Extracto
TRAIL es un agente terapéutico prometedor para los tumores malignos humanos. TRAIL a menudo requiere la disfunción mitocondrial, se refiere como la vía del receptor de muerte Tipo II, para promover la citotoxicidad. Sin embargo, numerosas células malignas son resistentes TRAIL debido a la inhibición de esta vía mitocondrial. El uso de células colangiocarcinoma como modelo de resistencia a TRAIL, se encontró que Hedgehog bloqueo de señalización sensibiliza estas células de cáncer de TRAIL citotoxicidad independiente de la disfunción mitocondrial, conocido como la señalización del receptor de tipo I muerte. Este interruptor en el requisito TRAIL del tipo II al tipo de señalización del receptor de muerte que fue demostrado por la falta de dependencia funcional de la subasta /Bim y Bax /Bak, componentes pro-apoptóticos de la vía mitocondrial. la señalización hedgehog modulada expresión de la ligada al X inhibidor de la apoptosis (XIAP), que sirve para reprimir la muerte del receptor vía Tipo I. siRNA dirigidos desmontables de
XIAP
imita la sensibilización a la muerte TRAIL mitocondrias independiente alcanzado por la inhibición del erizo. Regulación de la expresión de XIAP por la señalización de Hedgehog es mediada por el oncogén glioma-asociado 2 (GLI2), un factor de transcripción aguas abajo de Hedgehog. En conclusión, estos datos proporcionan mecanismos adicionales que modulan la muerte celular por TRAIL y sugieren la inhibición del erizo como un enfoque terapéutico para tumores resistentes a TRAIL
Visto:. Kurita S, Mott JL, Cazanave SC, Fingas CD, Guicciardi ME, Bronk SF, et al. (2011) Inhibición del erizo promueve un interruptor del tipo II al tipo I la muerte celular receptor de señalización en las células cancerosas. PLoS ONE 6 (3): e18330. doi: 10.1371 /journal.pone.0018330
Editor: Andreas Bergmann, Universidad de Texas MD Anderson Cancer Center, Estados Unidos de América
Recibido: 4 Enero, 2011; Aceptado: February 25, 2011; Publicado: 31 Marzo 2011
Derechos de Autor © 2011 Kurita et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por los Institutos nacionales de Salud R01 subvenciones DK59427 (GJG), División de Investigación de Oncología, Centro Oncológico de Mayo Clinic, Clínica Mayo pancreático SPORE CA102701 P50, y Mayo Clinic Centro de Señalización celular en Gastroenterología NIDDK DK084567 P30 (MEF-Z) y la Fundación Mayo. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
necrosis tumoral relacionado con el factor inductor de apoptosis ligando (TRAIL), un ligando de muerte potente que induce preferentemente la apoptosis en células transformadas, inicia cascadas de señalización por ligación de dos receptores de muerte, DR4 (TNFRSF10A, también se conoce como receptor de TRAIL 1) y DR5 (TNFRSF10B, también conocida como receptor de TRAIL 2 /KILLER /trick-2) [1]. agrupación inducida por TRAIL y oligomerización de DR4 y DR5 como resultado cambios conformacionales de los dominios de muerte dentro de sus colas citoplasmáticas, facilitando el reclutamiento y la activación de las caspasas 8 y 10 dentro de una muerte inducir complejo de señalización (DISC) [2], [3], [ ,,,0],4]. Si la activación de estas caspasas iniciadoras es suficientemente robusto, que activan directamente la caspasa 3, lo que a su vez resulta en muerte celular por la llamada vía del receptor de muerte de tipo I de la apoptosis [5], [6]. Sin embargo, si la magnitud de la caspasa 8 y 10 de activación no es suficiente para activar directamente la caspasa 3, TRAIL todavía puede inducir apoptosis a través de la escisión de la BH3-única proteína proapoptótico de la subasta para generar truncada Oferta (tBID). proteína tBid desencadena mitocondrial permeabilización de la membrana externa mediante la promoción de la oligomerización de las proteínas de la familia Bcl-2 pro-apoptóticos Bak y /o Bax dentro de esta membrana. Resultados de permeabilización de la membrana mitocondrial externa en la salida de proteínas pro-apoptóticas desde el espacio intermembrana mitocondrial (es decir, el citocromo c, Smac /DIABLO, HtrA2, AIF, y endonucleasa G), que culmina en la vía mitocondrial de la apoptosis [7], [8 ]; la dependencia de la disfunción mitocondrial de la muerte celular se conoce como la vía del receptor de muerte de tipo II de la apoptosis [6]. señalización de tipo I del receptor de muerte parece estar regulada a nivel de la caspasa-3 de activación, mientras que la señalización del receptor de muerte de tipo II se regula a nivel de las mitocondrias por miembros de la antiapoptótico familia de proteínas Bcl-2 [7], [8], [ ,,,0],9], [10]. TRAIL suele indicar a través del Tipo II, las mitocondrias dependen de la vía [11], una vía que se inhibe con frecuencia en los cánceres resultantes de la resistencia a TRAIL [12], [13].
Aquí, nos demuestran que la inhibición de la vía Hedgehog oncogénico reprime la expresión de XIAP y sensibiliza a las células cancerosas a la citotoxicidad TRAIL, utilizando células colangiocarcinoma como un modelo para estudiar la resistencia a TRAIL. Estas células cancerosas abundantemente expresan proteínas de la familia Bcl-2 anti-apoptóticas, especialmente Mcl-1, que media la resistencia a TRAIL [14], [15]. MCL-1 inhibición de la ruta mitocondrial de la muerte celular es especialmente relevante para las células colangiocarcinoma, ya que paradójicamente expresan TRAIL
in vivo
, y probablemente debe eludir continuamente TRAIL señalización para la supervivencia [16] citotóxico. Teniendo en cuenta los datos emergentes que implican a la señalización de Hedgehog oncogénica en la biología del tumor gastrointestinal [17], [18], hemos explorado señalización de Hedgehog como un mecanismo que contribuye a la resistencia a TRAIL por las células cancerosas. Hemos informado anteriormente de que la vía de Hedgehog es constitutivamente activa en estas células y que su inhibición sensibiliza a las células colangiocarcinoma a la citotoxicidad TRAIL coincidiendo con la regulación del receptor de TRAIL DR4 [19]. Sin embargo, no estaba claro cómo la regulación de DR4 por sí sola podría superar el MCL-1 bloqueo de la vía mitocondrial de la apoptosis. En este estudio, hemos demostrado que la baja regulación de XIAP por la inhibición Hedgehog convierte Tipo II señalización TRAIL a una vía de tipo I. Por lo tanto, nuestros datos definen un mecanismo por el cual la señalización Hedgehog modula la muerte celular inducida por TRAIL en células de cáncer y sugieren la inhibición de esta cascada como un posible abordaje terapéutico para tumores resistentes a TRAIL ..
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
el Comité IRB Clínica Mayo revisado y aprobado para los estudios humanos del protocolo titulado "análisis de la expresión del genoma humano del colangiocarcinoma (CCC)." el comité determinó que esto constituye la investigación de riesgo mínimo. Los datos fueron analizados de forma anónima.
Cell Cultura y
Las líneas celulares humanas colangiocarcinoma, KMCH, HuCCT-1, y Mz-cha-1, se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero fetal bovino, 100.000 unidades /L penicilina, 100 mg /L de estreptomicina y 100 mg /L de gentamicina como se describe anteriormente [20], [21].
reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcripción inversa (RT- PCR)
ARN total fue aislado de las células utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA), y el ADNc se preparó usando cebadores aleatorios y virus de la leucemia murina de Moloney la transcriptasa inversa como se ha descrito previamente en detalle [22]. El producto ADNc fue amplificado por PCR con polimerasa de ADN Taq utilizando protocolos estándar. Los cebadores de PCR se muestran en la Tabla 1. Los cebadores para 18S RNA ribosomal (rRNA) fueron adquiridos de Ambion Inc. (Austin, TX). PCR en tiempo real se realizó con el Roche LightCycler utilizando SYBR verde como el fluoróforo tal como se describe anteriormente [20]. El número de copias del ARNm diana en cada muestra se normalizó como una proporción con el número de copias de ARNr 18S en el denominador.
Análisis de inmunotransferencia
lisados de células enteras se obtuvieron como previamente descrito por nosotros en detalle [21]. Las muestras de proteína se resolvieron mediante geles de SDS-PAGE, se transfirieron a membranas de nitrocelulosa, y se transfirieron con los anticuerpos primarios indicados a una dilución de 1: 500 a 1: 1000. anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa (Biosource International, Camarillo, CA) se incubaron con una dilución de 1: 3.000 y 1: 5.000. Los anticuerpos unidos se visualizaron utilizando reactivos de quimioluminiscencia (Amersham, Arlington Heights, IL) y película Kodak X-OMAT (Eastman Kodak, Rochester, NY). antisueros primarios fueron los eleva a la actina, Bcl-2, Bcl-x, MCL-1, y Smoothened (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA: C11, B19, S18, S19, y H-300, respectivamente), Oferta y CIAP-1 (R & amp; D Systems, Minneapolis, MN), Bim y XIAP (BD Biosciences, San Jose, CA), y c-IAP2 (Novus Productos Biológicos, Littleton, CO). Para la cuantificación de proteína XIAP mediante inmunotransferencia, las películas se analizaron por densitometría y la intensidad de señal relativa de la señal de XIAP se normalizó a la actina en tres experimentos separados.
Apoptosis
La apoptosis se cuantificó mediante tinción morfológicamente los núcleos con 4 ', dihidrocloruro de 6-diamino-2-fenilindol (DAPI). Los cambios nucleares característicos de la apoptosis (
es decir
. Condensación de la cromatina y fragmentación nuclear) se evaluaron mediante microscopía de fluorescencia utilizando longitudes de onda de excitación y emisión de 380 y 430 nm, respectivamente. Se empleó la caspasa-3/7 actividad en cultivos de células para evaluar la apoptosis bioquímicamente y se midió mediante la cuantificación de la liberación de fluoróforo a partir del sustrato de la caspasa-3/7 usando el Apo-ONE
TM homogénea caspasa-3/7 kit (Promega, Madison , WI).
ARN de interferencia
Una secuencia de ARN 21 nucleótidos de doble cadena específica complementaria al mensaje de destino se utiliza para silenciar humana CIAP-1, XIAP, Bak o Bax expresión. siRNAs dirigidos validados CIAP-1 o XIAP fueron adquiridos de Santa Cruz Biotechnology. siRNAs dirigidos Bak o Bax fueron diseñados y sintetizados utilizando el software disponible en www.ambion.com y el kit Silenciador siRNA Construcción de Ambion (Austin, TX). Las secuencias de siRNA empleadas para inhibir la expresión de Bax o Bak fueron los siguientes:
Bak, España 5'-AAG TAC GAA GAT TCT TCA AAT CCT GTC TC-3 ';
Bax, España 5'-AAG TGG ACG AAC ACA ACA GTA CCT GTC TC-3 '(secuencia de promotor T7 parcial está en negrita). Como control, las células fueron transfectadas con un dúplex de ARN codificado con la siguiente secuencia: 5'-AAC GTG ATT TAT GTC ACC AGA-3 '. Brevemente, las células cultivadas en placas de 6 pocillos se transfectaron transitoriamente con 30 nM de ARNsi utilizando 5 l /ml SIPORT
TM NeoFX
TM (Ambion Inc.). expresión de la proteína diana se evaluó mediante análisis de inmunotransferencia después de la transfección con el siRNA.
horquilla corta de ARN (shRNA) para la subasta fue de Sigma Aldrich [misión de corto plásmido lentiviral ARN de horquilla, apuntando a los nucleótidos 376-396, Banco de Genes acceso#NM_001196 ]. Para generar el Bim dirigido shRNA constructo, se empleó el plásmido pSSH1 que contiene el promotor H1 humana para la expresión de shRNA. Una plantilla de ADN de doble cadena (5'-GAT CCC CGC AAT AGG CTT TAG GAA AAT TCA AGA GAT TTT CCT AAA GCC TAT TGC TTT TTG GAA A-3 ') fue insertado en el plásmido pSSH1 después de que el promotor de ARN H1. El inserto de ADN contiene secuencias sentido y antisentido (negrita) para el ARNm Bim y una secuencia de engarce 9-nucleótido, dando la transcripción de un shRNA orientación Bim. Para la transfección estable, las células fueron transfectadas utilizando KMCH OPTI-MEM I (GIBCO-Invitrogen, Carlsbad, CA) que contiene 5 l /ml LipofectAMINE 2000 (Invitrogen), y el ADN plásmido 3 mg /ml. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, se añadió medio fresco que contiene 2 mg /ml de puromicina para shRNA plásmido oferta de orientación o 1,2 g /L de neomicina se añadió a la orientación shRNA plásmido Bim. clones supervivientes se separaron usando anillos de clonación y se cultivaron individualmente. partículas de lentivirus que contenían shRNA al SMO se construyeron utilizando el sistema de bloqueo-iT inducible H1 Lentiviral RNAi (Invitrogen), siguiendo el protocolo del fabricante. (Secuencias insertadas en pLenti4 /BLOCK-iT-DEST) se representan como se ha descrito previamente por nosotros [19]. Para la transfección estable, medio fresco que contiene 10 mg /ml blasticidine-S y se añadió a las células 500 mg /ml de zeocina (Invitrogen) 48 horas después de la transducción. clones supervivientes se separaron usando anillos de clonación y se cultivaron individualmente. La expresión se indujo con 1 mg /ml de tetraciclina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Después de 48 horas adicionales se utilizaron células para los experimentos. la supresión de destino se evaluó mediante análisis de inmunotransferencia.
ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA)
extractos de células nucleares se prepararon utilizando NE-PER reactivos de extracción nucleares y citoplasmáticos (Pierce, Rockford, IL) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para la EMSA, 20 g de proteínas nucleares se incubaron a temperatura ambiente durante 20 min en tampón de unión (HEPES mM, pH 7,5, 0,1 M NaCl, EDTA 2 mM, 6% de glicerol, 0,1%, de fenilmetilsulfonilo 25 Triton X-100 0,1 mM fluoruro, ditiotreitol 0,4 mM, 0,5 g /l de poli (dI-dC), 0,5 g /l de esperma de salmón) con 0,04 pmol de oligonucleótido marcado con Cy5.5-ADN de doble cadena (sintetizado por la Clínica Mayo avanzada Genómica Tecnología Core, Rochester MN), que contiene las secuencias de unión putativos GLI de tipo salvaje dentro de la región promotora del gen humano XIAP
. proteínas de ADN fueron separados de la sonda de ADN no unido mediante electroforesis a través de geles de poliacrilamida al 5% nativos que contienen 0,5X Tris borato-EDTA. La fluorescencia se visualizó directamente en el gel usando un reproductor de imágenes Odyssey fluorescente (Licor Biosciences, Lincoln, NE). Para ensayos de competición, se añadió un exceso molar de 200 veces de no marcado oligonucleótido de doble cadena a la mezcla de reacción 20 min antes de la adición de la sonda fluorescente.
Inmunoprecipitación de cromatina
ChIP se realizó a partir de células KMCH tratadas con 250 nM de sonic Hedgehog recombinante durante 5 horas utilizando ADN celular total esquilada de $ $ 500 pb fragmentos, utilizando el kit de ExactaCHIP inmunoprecipitación de la cromatina (amp I +; D Systems) siguiendo las instrucciones y muestras del fabricante fueron pre-limpiado usando perlas de agarosa, además de suspensión de esperma de salmón (Upstate, Lake Placid, Nueva York) antes de la inmunoprecipitación. cebadores de control positivo suministrados por el fabricante eran para el
Bcl-2
promotor (obligado por GLI1 y GLI2) y el
GLI1
promotor (obligado por GLI3). Los cebadores para la
XIAP
sitio del promotor lo fuera, FORW: 5 'TTACTGCAGCCTCCAACTCC; Rev:. 5 'CATCTCTCCATGCTCTGAACTC
Análisis estadístico
Todos los datos representan al menos tres experimentos independientes y se expresan como media ± SE. Las diferencias entre los grupos se compararon mediante ANOVA con corrección de Bonferroni post hoc
Materiales
Los reactivos se adquirieron a partir de los siguientes proveedores:. DAPI fue de Sigma; TRAIL recombinante humana recombinante y Sonic Hedgehog eran de I + amp; D Systems; anticuerpo Fas anti-humano (CH-11) era de MBL International (Nagoya, Japón); ciclopamina era de LC Laboratories (Woburn, MA).
Resultados
inhibición alisado regula a la baja la expresión de la CIAP-1 y XIAP
Dada una función mecánica fundamental para el inhibidor de la apoptosis proteínas (IAP) en la señalización del receptor de muerte [23] y el papel Hedgehog en la supervivencia celular, que primero determinarse si la inhibición de Smoothened (SMO), el componente de señalización del complejo receptor Hedgehog, modula la expresión de IAP. El tratamiento con ciclopamina, un inhibidor farmacológico bien establecido de SMO [24], [25], disminución de los niveles de proteína celular IAP-1 (CIAP-1) y ligada al cromosoma X IAP (XIAP), pero no tuvo efecto sobre la proteína CIAP-2 expresión. La baja regulación de XIAP fue más rápida, que se producen dentro de las 4 horas, mientras que la pérdida de la proteína de la CIAP-1 se produjo sólo después de 24 horas (Fig. 1A). El efecto farmacológico de la ciclopamina se validó mediante el uso de shRNA dirigido desmontables de SMO, un componente de señalización del receptor de hedgehog, que también disminuyó tanto a nivel CIAP-1 y la proteína celular XIAP, pero no CIAP-2 (Fig. 1B). Para determinar si la inhibición SMO afectó los niveles de ARNm o se condujo exclusivamente post-transcripcional,
CIAP-1 |,
CIAP-2
, y
se determinó la expresión de ARNm de XIAP
después del tratamiento con ciclopamina o shRNA al SMO. Tanto
XIAP
y
CIAP-1 | niveles de mRNA se redujeron por la inhibición SMO (Fig. 1C). La relevancia clínica de regulación IAP se evaluó en el tumor y las muestras benignas adyacentes de pacientes con colangiocarcinoma. Un aumento de dos veces en
XIAP
niveles de mRNA se observó en el tejido tumoral (Fig. 1D). Los niveles de
CIAP-1 | y
-2
no fueron significativamente diferentes. Que
CIAP-1 | no está elevada en las muestras tumorales pesar de regulación por parte del erizo (Fig. 1C) puede indicar adicional que aún no establecidas factores también contribuyen al control de la expresión de IAP en el tumor. Estos datos sugieren que la vía de señalización Hedgehog regula
CIAP-1 | y
XIAP
expresión, pero que sólo
XIAP
niveles están elevados en muestras clínicas. Por lo tanto, nos hemos centrado en gran medida en
XIAP
para el resto de nuestros estudios.
Una de búsqueda de células lisados de células KMCH tratados con ciclopamina (5 M) durante los tiempos indicados fueron immunoblotted de la CIAP-1, CIAP-2 y XIAP. Actina se utilizó como control de carga.
B, células KMCH fueron transfectadas con un vector de expresión inducible por tetraciclina shRNA focalización smoothened (shSMO) o un vector shRNA revueltos; Se indujo la expresión de shRNA durante 48 horas por tratamiento con tetraciclina (1 mg /ml) seguido de inmunotransferencia para la CIAP-1, CIAP-2 y XIAP usando lisados de células enteras.
C
, las células fueron tratadas con vehículo, ciclopamina (5 M) durante 24 horas, o transfectadas con shSMO como en el panel
B, después se analizaron por tiempo real de RT-PCR para
CIAP-1 |,
CIAP-2
y
XIAP
utilizando ARN total.
D
, se utilizó ARN total de muestras de tejido de cualquiera de colangiocarcinoma (CCA) o benigno del hígado adyacente a evaluar
XIAP, CIAP-1, y-2 CIAP expresión
mRNA, normalizado a 18S y expresada como factor de cambio de ser benigno. La media ± SEM, * p & lt; 0,05; ** P & lt; 0,01; *** P & lt; 0,001 en comparación con el vehículo
GLI2 se une a la
XIAP
promotor y regula su expresión
Para determinar si
XIAP
está transcripcionalmente regulados por factores de transcripción GLI-erizo de respuesta, se realizaron búsquedas en la región 5'-flanqueante 5 Kb de lo humano
XIAP
gen de la
GACCACCCAXXXXG
-3 'GLI consenso 5' motivo de unión. Dos candidatos prometedores sitios de unión de GLI-(Fig. 2A) se identificaron aguas arriba de la
XIAP
sitio de inicio de la transcripción (NM_001167) en las posiciones -2820 /-2807 (sitio I) y -1594 /-1581 (Sitio II ). Cada uno tenía dos desajustes en comparación con la secuencia de consenso [26]; Sitio I es idéntico al sitio validado 9 nucleótidos Bcl-2 GLI-unión, Bs1 [27], mientras que el Sitio II es idéntico al sitio de unión a DR4 GLI confirmado [19]. Se realizó experimentos de movilidad electroforética cambio de ensayo. La unión a las dos secuencias de unión de GLI putativos se observó en los extractos nucleares de células KMCH. El cambio de la movilidad de la sonda CY 5.5 marcado con podría evitarse mediante la adición de un exceso molar de 200 veces de la sonda no marcada (competidor; Fig. 2B). De los tres miembros de la familia de GLI, siRNA a GLI2 causó una disminución significativa en la expresión de proteína XIAP mientras siRNA a GLI1 o GLI3 no alteró los niveles de XIAP (Fig. 2C). Para determinar si se unen al IGL
XIAP
promotor, hemos realizado experimentos de inmunoprecipitación de la cromatina para evaluar la ocupación de la endógena de
XIAP
promotor usando anticuerpos contra GLI1, GLI2, y GLI3. La unión de GLI2 se observó utilizando cebadores que amplifican Sitio I (Fig. 2D). Control de IgG no dió un producto, lo que demuestra la especificidad de los antisueros utilizados, y control positivo promotor sitios demostró la ocupación esperada por GLI1 y GLI2 (
Bcl-2
promotor), y GLI3 (
GLI1
promotor). Estos datos sugieren que Hedgehog regula directamente
XIAP
expresión por el factor de transcripción GLI2 unión al Sitio I en el
XIAP
promotor.
A, España putativos GLI los sitios en la región promotora XIAP unión. las posiciones de nucleótidos fueron contados a partir del sitio de inicio de transcripción (TSS). Se observaron sitios de unión potenciales como se indica por las flechas en el esquema (I y II).
B, extractos de proteínas nucleares se aislaron a partir de células KMCH. EMSA se realizó utilizando oligonucleótidos de doble cadena marcados con Cy5.5 que contienen las secuencias de unión de GLI putativos dentro del promotor XIAP humana, y los experimentos de competición con oligonucleótidos frías exceso molar de 200 veces como se describe en "Materiales y métodos".
C
, la proteína celular total fue aislado 48 horas después de la transfección transitoria con el siRNA se indica frente a miembros de la familia de GLI. expresión de la proteína XIAP se determinó por inmunotransferencia y la señal se cuantificó por densitometría como una relación a la expresión de actina.
D inmunoprecipitación, España cromatina utilizando antisuero para GLI1, GLI2, GLI3, o una IgG control se realizó seguido por PCR utilizando cebadores que flanquean el sitio I (341 pb) en el
XIAP
región promotora, como indicado. Como control positivo, el chip se realizó utilizando cebadores que flanquean el sitio
Bcl-2
promotor GLI-unión (GLI1 y GLI2), o cebadores que flanquean el sitio de unión GLI3 dentro del
GLI1
promotor.
Sensibilización por la inhibición del erizo es independiente de los mediadores de apoptosis mitocondrial, Bid /Bim o Bax /Bak
XIAP es un discriminador clave para la conversión de tipo II a tipo I la muerte de señalización de receptores [9 ], por lo tanto, se consideró que la pérdida de proteína XIAP como un mecanismo por el cual las células sensibilizadas colangiocarcinoma inhibición erizo a la apoptosis inducida por TRAIL. Oferta y Bim son intermediarios clave de señalización de tipo II proapoptótico de señalización del receptor de muerte [28], [29]. Sobre la base de esta información, el próximo averiguamos si la inhibición del erizo células sensibilizadas a la citotoxicidad TRAIL en la ausencia de la subasta o Bim. shRNA orientación construcciones de la subasta y Bim eficiente derribado los respectivos niveles de proteínas celulares (Fig. 3A). El silenciamiento casi completa de la oferta o Bim los niveles de proteína se confirmó funcionalmente mediante el aprovechamiento de la observación de que la señalización del receptor Fas Tipo II muerte depende de la subasta o Bim [30]. De hecho, Bid o knockdown Bim fue suficiente para inhibir la muerte celular inducida por Fas por el anticuerpo agonista CH-11 (Fig. 3B y 3C), un clásico vía de Tipo II de la muerte celular [31]. Por lo tanto, si la muerte celular inducida por TRAIL en células sensibilizadas con ciclopamina era dependiente de la señalización de tipo II, luego de la subasta o Bim silenciamiento debe proteger de manera similar de la citotoxicidad TRAIL. Sin embargo, a pesar de la ausencia de la subasta o Bim, la ciclopamina inhibidor erizo aún sensibilizado células colangiocarcinoma humanos a la muerte celular inducida por TRAIL (Fig. 3D y 3E).
A, España El análisis por inmunotransferencia se realizado en lisados de células enteras obtenidas a partir de células transfectadas de forma estable con KMCH del shRNA específicos dirigidos
de la subasta
o
Bim, España utilizando antisueros indicada. Actina se utilizó como control de carga.
B
, las células transfectadas de manera estable con KMCH bid o Bim-shRNA y las células parentales no transfectadas KMCH fueron tratados con Fas anticuerpo agonista CH-11 (100 mg /ml) durante 5 horas, seguido de tinción DAPI. se contaron las células con morfología apoptótica. Media ± SEM, *** p & lt; 0,001 en comparación con células parentales tratadas con CH-11.
C, España Paralelamente, se midió la actividad de caspasa-3/7 en las células tratadas como en el panel
B Opiniones. La media ± SEM, *** p & lt; 0,001.
D
, las células transfectadas de manera estable con KMCH bid o Bim-shRNA fueron pretratados con vehículo o con ciclopamina (5 M) durante 24 horas, y después se trató con TRAIL (5 ng /ml) durante 5 horas seguido de DAPI tinción. se contaron las células con morfología apoptótica. Media ± SEM, *** p & lt; 0,001 en comparación con las células tratadas con TRAIL solo.
E
, líneas celulares estables KMCH fueron tratados como en el panel
D
, y después de 5 horas de la caspasa-3 se midió /7 actividad. Media ± SEM, *** p & lt; 0,001 en comparación con las células tratadas con TRAIL solo.
F
, lisados de células enteras de KMCH, HuCCT-1, y las células 1 Mz-cha-tratados con vehículo o ciclopamina (5 M) durante 24 horas se analizaron por inmunotransferencia utilizando anti-Bcl-2, Mcl- 1, o Bcl-x antisueros. Actina se utilizó como control de carga.
G
, los lisados de células enteras se obtuvieron de shBid-, shBim- y las células parentales no transfectadas KMCH tratados con vehículo o con ciclopamina (5 M) durante 24 horas y se analizaron por inmunotransferencia usando anti-Bcl-2, Mcl- 1, o Bcl-x antisueros. Actina se utilizó como control de carga.
Debido a un desequilibrio entre proteínas y anti-familia Bcl-2 pro-apoptóticos por ciclopamina podría explicar sus efectos en la sensibilización de las células a la muerte TRAIL, perfilamos esta clase de proteínas por análisis de inmunotransferencia. Bcl-x
expresión de la proteína L fue significativamente menor en las células KMCH que las células HuCCT-1 o Mz-cha-1, pero ninguna de las tres proteínas anti-apoptóticas (Bcl-2, Mcl-1, o Bcl-x
L) fue alterada por el tratamiento con ciclopamina (Fig. 3F). Ciclopamina también no alteró los niveles de proteínas celulares de las proteínas de la familia Bcl-2 anti-apoptóticas en células transfectadas de forma estable con KMCH orientación shRNA Oferta o Bim (Fig. 3G). Del mismo modo, la inhibición SMO no altera BH3-sólo las proteínas o proteínas de la familia Bcl-2 pro-apoptóticos, Bax y Bak [19]. Tomados en conjunto, estos datos sugieren que la inhibición de la vía de Hedgehog sensibiliza a las células colangiocarcinoma humanos a la citotoxicidad TRAIL mediante un proceso independiente de la subasta o Bim o alteraciones en la expresión de proteínas de la familia Bcl-2 multidominio. La independencia de la subasta o Bim sugiere la intrigante posibilidad de que la ciclopamina puede sensibilizar las células a colangiocarcinoma TRAIL mediante la conversión de la señalización apoptótica de un tipo II a una vía del receptor de muerte de tipo I.
Para probar esta hipótesis, se determinó a continuación si erizo la inhibición de la señalización del receptor convierte Tipo II muerte al Tipo I de señalización. La condición sine qua non de la señalización del receptor de muerte de tipo I es su falta de dependencia de Bax y Bak [32]. desmontables eficiente de los niveles de proteína Bax y Bak se logró mediante siRNA dirigidos (Fig. 4A). knockdown dirigida de Bax más Bak proteína funcionaba para inhibir la apoptosis mediada por Fas por CH-11 (Fig. 4B y 4C), en consonancia con la señalización de Tipo II. TRAIL solo tuvo un pequeño efecto apoptótico sobre las células KMCH que fue bloqueada eficazmente por Bax /Bak silenciamiento, lo que indica que TRAIL normalmente mata las células colangiocarcinoma por la vía de tipo II (Fig. 4D). Sin embargo, la apoptosis inducida por TRAIL-se incrementó dramáticamente por ciclopamina (Fig. 4D y 4E). El aumento de la apoptosis estaba completamente (Fig. 4E) o casi por completo (Fig. 4D) insensible a Bax /Bak silenciamiento. Estos datos sugieren que la inhibición Hedgehog evita la resistencia a la citotoxicidad mitocondrial TRAIL mediante la conversión de una señalización de tipo II a tipo I vía de señalización.
A,
lisados de células enteras a partir de células transfectadas transitoriamente KMCH con siRNA la orientación Bax y /o Bak o siRNA revueltos se obtuvieron 48 horas después de la transfección y se analizaron por inmunotransferencia usando anti-Bax o antisueros anti-Bak. Actina se utilizó como control de carga.
B
, las células KMCH transfectadas transitoriamente con Bax- y Bak-siRNA o se trataron previamente siRNA revueltos (24 horas) con medio o con ciclopamina (5 mM) como se indica, después se trató con Fas anticuerpo agonista CH-11 (100 g /ml) durante 5 horas. se contaron las células con morfología nuclear apoptótica. La media +/- SEM; *** P & lt; 0,001.
C,
células KMCH fueron tratados como en el panel
B Opiniones y actividad de caspasa-3/7 se midió después de 5 horas. La media +/- SEM; *** P & lt; 0,001
D
, las células transfectadas transitoriamente con KMCH Bax- y Bak-siRNA o siRNA revueltos fueron pretratadas con vehículo o con ciclopamina (5 M) durante 24 horas, y luego tratados con TRAIL (5 ng /ml) durante 5 horas. se contaron las células con morfología nuclear apoptótica. Media ± SEM,#p & lt; 0,05 y *** p & lt; 0,001 en comparación con las células transfectadas con siRNA revueltos y tratados con TRAIL.
E
, células KMCH transfectadas transitoriamente con siRNA indicado y tratados como en el panel
D
, se ensayaron después de 5 horas de la caspasa-3/7 actividad. La media ± SEM; *** P & lt;. 0.001
Desmontables de
XIAP
ha sensibilizado células colangiocarcinoma a la apoptosis inducida por TRAIL pesar de la inhibición de la subasta
A continuación, se determina la relevancia funcional de XIAP expresión en estas células cancerosas utilizando desmontables de
CIAP-1 | o
XIAP. focalización
eficiente de la CIAP-1 y la proteína XIAP expresión se confirmó mediante análisis de inmunotransferencia (Fig. 5A siRNA dirigidos ). De acuerdo con informes anteriores [33], [34], [35], [36], desmontables de
XIAP
sensibilizados significativamente las células a la citotoxicidad TRAIL, mientras que desmontables de
CIAP-1 solamente de
modestamente sensibilizado a las células de la muerte celular inducida por TRAIL, medido ya sea morfológicamente (Fig. 5B) o bioquímicamente (Fig. 5C). Por lo tanto, la regulación de la expresión de XIAP es un posible mecanismo por el cual señalización de Hedgehog impide citotoxicidad TRAIL.
KMCH células fueron transfectadas con siRNA codificado o siRNA para
CIAP-1 | o
XIAP
.
Un
, lisados de células enteras se prepararon para la inmunotransferencia de células KMCH 48 horas después de la transfección de siRNA.
B Opiniones, Cuarenta y ocho horas después de la transfección como en el panel
Un
, las células se trataron con TRAIL recombinante humana (5 ng /ml) o medio durante 5 horas. Las células fueron teñidas con DAPI y las células con morfología nuclear apoptótica se contaron y se expresaron como un porcentaje de núcleos totales.
C, España En paralelo, se transfectaron y se trataron con TRAIL como en el panel células
B Opiniones, y después de 5 horas se midió la actividad de caspasa-3/7. La media ± SEM, * p & lt; 0,05; ** P & lt; 0,01; *** P & lt;. 0.001
Los datos anteriores son consistentes con un interruptor de tipo II a tipo I apoptosis mediada por receptor por inhibición SMO; la inhibición SMO parece mediar este interruptor por XIAP
expresión génica
abajo de la regulación. Para probar esta interpretación de los datos, se diseñaron experimentos para determinar si la precipitación de la proteína XIAP fue suficiente para convertir la señalización de TRAIL a una vía independiente de las mitocondrias, Tipo I. Empleamos un inhibidor de molécula pequeña de la subasta, BI-6C9, para eludir la muerte celular mitocondrias dependiente [37]. En primer lugar, para confirmar que BI-6C9 muerte celular funcionalmente inhibido en este sistema, las células KMCH se pre-trata con BI-6C9 o vehículo (DMSO), seguido por Fas anticuerpo agonista. De hecho, la inhibición farmacológica de la subasta por BI-6C9 era suficiente para reprimir la apoptosis inducida por Fas. Una vez más, la inhibición SMO no afectó a la apoptosis mediante el tratamiento CH-11 (Fig. 6A). Por el contrario, BI-6C9 no inhibió la muerte celular funcionalmente inducida por TRAIL en las células tratadas con ciclopamina (Fig. 6B). Es importante destacar que siRNA dirigido contra XIAP células también sensibilizados a la apoptosis inducida por TRAIL, y BI-6C9 no mitigó la muerte celular (Fig. 6C). Así, la inhibición SMO, por la disminución de los niveles celulares de proteína XIAP, convierte Tipo II TRAIL receptor de muerte de señalización a una vía de tipo I; un efecto recapitulado por siRNA dirigidos desmontables de
XIAP
.
, España celdas A KMCH se incubaron durante 24 horas en un medio o ciclopamina (5 M), seguido de tratamiento con cualquiera vehículo (DMSO, concentración final 0,1% v /v) o el inhibidor de la subasta, BI-6C9 (10 M) durante 1 hora.