Extracto
Antecedentes
ErbB2 es un miembro de la familia del factor de crecimiento epidérmico de tirosina quinasas, que se llevan en el centro de la patogénesis del cáncer de próstata y varios estudios han informado de que una alta expresión de esta proteína tiene valor pronóstico. En el presente estudio, hemos investigado si la inmunorreactividad ErbB2 tumoral (ErbB2-IR) tiene valor pronóstico clínicamente útil, es decir, que proporciona información pronóstica adicional a la proporcionada por las pruebas de rutina clínicos (puntuación de Gleason, estadio tumoral).
Metodología /Principales conclusiones
ErbB2-IR se midió en un microarray de tejido bien caracterizado de muestras tumorales y no tumorales obtenidas al momento del diagnóstico. Además, los niveles de mRNA de ErbB2-IR en la próstata se determinaron en la rata después de la manipulación de los niveles circulantes de andrógenos. Tumor ErbB2-IR se asoció significativamente con la molécula de señalización corriente abajo fosforilada Akt y con el marcador de proliferación celular Ki-67. La asociación significativa de tumores ErbB2-IR con la puntuación de Gleason el momento del diagnóstico se perdió cuando se controla por la asociación de ambos parámetros con Ki-67. En la próstata de la rata, el ARNm de ErbB2 se asoció inversamente con los niveles de andrógenos circulantes. No hubo asociación entre ErbB2-IR y el receptor de andrógenos (AR) -IR en los tumores, pero una interacción entre los dos parámetros se observó con respecto a su asociación con el estadio del tumor. Tumor ErbB2-IR se confirmó que es un marcador pronóstico para la supervivencia específica de la enfermedad, pero no proporcionó información significativa aditivo a la puntuación de Gleason o para Ki-67.
Conclusiones /Importancia
se concluye que el tumor ErbB2-IR es de valor clínico limitado como marcador pronóstico para facilitar las decisiones de tratamiento, pero podría ser de importancia fisiopatológica en cáncer de próstata
Visto:. Hammarsten P, J Winther, Rudolfsson SH, Häggström J, Karalija A, Egevad L, et al. (2014) ErbB2 receptor inmunoreactividad en el cáncer de próstata: Relación con el receptor de andrógenos, gravedad enfermedad en el diagnóstico y la Enfermedad Resultado. PLoS ONE 9 (9): e105063. doi: 10.1371 /journal.pone.0105063
Editor: Ramin Massoumi, Universidad de Lund, Suecia |
Recibido: 16 de febrero de 2014; Aceptado: July 19, 2014; Publicado: 12 de septiembre 2014
Derechos de Autor © 2014 Hammarsten et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por las subvenciones del Consejo de Investigación sueco (concesión no 12158, medicina, CJ Fowler.); la Sociedad Sueca del Cáncer (. Subvención sin CAN 2010/437, C. J. Fowler); Fundación de Investigación del Cáncer de León, Universidad de Umeå (P. Hammarsten y C. J. Fowler); la Fundación de Investigación del Cáncer en el norte de Suecia (P. Hammarsten) y los Fondos de Investigación de la Facultad de Medicina, Universidad de Umeå (C. J. Fowler). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
ErbB2 (Her-2 /neu) es un miembro de la familia del factor de crecimiento epidérmico de las tirosina quinasas implicadas en una variedad de respuestas celulares que incluyen la apoptosis, migración, crecimiento, adhesión y diferenciación [1]. ErbB2 forma heterodímeros con otros miembros de la familia ErbB e inicia una cascada de rutas de señalización, incluyendo la activación del factor de supervivencia Akt [1], [2]. ErbB2 también se encuentra en las células tumorales, y trastuzumab, un anticuerpo monoclonal ErbB2, se utiliza para el tratamiento adyuvante del cáncer de mama ErbB2-positivo. Otros anticuerpos monoclonales ErbB2 también están en desarrollo clínico [3].
La importancia de ErbB2 en la patogénesis del cáncer de próstata (CaP) es menos clara. crecimiento Pca está regulado por los receptores de andrógenos (AR), y un tratamiento de clave de Pca dependiente de andrógenos es una reducción de los niveles de andrógenos, ya sea por la castración quirúrgica o médica. Sin embargo, el efecto del tratamiento es temporal, y los cánceres de convertirse en andrógeno-resistente. En 1999, Craft et al. [4] informó de que la introducción de ErbB2 en células Pca dependientes de andrógenos LNCaP prestados ellas parcialmente resistente a la inhibición del crecimiento producido por la privación de andrógenos. Además, en un modelo de xenoinjerto utilizando ratones castrados, las células que expresan ErbB2 produjeron una formación de tumores más rápido que las células LNCaP no transfectadas [4]. La validez predictiva de los modelos de xenoinjerto es controvertido [5], pero un aumento de la tasa de metástasis se ha informado en un modelo ortotópico de Pca después de la inyección en la próstata ventral de los ratones nude de células de la próstata de rata-1,4 NBE sobreexpresan el homólogo de rata de ErbB2 [ ,,,0],6]. Por el contrario, el tratamiento de la hembra BALB /c ratones desnudos con un crecimiento tumoral reducido anticuerpo ErbB2 después de la inyección de las células 22Rv1 Pca [7]. La eliminación de los andrógenos a partir de medio de cultivo celular aumenta la expresión de ErbB2 [8], y un ligero aumento en la expresión de ErbB2 siete días después de la castración se ve en un modelo de xenoinjerto de crecimiento del tumor con las células CWR22 [9].
Mientras que la estudios en líneas celulares y modelos animales apuntan a un papel clave de ErbB2 en la patogénesis de Pca, los estudios en humanos son menos claros. Diferentes estudios han notificado muy grandes variaciones en los niveles de expresión de ErbB2 en el tejido del tumor de próstata (ver [10] y las referencias en él). Sin embargo, un meta-análisis de la literatura entre 1996 y 2009 se observó un mayor riesgo relativo de muerte debido a la recurrencia bioquímica (antígeno prostático específico, PSA) de la enfermedad en pacientes con niveles moderados a altos de expresión de ErbB2 del tumor [11 Pca o ]. Estos autores concluyeron que "más ensayos clínicos deben probar la hipótesis de que el HER-2 /neu es un marcador de un peor resultado clínico en pacientes con cáncer de próstata y un objetivo potencial para la terapia". Una de estas investigaciones posteriores en un grande (& gt; 1700) número de pacientes, se confirmó que las propiedades de pronóstico de la sobreexpresión de ErbB2 con recurrencia de PSA como punto final, aunque no proporcionaron información pronóstica aditivo a la dada por la puntuación de Gleason, el estadio tumoral y el nivel de PSA preoperatorio [10]. Aunque los pacientes no fueron tratados durante el período de seguimiento, las muestras se obtuvieron en la prostatectomía radical en lugar de en el diagnóstico. Por tanto, es importante determinar si ErbB2 tiene un mejor valor pronóstico (es decir, proporciona información aditivo a la dada usando la puntuación de Gleason y otros marcadores de pronóstico) en una cohorte de pacientes en los que las muestras de tejido se obtuvieron al momento del diagnóstico y la progresión natural de la enfermedad puede ser estudiado. Esto ha sido investigado en el presente estudio.
Materiales y Métodos
Ética declaración
El material humano se recogió conforme a las disposiciones suecas en un momento en que fue informada no se requiere el consentimiento . El comité de ética de la investigación en Umea hospital universitario (Regional de Ética Junta de Revisión de Umeå) aprobó el estudio (n. ° 02-283) y renunciado a la necesidad del consentimiento.
Ethical permiso (n. ° A110-12) de los experimentos con animales se obtuvo del comité de ética local de animales (Comité de Ética de Umeå de Estudios de animales, Suecia).
las muestras de pacientes
la cohorte utilizada es de una serie consecutiva de 412 hombres que fueron diagnosticados con cáncer de próstata después de la resección transuretral para reducir los gran variedad de síntomas del tracto urinario [12]. Se recogieron los casos entre 1975 y 1991 en el Hospital Central, Västerås, Suecia, un período de tiempo en que la prueba de PSA no era rutina. Dado que los pacientes fueron diagnosticados después de la operación, que no habían recibido tratamiento hormonal o radioterapia antes de la resección transuretral. Las muestras fueron fijadas en formalina y embebidos en parafina. Utilizando núcleos (diámetro 0,6 mm) se hicieron los microarrays de tejidos utilizando un instrumento Beecher (Sun Prairie, WI, EE.UU.). Para cada paciente, hasta ocho núcleos (generalmente 5) de tejido tumoral y hasta cuatro muestras de tejido no maligno de cada paciente fueron colocados [12].
inmunorreactividad ErbB2 (ErbB2-IR) en Pca microarrays
Las secciones micro matriz tejido incluido en parafina de 4 micras se colocaron en portaobjetos, al horno a 60 ° C, 1 h, después deparaffinised y rehidratada. se llevó a cabo bloque peróxido con 3% de H
2O
2 en metanol durante 20 min. La recuperación del antígeno se realizó con secciones colocados en un tampón de citrato pH 6.0 y al vapor en un horno de microondas durante 2 min. La solución se dejó enfriar durante 5 min, se lavaron en agua destilada y luego tampón TBS. La proteína-bloque (DAKO, Estocolmo, Suecia) se realizó durante 15 min después de lo cual las secciones se expusieron al anticuerpo monoclonal primario (ratón c-erbB-2 prediluido cóctel de anticuerpos (PM070AA), Biocare, CA, EE.UU.) durante 2 h en RT. A continuación, el anticuerpo secundario (caballo anti-ratón (BA-2000), Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE.UU.) se incubó a 30 min a temperatura ambiente seguido de etiquetado complejo avidina-biotina durante 30 min a RT usando el kit Elite ABC (Vector Laboratories ) y, por último, DAB (Dako) mejora durante 40 s a temperatura ambiente.
tumor (n = 1822) y no maligno (n = 1170) núcleos se anotó para ErbB2 en las células epiteliales y células de tumor de próstata a partir escaneada digitalmente imágenes por un evaluador (JW) que no lo hicieron en el momento de la evaluación tienen acceso a los datos clínicos. Las muestras de tumor se puntuaron sobre la base de la intensidad inmunorreactiva (que van desde 0 = sin tinción a 4 = tinción máxima) y la distribución (0, 25, 50, 75, 100%). Tenga en cuenta que las puntuaciones de distribución no incluían estroma, ya que este no expresó ErbB2-IR. Por lo tanto, una muestra con sólo una pequeña proporción de las células epiteliales, pero con una gran cantidad de estroma todavía puede anotar una distribución de 100% y una intensidad de 4. A continuación, para cada núcleo se determinó un valor compuesto (entre 1-4). Por ejemplo, un núcleo con el lugar donde 25% de la muestra tenía scorable intensidad 2 y 75% tenían intensidad 3 recibiría una puntuación compuesta de (0,25 × 2 + 0,75 × 3) = 2,75. La mediana de los valores se determinaron a continuación, para cada caso. Para determinar la consistencia, 301 núcleos tumorales se anotó y luego vuelven a puntuar. coeficiente de correlación intraclase para la consistencia (modelo mixto) dio alfa de Cronbach de 0,90, 254 de 301 partituras estaban dentro de 0,5 unidades de puntuación del uno al otro. Los núcleos no malignas fueron anotados, además de las células basales y luminales por separado, cuando sea posible. Algunos núcleos (n = 482) tenían claramente identificable basales y células luminales y éstos se han vuelto como basal y luminal en la base de datos. Una capa basal difusa (n = 436) se observó en algunos otros núcleos y en los núcleos restantes (n = 252) las células basales no pudieron ser identificados. Estos núcleos no fueron utilizados aquí, por lo que debe ser recordado como una advertencia de que las puntuaciones para basal y luminal no maligno ErbB2-IR representan un conjunto de datos limitados. índice de Ki67, pAkt-IR, receptor de andrógenos (AR) -IR y las características clínicas de cada paciente estaban disponibles en la base de datos y se han reportado en todo o en parte anteriormente [12] - [15].
Animales y tratamientos
Cuarenta y dos ratas macho adultas Sprague-Dawley (284-430 g) se anestesiaron con pentobarbitalnatrium (50 mg /kg) y castrados mediante el escroto. Seis animales intactos sirvieron como controles. Después de 7 días, veintiuno de los animales recibieron una inyección subcutánea de larga actuación testosterona (5 mg /kg, Sustanon, Organon, Oss, Países Bajos) dado en una sola dosis cada dos días como se describe anteriormente [16]. tejido de la próstata se retiraron en diferentes momentos después de la castración (1, 3, 7 días) y en diferentes momentos después de la castración + tratamiento con testosterona (1 día, 2 días, 3 días) y se congelaron en nitrógeno líquido. Hubo siete grupos, incluyendo el grupo de control y cada grupo estaba formado por seis animales.
El diseño experimental de este estudio procedió de acuerdo con las directrices para el cuidado y manejo de animales de laboratorio y fue aprobado por el comité de ética local de animales ( Comité de Ética umeå de Estudios de animales, Suecia). Los animales fueron alojados bajo una temperatura controlada en una habitación iluminada artificialmente (12 h de luz /12-h oscuridad). Alimentos y agua del grifo están a libre disposición. Se aisló
preparación de ARN y la transcripción reversa cuantitativa de PCR
ARN total de tejidos de acuerdo con el método de Trizol (Invitrogen, Estocolmo, Suecia). las concentraciones de ARN se cuantificaron espectrofotométricamente a 260 nm (Espectrofotómetro DU 640, Beckman Coulter, Bromma, Suecia) y la integridad del ARN se verificó por 28 S y 18 S rRNA integridad después de la electroforesis en gel de agarosa (datos no mostrados).
Cinco cien ng de ARN total se invirtió transcrito usando hexámeros aleatorios (Applied Biosystems, Sundbyberg, Suecia) y transcriptasa inversa Superscript II (Invitrogen, Estocolmo, Suecia) en una reacción de 10 l de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Todas las reacciones de cDNA se realizaron por duplicado.
Cuantificación de ErbB2 mRNA se realizó por PCR en tiempo real cuantitativa usando el PRISM 7900HT instrumento ABI (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). Las reacciones se realizaron en un volumen de 20 l usando genes de expresión TaqMan ensayos Rn00566561_m1 (Applied Biosystems, Life Technologies Europe BV, Estocolmo, Suecia) con la expresión génica TaqMan mezcla maestra de acuerdo con el protocolo del fabricante. Cada muestra se analizó para Rpl13a (Rn00821946_gl, Applied Biosystems) y β-actina (Rn00667869_ml, Applied Biosystems) de expresión para utilizar como controles de referencia de la normalización. Para confirmar la especificidad de amplificación los productos de PCR se sometieron a un análisis de la curva de fusión. Los datos de cuantificación se analizaron con SDS 2,4 Software (Applied Biosystems) y los valores relativos de mRNA ErbB2 en las muestras se calculan a partir de una curva patrón obtenida por amplificación de cinco veces la dilución en serie de ARN total transcrito invertido a partir de una muestra de referencia. Un problema en este tipo de estudio es la adecuada limpieza de usar, ya que sus niveles pueden variar en estudios de investigación del cáncer [17], [18]. Hemos optado por presentar los datos normalizado a dos genes: ß-actina y RPL13A, con el fin de dar una evaluación de la solidez de los datos
Estadísticas
El coeficiente de correlación intraclase, binario. Los análisis de regresión de riesgos proporcionales de Cox y logística se realizaron utilizando el software SPSS (IBM). regresión ordinal analiza el software utilizado desarrollado dentro del proyecto de R estadística (versión 2.15.2) [19]. Todos los otros cálculos estadísticos utilizan el paquete estadístico integrado en el programa GraphPad Prism 6 computadora para Macintosh (GraphPad Software Inc, San Diego, CA, EE.UU.). Para los casos, seguido de la esperanza, se utilizaron característica (ROC) curvas de funcionamiento del receptor con un límite de seguimiento de 15 años para definir puntos de corte para ErbB2-IR. Por estas curvas y de las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier, un evento se define como la muerte atribuible a cáncer de próstata y registrado en la base de datos como "evento = 1". Los pacientes con muerte por otras causas y casos en los que los pacientes estaban vivos en el momento del seguimiento fueron censurados y entró en la base de datos como un evento = 0.
Resultados
ErbB2-IR en Pca microarrays de tejidos: comparación de las puntuaciones del tumor y no malignas
Un total de 357 222 casos (no malignas basal y luminal) (tumor) y se anotó para ErbB2-IR. Ejemplos de diferentes intensidades ErbB2-IR de cuatro núcleos de tumor se muestran en la Fig. 1A-D. Un ejemplo de tejido no maligno que muestra una clara diferencia entre basal y luminal ErbB2-IR se muestra en la Fig. 1E. Tanto para el tumor y las muestras no malignas, las células epiteliales mostraron ErbB2-IR, mientras que el estroma no lo hizo. Las puntuaciones acumulativas para el epitelial del tumor y la basal no maligno y células luminales se muestran en la Fig. 2A. Por diferentes muestras, los resultados fueron significativamente diferentes entre sí (P & lt; 0,0001 para pruebas por parejas, Wilcoxon de pares relacionados firmado rank test). A nivel de los núcleos individuales, el número de casos con puntuaciones basales ≥-1, -0,99 a -0,01, 0, de 0,01 a 0,99, 1-1,99 y ≥ 2 unidades más alto que las puntuaciones luminales emparejados fueron 1, 1, 5, 86, 286 y 103, respectivamente
Los puntajes asignados fueron:. Puntuación 1 para el Grupo a; Puntuación 2 para el Grupo B; Puntuación 2,25 (75% de intensidad puntuación de 2, la puntuación de intensidad del 25% 3) para el Grupo C; Puntuación 4 para Grupo D. La puntuación de Gleason de los casos a partir de los cuales se derivaron los núcleos eran 5 para paneles A y C, y 10 para paneles B y D. Panel E muestra ejemplo de ErbB2 inmunoreactividad en un núcleo no maligna, donde basales y la tinción luminal podría ser fácilmente identificado.
En el panel a las frecuencias acumuladas de las puntuaciones de ErbB2-IR se muestran para las muestras de tumor (n = 357), y para el basal y luminal muestras no malignas (n = 222 en ambos casos). Los valores de la mediana (con rango intercuartil entre paréntesis) fueron: tumores, 3.0 (02.25 a 03.05); no maligno luminal, 2,25 (2,0 a 2,625); basales no maligno 3.875 (3,5-4,0). Los valores medios fueron significativamente diferentes entre sí (p & lt; 0,001, prueba de comparación múltiple de Dunn siguiente significativa prueba de Kruskal-Wallis). El panel B muestra un diagrama de dispersión de las puntuaciones individuales para tumores ErbB2-IR y pAkt-IR (tomado de [14]).
Asociación de ErbB2-IR con la gravedad de la enfermedad al momento del diagnóstico
la asociación de ErbB2-IR con (edad, la puntuación de Gleason,% de la base que se asoció tumor) y bioquímica clínica (índice Ki67, estroma AR-IR y pAkt-IR) medidas dentro de la misma región se muestran en la Tabla 1. en primer lugar -order valores rho de Spearman de la Tabla 1 se calcularon como se describe en [20]. En las muestras de tumores, asociaciones significativas con la puntuación de Gleason,% de núcleo que fue asociado a un tumor, el índice de Ki67 y pAkt-IR se encontraron. Un diagrama de dispersión que muestra la asociación entre las puntuaciones de ErbB2-IR y pAkt-IR del tumor se muestra en la Fig. 2B. En consonancia con el valor de rho de Spearman la significativa, la distribución de casos con puntuaciones de Gleason 4-5, 6, 7 y 8-10, respectivamente, fue diferente para los que tienen una puntuación de tumores ErbB2-IR ≤2.75 (40 [26%], 46 [30%], 26 [17%] y 41 [27%]) que aquellos con una puntuación & gt; 2,75 (21 [10%], 57 [28%], 40 [20%] y 86 [42%]) (P & lt; 0,0005, test de Chi cuadrado; valores dados son el número [% para el grupo de ErbB2-IR] en el rango puntuación de Gleason el momento del diagnóstico los valores correspondientes para los grados tumorales 1a-1b, 2, 3 y 4, respectivamente,. fueron: tumor de puntuación de ErbB2-IR ≤2.75, 92 [61%], 30 [20%], 25 [17%] y 3 [2%]); tumor puntuación de ErbB2-IR & gt; 2,75, 83 [41%], 61 [30%], 49 [24%] y 8 [4%] (P & lt; 0,005, χ
2 test).
En teoría, una asociación significativa de dos parámetros podría ser debido al hecho de que los dos parámetros están asociados con un tercer parámetro. Así, por ejemplo, si los casos con una alta tasa de proliferación celular, como se ve con el marcador de índice Ki67, más a menudo tienen altas puntuaciones de Gleason y las puntuaciones de ErbB2-IR más altos que los casos con bajas tasas de proliferación de las células, y luego una correlación entre ErbB2- serían inducidos puntuaciones de IR y el Gleason. Consistente con esta situación, las correlaciones de primer orden entre ErbB2-IR y, o bien la puntuación de Gleason o% de núcleo que estaba asociado a tumor de controlar por el índice de Ki67 tumor no fueron significativas. Sin embargo, la asociación entre tumores ErbB2-IR y pAkt-IR se mantuvo significativa (Tabla 1). Por lo tanto, en el tejido tumoral, las puntuaciones de ErbB2-IR están asociadas con la molécula de señalización corriente abajo pAkt y con el marcador de proliferación de las células Ki67, pero no fuertemente con las medidas clínicas de la gravedad de la enfermedad. No hay correlación significativa entre ErbB2-IR y, o bien la puntuación de Gleason, el% de núcleo que fue asociado a tumor o el índice de Ki67 no maligno fue visto por cualquiera de ErbB2-IR basal o luminal. Se observaron asociaciones significativas entre ErbB2-IR basal y ambos no maligno pAkt-IR y AR estroma.
Relación entre el tumor y ErbB2 señalización de andrógenos
Ricciardelli et al. [21] informó de que los altos niveles tanto de tumores ErbB2-IR y AR-IR fueron más comunes en pacientes con CaP en estadio 3 tumores (n = 31) que en la etapa 2 tumores (n = 22, las muestras obtenidas en la prostatectomía radical). Aquí se investigó la relación entre estas dos variables en nuestro microarrays de tejidos. De acuerdo con el estudio de [21], no había correlación entre las dos variables
per se
en el tejido tumoral (tabla 1). Sin embargo, en nuestros materiales, los casos con niveles tanto de tumores ErbB2-IR y AR-IR por encima de la mediana fueron menos comunes en pacientes con estadio 3 tumores (n = 58) que en la etapa 2 tumores (n = 82) (Tabla 2) . Como era de esperarse del análisis de correlación muestran en la Tabla 1, una cuestión de confusión es que el índice Ki-67 varía entre los grupos (Tabla 2).
Con el fin de dar cuenta de esto, llevamos a cabo regresión ordinal analiza con tumores ErbB2-IR, AR-IR y Ki67-índice como las variables independientes y el estadio del tumor como la variable dependiente ordinal. Como una advertencia, se debe señalar el Ki67-índice se correlaciona tanto con ErbB2-IR (Tabla 1) y AR-IR (rho de Spearman -0.17, n = 340, P & lt; 0,005) y así las tres variables no son verdaderamente independiente . Sin embargo, las correlaciones, aunque importantes, son relativamente bajos, por lo que el riesgo de multicolinealidad es pequeño. Además, la palabra "ordinal" en el análisis de regresión ordinal se refiere a la variable dependiente, y los valores de las variables independientes se han definido como continua, en lugar de ordinal, que es de hecho el caso para las puntuaciones (por lo tanto, por ejemplo, la uso de rho de Spearman en lugar de r de Pearson en la Tabla 1). Sin embargo, esto es totalmente razonable en modelos de regresión ordinal cuando la variable en cuestión tiene un gran número de categorías (hay 22 diferentes puntuaciones ErbB2 tumor que van de 1 a 4 en la base de datos). En el modelo de efectos principales, los valores obtenidos del análisis de regresión ordinal de una variable representan el efecto total si se incluyen las otras variables. En este caso, tanto el índice de Ki67 (positivo) y la AR-IR (negativo) fueron significativas, mientras que ErbB2 no era (Tabla 3). En el modelo de interacción plazo, el valor de la variable individual es para un valor constante de las otras variables. En este caso, los resultados para las tres variables fueron las mismas en términos de importancia, sin embargo, se volvió una significativa interacción ErbB2-IR x AR-IR (positivo). En otras palabras, cuando las variables se mantienen constantes, hay una influencia de la combinación de ErbB2-IR x AR-IR, de manera que la alta es la puntuación, mayor es el número de la etapa tumor. Los valores de la relación logit y el ratio para los cuatro niveles de respuesta (nivel 1 es el nivel de referencia) en diferentes puntuaciones de ErbB2-IR y AR-IR se muestran en la Tabla S1 para ilustrar este punto para aquellos lectores que conocen bien este método estadístico.
Los datos de Ricciardelli et al. [21] y el presente estudio son consistentes con, pero no una prueba de una interacción entre la señalización de andrógenos y la expresión de ErbB2. Dicha prueba requiere el uso de modelos experimentales. la eliminación de andrógenos afecta la expresión de ErbB2 en las líneas celulares de tumor [8] y en modelos de xenoinjerto [9]. No se sabe, sin embargo, si esta regulación se limita a las células tumorales o también se observa en el tejido de la próstata intacta tras variaciones a gran escala en los niveles circulantes de testosterona. Con el fin de determinar si se observaron efectos reguladores similares en la próstata normal, la expresión de ErbB2 en el nivel de ARNm en este tejido se midió mediante qPCR castración siguiente en ratas y después de ello el restablecimiento de los niveles circulantes de andrógenos por inyección de testosterona. Los resultados observados (Fig. 3) son consistentes con los estudios de tumores citados anteriormente
Se normalizaron los datos a A. ß-actina.; B, Rpl13a. Abreviaturas: pc d, el número de días después de la castración; T, testosterona. Se muestran los valores individuales (n = 6 por grupo); las barras sólidas indican las medianas. En ambos casos, las pruebas de Kruskal-Wallis indican una variación significativa entre los grupos (P & lt; 0,0001).
Valor pronóstico de tumores ErbB2-IR
Un total de 255 casos por anotó tumores ErbB2-IR fueron seguidos por la esperanza después del diagnóstico, siendo un tratamiento estándar en el momento. En estos casos, la progresión natural de la enfermedad se puede seguir, y la influencia de un biomarcador en resultado puede ser investigado. En general, se elige un valor de corte del biomarcador, y el resultado se comparó entre los casos por debajo y por encima de la línea de corte se determina en los análisis de supervivencia, tales como el análisis de regresión de riesgos proporcionales de Cox y gráficos de Kaplan-Meier. Los valores de corte pueden ser arbitrarios, tales como una simple división de la mediana de los datos, o definido sobre la base de un análisis estadístico. Uno de estos métodos es el uso de características operativas del receptor (ROC) análisis, que parcela para todos los posibles valores de corte de la tasa de verdaderos positivos (sensibilidad) frente a la tasa de falsos positivos (1-especificidad). Para una curva ROC con un área bajo la curva [AUC] significativamente superior a 0,5 (sin valor pronóstico), el óptimo valor de corte (el índice de Youden, que representa el punto de corte que le da el valor más alto para la sensibilidad especificidad + - 1 ) puede ser calculado (ver [22] para la descripción). Una curva ROC con un límite de 15 años indicó un importante valor pronóstico de tumores ErbB2-IR (área bajo la curva [AUC] 0,60, P & lt; 0,05), y se encontraba en la división ≤2.75 y & gt; 2,75. En comparación, el área bajo la curva ROC para el índice de Ki67 tumor fue 0,75 (P & lt; 0,0001) y así un valor de 0,60, aunque significativa, no es tan impresionante. El basales no maligno y anota ErbB2-IR luminales carecían de valor pronóstico (AUC≤0.55, P≥0.4).
En teoría, es posible que a pesar de las AUC para el tumor de ErbB2-IR es modesta, podría contribuir a una combinación de marcadores con valor pronóstico útil. Con el fin de investigar esta posibilidad, dos enfoques se han tomado, utilizando el tumor ErbB2-IR junto con otros tres marcadores tumorales (índice Ki67, epiteliales AR-IR y pAkt). Los datos se han normalizado por lo que la puntuación máxima en cada caso es 100%, y en el caso de la AR, los resultados se han expresado como puntuación de 100-normalizada, ya que la mínima, en lugar de un alto, AR-IR se asocia con un mal pronóstico [15]. Las diferentes combinaciones se probaron, pero ninguno dio una mejora a la observada con Ki67 solo (Tabla S2). Las curvas ROC dieron la misma ponderación a los diferentes biomarcadores, y por lo tanto, en teoría, una ponderación óptima podrían haber pasado por alto. En consecuencia, se investigó un análisis de regresión logística binaria con el resultado clínico como variable dependiente utilizando los mismos parámetros. La mejor combinación de parámetros en términos de predecir correctamente la muerte debido a Pca era ~~23% y la inclusión de ErbB2 no mejoró esta cifra (Tabla S3). En comparación, la puntuación de Gleason tuvo una tasa de predicción de 55,6% (Nagelkerke R
2 valor de 0.419) por sí sola y el 45,6% (Nagelkerke R
2 valor de 0.401) en combinación con AR-IR + Ki67-IR ( datos no presentados).
un análisis univariado de regresión de riesgos proporcionales de Cox con la supervivencia específica de la enfermedad como punto final indica que el riesgo relativo para los casos con una puntuación de tumores ErbB2-IR por encima del punto de corte óptimo, tal como se define por el índice de Youden, fue aproximadamente el doble que para aquellos por debajo del valor de corte (el valor Exp (B) se muestra en la Tabla 4). El análisis univariante no toma en cuenta todas las variables de confusión potenciales. A partir de los resultados anteriores presentados en este documento, Ki67 es un factor de confusión obvia, y analiza una Bivariadas riesgos proporcionales de Cox de regresión indicó que el tumor ErbB2-IR no proporcionó información pronóstica adicional a la proporcionada ya sea por el índice de Ki67 tumoral (Tabla 3). En términos de utilidad clínica, un marcador sería de interés si se proporciona información más allá de la proporcionada por la puntuación de Gleason. Sin embargo, un Bivariadas riesgos proporcionales de Cox análisis de regresión para controlar la puntuación de Gleason (tres grupos: 4-6, 7 y 8-10) indicó que el valor pronóstico de tumores ErbB2-IR ya no se mantuvo significativa (Tabla 4). Consistente con esto, gráficos de Kaplan-Meier para todos los casos, seguido de la esperanza mostraron un efecto pronóstico significativo del tumor ErbB2-IR (Fig 4A), y para los casos con puntuaciones de Gleason 4-6 (Fig. 4B). Sin embargo, un efecto pronóstico significativo no se observó en los casos con puntuaciones de Gleason 6 solo (figura 4C), puntuaciones de Gleason 7 solo (Fig 4D, aunque rozando la significación) o para los casos con puntuaciones de Gleason 8-10 (Fig. 4E).
el número de casos en los que la muerte se debió a cáncer de próstata se indican como
† Pca en la figura. Las escotillas en las líneas muestran datos censurados (es decir, casos distintos de la muerte por cáncer de próstata). El rango de puntuaciones de Gleason (GS) de los pacientes se muestran en cada panel.
Discusión
En el presente estudio, hemos investigado la asociación de ErbB2-IR con la gravedad de la enfermedad en el diagnóstico y con evolución de la enfermedad en un tejido bien caracterizado microarray [12]. Hay un gran cuerpo de trabajo en relación con el valor pronóstico de ErbB2 en Pca (revisión, ver [11]), pero el presente estudio proporciona información novedosa en dos aspectos importantes: en primer lugar, los datos se obtienen en los casos que no habían recibido ningún tipo de cáncer se tomaron el tratamiento antes de las muestras, ya que fueron diagnosticados sólo después de la resección transuretral para los síntomas del tracto urinario inferior. Además, dado que el tratamiento estándar en ese momento era la esperanza, el largo seguimiento usada permite el examen del curso natural de la enfermedad. Esto es extremadamente valiosa para la evaluación de biomarcadores. En segundo lugar, la disponibilidad de datos sobre la AR en las mismas muestras ha permitido un examen de las interrelaciones entre ErbB2 y AR expresión en los tumores. En general, nuestros resultados están en buen acuerdo con la literatura. Con respecto a las diferencias en la expresión de tejido de ErbB2, Lyne et al. [23] informó de que el porcentaje de muestras con moderada a fuerte inmunoreactividad ErbB2 fue de 100 para las células basales prostáticas benignas, 11 para las células luminales benignas de la próstata, 0 para el estroma de próstata benigna, 87 de neoplasia intraepitelial prostática y 82 para el cáncer de próstata. En el presente estudio, no observamos ErbB2-IR en el estroma, y el número (con paréntesis%) de los casos con resultados de ErbB2-IR ≥3 eran 196/222 (88%), 39/222 (18%) y 201/357 (56%) para los basales, luminales y tumorales muestras no malignas, respectivamente.
En las muestras tumorales, ErbB2-IR se asoció significativamente con el marcador de proliferación celular Ki 67 y la inmunorreactividad de pAkt , la forma fosforilada del factor de supervivencia Akt. La asociación con el Ki67 es consistente con un gran estudio usando muestras obtenidas en prostatectomía radical, en donde el índice medio de etiquetado Ki67 fue mayor para las 388 muestras tumorales ErbB2 positivos que para las 1940 muestras ErbB2-negativa (6.1 vs. 4.3, respectivamente, [21].