PTPN13 y aumenta la MAP quinasa de señalización y el crecimiento invasivo mientras que de tipo salvaje (endógeno) ErbB2 no [23]. Por lo tanto, tanto mNeuNT y ErbB2 de tipo salvaje (wt ErbB2) se ensayaron también. Habida cuenta de su baja expresión endógena de PTPN13, la facilidad de la transfección y expresión robusta de PTPN13 transfectadas, se utilizaron células HEK293 para estos estudios (Figura 2D). En estos experimentos las células HEK293 se transfectaron transitoriamente con ErbB2 (ya sea de tipo salvaje o mNeuNT), EphrinB1 de tipo salvaje y PTPN13 (ya sea de tipo salvaje o el /S mutante C) y se analizaron por Western blot.
lisados de control (eGFP) muestran que EphrinB1 co-inmunoprecipitados con ErbB2 pero que EphrinB1 no es fosforilada y Erk1 /2 no se activa (carril 1, Figura 2E). La expresión de tipo salvaje ni (carril 2, Figura 2E) ni C /S PTPN13 (carril 4, Figura 2E) cambia de estos parámetros en la presencia de sobre-expresado en peso ErbB2 y EphrinB1. En contraste, la expresión de mNeuNT con EphrinB1 aumenta no sólo la cantidad de EphrinB1 asociar con él, pero también conduce a EphrinB1 y Erk1 /2 fosforilación (carriles 3 y 5, la Figura 2E). células HEK293 expresan poco ErbB2 endógeno (datos no mostrados); Además, el anticuerpo anti-ErbB2 utilizado para la precipitación inmune reconoce tanto ErbB2 de tipo salvaje y mNeuNT. Por lo tanto, mientras que los estudios de co-IP no pueden distinguir entre EphrinB1 asociado con ErbB2 endógeno o mNeuNT, los datos apoyan firmemente una asociación mNeuNT. Si bien hemos demostrado anteriormente que la sola expresión mNeuNT aumenta Erk1 /2 fosforilación [23], nuestra conclusión de que la expresión de PTPN13
C /S no es capaz de reducir EphrinB1 y ERK1 /2 phosphoryaltion, sugiere que EphrinB1 mediada por la señalización inversa también contribuye a Erk1 /2 fosforilación (Figura 2E, carril 5, flechas). Además, la expresión de tipo salvaje PTPN13 (carril 3, Figura 2E), pero no C /S mutante PTPN13 (carril 5, la Figura 2F), disminuye la cantidad de EphrinB1 fosforilada y P-Erk -1/2, también coherente con la fosforilación EphrinB1 que afecta a la señalización MAP quinasa.
Estos datos bioquímicos fueron confirmados por estudios de inmunolocalización de EphrinB fosforilada (Figura 2F, verde) y ErbB2 (Figura 2F, rojo). Sólo expresión de los resultados en mNeuNT fosforilada EphrinB presentes en la superficie celular (Figura 2F, paneles 3 y 4, de color amarillo indica la expresión co-localización de fosforilados EphrinB y ErbB2). Además, sólo de tipo salvaje PTPN13 disminuye la cantidad de EphrinB fosforilada en la superficie celular (Figura 2F, comparar amarillo y verde entre los paneles 3 y 4). Tomados en conjunto, estos datos sugieren que, 1) asociados con mNeuNT EphrinB1 y esta asociación se ha mejorado con la fosforilación EphrinB1, 2) EphrinB1 fosforilada se correlaciona con la fosforilación de Erk1 /2 y 3) que PTPN13 de-fosforila EphrinB1 en este contexto.
mNeuNT co-inmunoprecipitados con y activa Src
señalización mediada por ErbB2 se produce directamente a través de su actividad quinasa o por su reclutamiento de Src en un complejo de señalización [38]. Además, tras la unión a su cognado receptor Eph, Src fosforila EphrinB1 [25]. Dado que tanto el tipo salvaje ErbB2 y mNeuNT contienen un dominio de tirosina quinasa de tipo salvaje, la hipótesis de que la fosforilación EphrinB1 mejorada y MAP quinasa señalización evidente en el contexto de la disminución /perdió PTPN13, implica Src. Por lo tanto, estableció por primera vez para determinar si los asociados Src con ErbB2, como se sugiere en la literatura [38]. células HEK293 se transfectaron transitoriamente con wildtype ErbB2 o mNeuNT y probados. Si bien co-IP de Src activado con ErbB2 de tipo salvaje era casi indetectable, activado Src asociada con mNeuNT (Figura 3A). El anticuerpo anti-Src activado reconoce Src tirosina 416 (pSrc-Y416) cuando está fosforilada, un sitio que promueve la actividad Src [39], [40]. Estos datos sugieren que los asociados mNeuNT con Src activado.
(A) células HEK293 transfectadas transitoriamente con cualquiera de ErbB2 de tipo salvaje o mNeuNT y analizadas por Western blot. (B) células HEK293 transfectadas transitoriamente con una combinación de EphrinB1, mNeuNT, y PTPN13 (de tipo salvaje o C /S mutante) fueron tratadas con o sin PP2 y se analizaron por Western blot. células (C) no transfectadas HEK293 tratados con dosis crecientes de saracatinib y analizados por Western blot para la expresión endógena de Src activado, el total de Src, EphrinB1 fosforilada y se inmunoprecipitaron EphrinB1.
Src media la fosforilación EphrinB1
Tanto mNeuNT y Src quinasas, son cualquiera de los cuales puede phosphorylate EphrinB1. Además, mNeuNT asocia preferentemente con Src activado (Figura 3A). Por lo tanto, hemos probado si Src activado (en lugar de mNeuNT) media la fosforilación EphrinB1. Las células HEK293 se transfectaron transitoriamente con mNeuNT, ya sea de tipo salvaje y EphrinB1 o mutante (C /S) PTPN13 y se analizaron por Western blot. En consonancia con los datos anteriores, mNeuNT co-IPS con Src activado y EphrinB1 está fosforilada (Figura 3B, pista 1); PTPN13
C /S mejora EphrinB1 fosforilación (Figura 3B, carril 3). Para probar el papel de Src en la fosforilación EphrinB1, las células transfectadas fueron tratadas con PP2, un inhibidor de Src potente. Xu
et al
demostrado previamente que el tratamiento con 1 mM PP2 eficientemente bloques mediados por Src fosforilación EphrinB1 mientras que el tratamiento con 25 mu M resultados PP2 en el desprendimiento de células [36]. Por lo tanto, en este estudio para asegurar la inhibición de Src eficiente, las células se trataron con 10 mM PP2 por un corto tiempo (4 horas). En mNeuNT, EphrinB1 y de tipo salvaje PTPN13 transfectadas lisados, el tratamiento PP2 disminuyó la cantidad de Src activado asociado con mNeuNT y atenúa EphrinB1 fosforilación (Figura 3B, pista 2). Los lisados de mNeuNT, EphrinB1 y PTPN13
/S células transfectadas C se vieron afectados de manera similar por PP2 lo que sugiere que la fosforilación EphrinB1 dentro del complejo mNeuNT, Src, PTPN13 es mediada por Src. Tomados en conjunto, estos datos sugieren que Src, en lugar de mNeuNT, fosforila EphrinB1 y más compatible con la literatura publicada y nuestros propios hallazgos que PTPN13 es responsable de la fosforilación de-EphrinB1 en este complejo.
PP2 es una familia Src inhibidor de la quinasa, el bloqueo de la activación de Lck, Fyn, Hck y Src. Además, los experimentos realizados utilizando PP2 utilizado células HEK293 que sobre-expresan PTPN13, ErbB2 y EphrinB1. Por lo tanto, para inhibir de forma más selectiva Src y para poner a prueba su función en la fosforilación de EphrinB1 endógeno, también se analizó saracatinib (AZD-0530, actualmente en ensayos clínicos [41] - [44]) en las células no transfectadas. las células HEK293 fueron tratadas con saracatinib (0, 0,25 M o 1,0 M) y se analizaron por Western blot. tratamiento Saracatinib inhibió con éxito la activación de Src y una respuesta a la dosis era evidente. Además, en la dosis más alta, hubo una disminución en la cantidad de fosforilación EphrinB1 (Figura 3C) consistente con un papel para Src en la mediación de la fosforilación EphrinB1.
EphrinB1 inmunoprecipitados con ErbB2 en una manera que no requiere el PDZ extracelular o C-terminal motivo
Nuestros datos sugieren que la regulación del complejo ErbB2 /EphrinB1 pueden mediar señales importantes en el cáncer de mama. Dado que ErbB2 y EphrinB1 interactúan, diseño razón de ser de inhibidores de moléculas pequeñas para bloquear su asociación puede ser de valor terapéutico. Por lo tanto, ErbB2 y EphrinB1 mutantes se generaron para definir los dominios necesaria y suficiente para su asociación.
ErbB2 contiene dos grandes dominios extracelulares que designamos los dominios 1 y 2. mutantes ErbB2 extracelular de unión a ligando borrado de cualquiera de los dominios de unión a ligando 1 (Δ 1-174 LBD1) o ambos dominios 1 y 2 (Δ 1-487 LBD2) se generaron. dominio de unión a PDZ de ErbB2 se ha eliminado en tercera mutante (Δ 1251-1255 PDZBD) (Figura 4A). Todos los mutantes de ErbB2, incluyendo la proteína de longitud de tipo salvaje completo, eran HA marcado en el extremo N-terminal. Los constructos se transfectaron en células HEK293 y se analizaron por la pérdida de co-IP con EphrinB1 endógeno.