Extracto
Antecedentes
PPAR-gamma del receptor (PPAR) agonistas, tales como los thiazolinediones (TZDs), han sido estudiados por su uso potencial como agentes terapéuticos del cáncer. Se investigó el efecto de cuatro TZDs rosiglitazona (Rosi), ciglitazona (CGZ), troglitazona (TGZ) y pioglitazona (Pio) -en la proliferación de células de cáncer de ovario, la expresión de PPAR y la actividad de luciferasa PPAR. Hemos estudiado si las TZD actúan de una manera dependiente o independiente PPAR mediante la utilización de técnicas moleculares para inhibir la actividad o sobreexpresan PPAR.
Principales conclusiones
El tratamiento con CGZ o TGZ durante 24 horas disminución de la proliferación en tres de ovario líneas celulares de cáncer, OVCAR3, Caov3, y SKOV3, mientras que Rosi y Pio no tuvieron efecto. Esta disminución en la proliferación celular OVCAR3 se debió a una mayor fracción de las células en el G
0 /G
1 etapa del ciclo celular. tratamiento CGZ y TGZ aumento de la apoptosis después de 4 horas de tratamiento, pero no después de 8 o 12 horas. El tratamiento con TGZ o CGZ aumento de la expresión de PPAR mRNA en células OVCAR3; sin embargo, los niveles de proteína se mantuvieron sin cambios. Sorprendentemente, luciferasa ensayos promotor revelaron que ninguno de los TZD aumento de la actividad PPAR. La sobreexpresión de PPAR de tipo salvaje incrementó la actividad del indicador. Esto fue aumentada aún más por TGZ, Rosi, y Pio lo que indica que estas células tienen la capacidad endógena para mediar PPAR transactivación. Para determinar si PPAR media la disminución inducida por TZD en la proliferación, las células se trataron con CGZ o TGZ en ausencia o presencia de un dominante negativo (DN) o sobreexpresión de tipo salvaje PPAR constructo. Ni vector cambió la proliferación celular TZD mediada sugiriendo este efecto de TZD en las células de cáncer de ovario puede ser PPAR independiente.
Conclusiones
CGZ y TGZ causar una disminución en la proliferación de células de cáncer de ovario que es PPAR? independiente. Este concepto es apoyado por el hallazgo de que un DN o sobreexpresión de tipo salvaje PPAR no afectaron a los cambios en la proliferación celular y el ciclo celular
Visto:. Al-Alem L, Southard RC, Kilgore MW, Curry TE (2011) específica Línea celular Las tiazolidinedionas inhibir el cáncer ovárico proliferación y provocar la detención del ciclo celular de una manera independiente de PPAR. PLoS ONE 6 (1): e16179. doi: 10.1371 /journal.pone.0016179
Editor: Irina Agoulnik, Universidad Internacional de la Florida, España Estados Unidos
Recibido: 17 Agosto, 2010; Aceptado 14 de diciembre de 2010; Publicado: 21 Enero 2011
Derechos de Autor © 2011 Al-Alem et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por los Institutos nacionales de Salud (los números de subvención CA95609, HD057446 y RR15592). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de ovario es la quinta causa principal de muerte por cáncer en las mujeres. De los tres tipos principales de cáncer de ovario (epitelial, células germinales y cordones sexuales cánceres estromales), el cáncer epitelial de ovario representa aproximadamente el 90% de todos los casos, y es la primera causa de muerte por tumores malignos ginecológicos [1], [2] . A pesar de una intensa investigación sobre el cáncer de ovario con nuevos objetivos están investigando constantemente, los objetivos del tratamiento siguen siendo escasos. Uno de los retos en la investigación del cáncer de ovario es la ausencia de un modelo animal experimental que recapitula la enfermedad humana que puede ser manipulado experimentalmente [1], [3]. Por lo tanto, se han empleado líneas celulares de cáncer de ovario para entender los procesos fundamentales implicados en el crecimiento de células de cáncer, la diferenciación y la proliferación. El presente estudio utilizó tres células de cáncer de ovario, OVCAR3, Caov3 y Skvo3, que se derivan de cáncer epitelial de ovario humano [4], [5] para seguir analizando las modalidades terapéuticas en el crecimiento y la proliferación de células cancerosas.
Uno de los objetivos terapéuticos bajo investigación para el cáncer de ovario es receptores nucleares. Los fármacos que activan o inhiben los receptores nucleares se han utilizado para el tratamiento de muchas enfermedades. De hecho, alrededor del 13% de los fármacos actualmente en el mercado objetivo los receptores nucleares [6]. PPAR es un receptor nuclear altamente conservadas [7] expresa en todo el cuerpo [8] y se sobreexpresa en muchos cánceres, incluyendo el de ovario y cáncer de mama, por lo que es un jugador potencialmente importante en el desarrollo del cáncer.
Endógeno ligandos de PPAR aún se desconocen, pero los candidatos bien caracterizados incluyen ácidos grasos poliinsaturados, prostaglandina J
2 (PGJ
2) y ácido araquidónico [9]. ligandos de PPAR sintéticos incluyen las tiazolidinedionas (TZD), que constan de rosiglitazona (Avandia ®), troglitazona (Rezulin®), pioglitazona (Glustin ® /Actos®), y ciglitazona, todos los cuales han sido elaborados y /o utilizados para tratar el tipo II diabetes [10], [11], [12]. El uso de TZD como un enfoque terapéutico en el cáncer se ha investigado pero los resultados han sido controvertida [13], [14], [15]. En este estudio hemos utilizado los enfoques moleculares, fisiológicos y farmacológicos para investigar el efecto de los cuatro TZD diferentes en las células de cáncer de ovario y determinar si estos efectos son PPAR dependiente o independiente.
Resultados
OVCAR3, líneas celulares de cáncer de ovario Caov3 y SKOV3 expresan PPAR?
con el fin de determinar si las células de cáncer de ovario expresan PPAR, se realizó PCR en tiempo real y análisis de Western blot. No había expresión de PPAR diferencial en las tres líneas celulares diferentes tanto en el ARNm y los niveles de proteína. Mientras que la expresión de PPAR mRNA fue mayor en las células SKOV3 (Figura 1A), las células SKOV3 tenían los niveles más bajos de proteína PPAR (Figura 1B). Por el contrario, OVCAR3 tenían niveles bajos de expresión de PPAR mRNA pero abundante expresión de la proteína PPAR (Figuras 1A y 1B, respectivamente). actividad PPAR en las tres líneas celulares se examinó utilizando células transfectadas con un 3XPPRE-LUC-
Renilla
construir y comparación con las células transfectadas con luciferasa y
Renilla
construcciones que carecen de la PPRE. OVCAR 3 células exhibieron aproximadamente 2 actividad PPRE veces más endógeno en comparación con las células Caov3, mientras que las células SKOV3 mostraron 50% más de actividad PPRE comparación con las células OVCAR3 (Figura 1C)
.
(A) la expresión de ARNm (B) Expresión de proteínas y (C) PPRE actividad de la luciferasa. Los datos se normalizaron a los niveles de expresión de PPAR? Y actividad en las células OVCAR3. Los resultados son la media ± SEM de al menos 3 mediciones de tres experimentos individuales. Bares que no comparten una designación de letra son significativamente diferentes (
p Hotel & lt; 0,05). Las células transfectadas con Luc y Renilla construcciones que carecen de PPRE (PPRE -) fueron significativamente más bajos que la misma línea celular transfectada con PPRE-luciferasa de Renilla construye (PPRE +) mediante la prueba t de Welch (
p Hotel & lt; 0,05) .
receptor de ácido retinoico (RXR) no es un factor limitante en la actividad de PPAR
PPAR se une a su pareja heterodimérica RXR antes de unirse al ADN [16]. RXR se sabe que se expresa constitutivamente en las células y se ha demostrado que heterodimerizarse con otros receptores, además de PPAR?, Tales como el receptor de la vitamina D [17]. Para que se active RXR, su ligando 9-
ácido retinoico cis gratis (9-
Cis
-RA) tiene que estar presente. Con el fin de asegurar que activa RXR no es un factor limitante en nuestros experimentos, las células se trataron con 9-
Cis
-RA. En estos experimentos, las células fueron transfectadas con diferentes construcciones de PPAR, incluyendo Δ467 que es un negativo dominante forma (DN) de PPAR [18], [19], así como sobre la forma de expresión de tipo salvaje PPAR (OE) que se utiliza para aumentar la expresión de PPAR. Se utilizó una forma DN de PPAR lo largo de estos estudios basados en experimentos iniciales que reveló que DN transfección disminuyó la actividad PPRE 40% por debajo de los niveles en células transfectadas con ShRNA PPAR (datos no mostrados). Con el fin de asegurar que se sobreexpresa PPAR ya sea en forma DN o OE en comparación con las células control (es decir, las células transfectadas con PGL3), expresión de la proteína PPAR se midió usando análisis de transferencia Western. Como era de esperar hubo una marcada inducción tanto de la forma DN y OE de PPAR (Figura 2A inserto). Después de la transfección con el control, DN o vector OE, las células se trataron posteriormente con el control del vehículo o 1 M de 9-
Cis
-RA durante 24 horas en la oscuridad. Hemos observado que la presencia de 9-
Cis
-RA no afectó a la actividad del ensayo de indicador de PPAR en 3 células Ovcar, lo que indica que activado RXR no es un factor limitante en esta línea celular (Figura 2A). La adición de 9-
Cis
-RA a las células Caov3 no cambió la actividad PPRE hasta que se sobreexpresa PPAR (Figura 2B) lo que sugiere que RXR activado no es limitante hasta PPAR es muy abundante en esta línea celular. Sorprendentemente, en las células SKOV3, 9
Cis
-RA aumentado el ensayo de actividad de reportero PPAR en células de control (PGL3) pero no tuvo efecto cuando PPAR se expresó sobre comparación con el control (Figura 2C).
las células se doble transfectadas con un constructo PPRE y uno de los siguientes: vector vacío (PGL3), forma DN de PPAR (DN) o la forma de tipo salvaje de PPAR (OE). Después de la doble transfecciones, las células se trataron durante 24 horas con control de vehículo (DMSO) o 1 M de 9-
Cis
-RA en la oscuridad. la actividad de luciferasa PPRE se ilustra para (A) OVCAR3, (B) Caov3, y (C) SKOV3. Controles representan células que fueron transfectadas con el vector vacío y se trata con el control del vehículo, que se muestran como la primera barra en cada panel. Resultados para el ensayo de luciferasa PPRE son la media ± SEM de al menos 9 mediciones. Bares que no comparten una designación de letra son significativamente diferentes (
p Hotel & lt; 0,05). Inserte el Panel A: Western blot de la proteína PPAR en células OVCAR3 doble transfectadas con un constructo PPRE y, o bien el vector vacío, DN o OE PPAR construcciones y se trata con el control del vehículo durante 24 horas
CGZ y TGZ causa. una disminución en la proliferación celular
Para definir los efectos de los ligandos de PPAR sobre la proliferación celular, se realizaron ensayos de MTS. células OVCAR3 se trataron con concentraciones de 0, 0,1, 1 o 10 M de Rosi, CGZ, TGZ o Pio durante 24 horas. La concentración máxima TZD usado fue 10 mM ya que las acciones específicas de PPAR se reportan con TZDs a concentraciones ≤10 mu M [20] y las concentraciones más altas se sabe que inducen la muerte celular [21]. La administración de los cuatro TZDs dio lugar a diferencias en la proliferación celular. El tratamiento con CGZ disminución de la proliferación del 80%, TGZ causado una disminución 65%, mientras que Rosi y Pio no tuvieron ningún efecto sobre la proliferación (Figura 3A-D barras negras). En un esfuerzo para entender si la disminución en la proliferación tras el tratamiento TZD es común en otras células de cáncer de ovario, se exploró el tratamiento TZD de Caov3 y SKOV3. Una disminución similar en la proliferación se ve en estas líneas de células cuando se tratan con CGZ y TGZ a 10 micras. células Caov3 muestran una disminución del 80% y 30% en la proliferación celular cuando se trata con CGZ y TGZ, respectivamente (Figura 3A-B). células SKOV3 muestran un 45% y 35% de disminución cuando se tratan con 10 mM CGZ y TGZ, respectivamente (Figura 3A-B). De manera similar a las células OVCAR3, células Caov3 y SKOV3 tratados con Rosi o Pio no mostraron un cambio en la proliferación (Figura 3C-D).
células de cáncer de ovario se mueren de inanición de suero durante 24 horas y se trataron durante 24 horas adicionales con control de vehículo (DMSO) o 0,1, 1,0 o 10 mM de CGZ (A), TGZ (B), Rosi (C), o Pio (D). La proliferación celular se evaluó con el ensayo de MTS. Los resultados son la media ± SEM de al menos 3 mediciones de tres experimentos individuales. El análisis estadístico se llevó a cabo dentro de cada línea celular. Bares que no comparten una designación de letra son significativamente diferentes dentro de un grupo de tratamiento (
p Hotel & lt; 0,05). Las barras negras: OVCAR3, grises: Caov3, gris claro: SKOV3.
CGZ y TGZ disminución ADN incorporación de BrdU
El ensayo mide la actividad mitocondrial MTS en las células, lo cual es indicativo de su viabilidad [22] y se considera una evaluación indirecta de la proliferación celular. Sin embargo, hay un informe que el TZD puede interferir con el ensayo de MTS [23]. Por lo tanto, también medimos la tasa de replicación del ADN en células OVCAR3 utilizando la incorporación de BrdU como otro índice de la proliferación celular. células OVCAR3 fueron tratados con 0, 0,1, 1 o 10 M de Rosi, CGZ, TGZ o Pio durante 24 horas. ensayos de BrdU muestran resultados similares a los del ensayo MTS. Hubo aproximadamente un 70% de disminución en la proliferación en las células tratadas con 10 mM de CGZ o TGZ, y ningún efecto de Rosi o Pio sobre la proliferación celular (Figura 4A-D).
células OVCAR3 se mueren de inanición de suero durante 24 horas y se trataron durante 24 horas adicionales con el control de vehículo (DMSO) o 0,1, 1,0 o 10 mM de CGZ (a), TGZ (B), Rosi (C), Pio (D). La proliferación celular se evaluó con el ensayo de BrdU. Los resultados son la media ± SEM de al menos 3 mediciones de tres experimentos individuales. Bares que no comparten una designación de letra son significativamente diferentes dentro de un grupo de tratamiento (
p Hotel & lt; 0,05).
expresión de ARNm de PPAR se ve reforzada por el tratamiento con TZD de las células de cáncer de ovario
Para evaluar la asociación de estos ligandos con regulación de PPAR, se analizó el efecto de las TZD sobre la expresión de PPAR en células OVCAR3. Las células fueron tratadas con o se analizaron 24 horas después sin 10 mM de TZD y ARNm de PPAR y los niveles de proteína. PPAR (expresión se incrementó en las células OVCAR3 tratados con CGZ (6,9 veces) y TGZ (18,1 veces) (Figura 5A). Sorprendentemente, hubo un aumento en PPAR (proteína siguiente Rosi pero no CGZ o tratamiento TGZ (Figura 5B). En un esfuerzo por explicar esta discrepancia entre mRNA y expresión de la proteína, se determinó un curso de tiempo de PPAR (mRNA y expresión de la proteína. las células se trataron con los diferentes TZDs para 4, 8, 12 o 24 horas y tanto en tiempo real PCR y análisis de transferencia Western se llevaron a cabo. no observamos una correlación entre los patrones de expresión de PPAR (mRNA y proteína a través del tiempo lo que indica que hay potencialmente otros mecanismos que afectan a los niveles de PPAR (proteínas en estas células. una posibilidad es que las TZD aumentar el volumen de negocios y degradación de PPAR (proteína como se ve en otros sistemas [24], [25].
PPAR mRNA y expresión de proteínas se midieron en células OVCAR3 utilizando (a) PCR en tiempo real y (B) análisis de transferencia Western después de TZD . tratamiento las células fueron suero de hambre durante 24 horas y se trataron durante 24 horas más con el control del vehículo (DMSO) o una de las siguientes: 10 M de Rosi, CGZ, TGZ, o Pio. Los resultados son la media ± SEM de al menos 3 mediciones de dos experimentos individuales. Las barras con letras diferentes son significativamente diferentes (
p Hotel & lt; 0,05).
Desde CGZ y TGZ causaron una disminución de la proliferación celular en las células Caov3 y SKOV3, que mide la expresión del ARNm de PPAR en estas células. En las células Caov3, la expresión de ARNm de PPAR y después del tratamiento CGZ TGZ era 3,6 y 4,4 veces por encima del control de vehículo, respectivamente, aunque estos cambios no alcanzaron significación. células SKOV3 no mostraron cambios en la expresión de PPAR después del tratamiento con los TZDs (datos no mostrados). En conjunto, nuestros datos indican que PPAR (mRNA está presente y es regulado por TZD en las células de cáncer de ovario aunque en diferentes grados dependiendo del tipo de célula y el ligando se usa para activar PPARg.
CGZ y TGZ no inducen apoptosis
en este y en subsiguientes experimentos se examinó sólo las células OVCAR3 ya que estas células mostraron los efectos más notables cuando son tratados con TZD. Además, estas células se utilizan comúnmente en el estudio de cáncer de ovario, lo que facilita la comparación con estudios anteriores. en un intento de entender mejor el mecanismo de mediación de la disminución en la proliferación celular, se examinó si la apoptosis contribuye a esta disminución. se ha observado una disminución en la proliferación de células después de 24 horas de tratamiento (Figuras 3 y 4). Si esta disminución se debe a la apoptosis, a continuación, esta muerte celular debería haber ocurrido en un momento anterior. por lo tanto, hemos examinado el efecto de las TZD en las células OVCAR3 y determinamos si las células eran ya sea viable o apoptosis y estaban muertos a los 4, 8 ó 12 horas después del tratamiento utilizando el análisis FACS. Hubo un ligero aumento de células apoptóticas y muertas después de 4 horas de tratamiento con CGZ y TGZ (Figura 6A). Sin embargo, este aumento no se detectó en las muestras tratadas de 8 o 12 horas (Figura 6B y 6C). Trypan experimentos azul para confirmar vivo frente a las células muertas mostraron resultados similares (datos no mostrados).
células OVCAR3 se mueren de inanición de suero durante 24 horas y se trataron con control de vehículo (DMSO) o 10 mM de CGZ o TGZ para (A ) 4 horas, (b) 8 horas, o (C) 12 horas. Los resultados son la media ± SEM de 3 mediciones de tres experimentos individuales. barras de color gris claro representan células viables; barras de color gris oscuro representan las células sometidas a la apoptosis temprana y tardía, así como aquellos que están muertos. Bares que no comparten una letra o un número de designación son significativamente diferentes (
p Hotel & lt; 0,05) guía empresas
CGZ y TGZ causa la detención del ciclo celular
En una. , también se evaluaron esfuerzo para aclarar la razón subyacente a la disminución en la proliferación de los efectos de TZDs sobre la progresión del ciclo celular. Un aumento significativo de células en el G
0 /G
1 fase se observó después del tratamiento con TGZ y CGZ (Figura 7A). administración CGZ resultó en una disminución significativa en la fase G2 /M del ciclo celular (Figura 7B), mientras que no hay cambios en la fase S se observaron en las células tratadas con CGZ o TGZ (Figura 7C). Las células tratadas con Rosi o Pio no mostraron ningún cambio en la distribución del ciclo celular en comparación con el control (datos no mostrados).
células OVCAR3 se mueren de inanición de suero durante 24 horas y se trataron durante 24 horas adicionales con control de vehículo (DMSO ) o 10 mM de CGZ o TGZ. (A) T
0 /G
1, (B) G
2, (C) Fase S. Los resultados son la media ± SEM de al menos 3 mediciones de tres experimentos individuales. Bares que no comparten una letra o un número de designación son significativamente diferentes (
p Hotel & lt; 0,05).
Efectos de las TZD sobre la actividad de la luciferasa PPRE
Para aclarar si los efectos antiproliferativos de detención del ciclo celular y visto con ciertas TZDs son un efecto directo de PPAR transactivación, que las células con un plásmido 3XPPRE-MTK-pGL3-reportero transfectadas transitoriamente. Dos construcciones adicionales se cotransfectaron, a saber, una forma DN de PPAR y una sobreexpresión (OE) de un constructo de tipo salvaje PPAR. Las células fueron tratadas durante 24 horas con 10 mM de Rosi, CGZ, TGZ, o Pio. Ninguno de los tratamientos TZD solo aumentó la actividad de PPRE (Figura 8). Sin embargo, las células transfectadas con DN mostraron una disminución aproximada del 40% en la actividad mediada PPRE en ambas células tratadas no tratados y TZD. Además, el aumento de la expresión del tipo salvaje PPAR mostró un aumento en la actividad de luciferasa cuando las células se trataron con cualquiera de los cuatro TZDs diferentes en comparación con las células que sólo fueron tratados con TZDs (Figura 8A-8D).
OVCAR3 las células fueron transfectadas doble con una construcción de PPRE y uno de los siguientes: Vaciar vector, DN, o PPAR OE. Después de la doble transfecciones, las células se trataron durante 24 horas con control de vehículo (DMSO) o 10 mM de (A) CGZ, (B) TGZ, (C) Rosi, (D) o Pio. Los resultados son la media ± SEM de al menos 3 mediciones de tres experimentos individuales. Bares que no comparten una designación de letra son significativamente diferentes (
p Hotel & lt; 0,05).
Análisis de TZD mediada por acciones dependientes e independientes de PPAR
para determinar si los efectos de TZDs son PPAR dependientes, las células fueron tratadas con 10 mM TZDs en la ausencia o presencia de antagonistas de PPAR (GW9662, T007). El ensayo MTS se llevó a cabo con el fin de determinar si la presencia de antagonistas podría revertir los efectos de TZDs sobre la proliferación celular de cáncer de ovario. Los resultados mostraron que había un "rescate" parcial cuando las células fueron tratadas con el GW9662 (Figura 9A) o la T007 (Figura 9B) compuestos en combinación con CGZ o TGZ. Sin embargo, el patrón de acción era inconsistente entre los dos antagonistas e incluso con el mismo antagonista en presencia de diferentes TZD. Por ejemplo, T007 fue capaz de bloquear completamente los efectos de CGZ sobre la proliferación celular pero no tuvo efecto en la disminución mediada TGZ en la proliferación. Además, el uso de la GW9662 o los compuestos T007 solo no afectó a la proliferación en su propio como se esperaba. Esto puede ser debido al hecho de que estos antagonistas pueden ser agonistas mezclados o no PPAR específica [9], [26]. Estos hallazgos indican que el uso de un enfoque farmacológico empleo de antagonistas de PPAR reportados por sí solo no responder a la cuestión de si el efecto de los TZD actuar a través de PPAR. Esto nos llevó a utilizar un enfoque molecular utilizando DN o OE PPAR construye para investigar si los efectos observados en la proliferación celular y el ciclo celular fueron PPAR dependientes o independientes.
Las células fueron tratadas con GW9662 (A) o T007 (B se evaluó) durante 24 h y la proliferación celular. Los resultados son la media ± SEM de al menos 4 mediciones. Bares que no comparten una designación de letra son significativamente diferentes (
p Hotel & lt; 0,05).
transfección de células con formas DN o OE de PPAR sin la presencia de ligandos no cambió la proliferación celular como se indica por ensayos de BrdU (Figura 10). Más importante aún, los efectos de CGZ y TGZ sobre la proliferación no fueron superados por la presencia de la forma DN de PPAR (Figura 10). Los ensayos de luciferasa se llevaron a cabo en muestras en las mismas placas con el fin de asegurar que las células se estaban transfectadas y la expresión de la DN causaron la disminución prevista mientras que la sobreexpresión de PPAR de tipo salvaje aumento de la actividad PPRE, respectivamente (datos no mostrados). En concordancia con los ensayos de BrdU, datos del ciclo celular también indican que el efecto de CGZ y TGZ no son PPAR dependiente (datos no mostrados).
células OVCAR3 se doble transfectadas, privaron de suero durante 24 horas y se trató para una 24 horas más con el control del vehículo (DMSO) OR10 M de CGZ o TGZ. La proliferación celular se evaluó con un ensayo de BrdU. Los resultados son la media ± SEM de al menos 9 mediciones de tres experimentos individuales. Bares que no comparten una designación de letra son significativamente diferentes dentro de un grupo de tratamiento (
p Hotel & lt; 0,05).
Discusión
TZD se ha demostrado que tienen una amplia gama de efectos sobre las células cancerosas. El presunto objetivo de TZDs, PPAR, se sobreexpresa en una variedad de cánceres incluyendo cáncer de mama, pulmón, colon, próstata y ovario [2], [27], [28], [29]. Aunque, las TZD papel exacto y PPAR juegan en cáncer de ovario sigue siendo desconocida, este estudio demuestra que CGZ y TGZ tener acciones anti-proliferativos en tres líneas celulares de cáncer de ovario, mientras que Rosi y Pio no tienen ningún efecto. El hecho de que estas acciones anti-proliferativos se observan en las tres líneas celulares sugiere que esto es un fenómeno común y no se limita a una sola línea celular de cáncer de ovario. Los experimentos descritos en la presente memoria también demuestran que los cuatro TZD tienen acciones distintas en las células de cáncer de ovario posiblemente a través de ambos PPAR dependiente, así como vías independientes. Aunque varios informes indican que diferentes líneas celulares responden de manera diferente a las TZD, [30], [31], [32], [33], a nuestro entender, una comparación directa entre estos cuatro TZD en el cáncer de ovario y que delimitan si estos efectos son PPAR? dependiente utilizando enfoques moleculares, fisiológicos y farmacológicos no se ha investigado.
en el presente estudio, 10 M de CGZ y TGZ disminución de la proliferación celular en las tres líneas celulares de cáncer de ovario estudiados. Estas observaciones están en concordancia con otros estudios que utilizan las células de cáncer de ovario, así como otras líneas celulares donde CGZ y /o disminución de la actividad TGZ MTT [20], [21], [34]. Sin embargo, nuestros resultados están en contraste con líneas celulares de cáncer de otros tejidos como el de mama, tiroides, vejiga y otros que por lo general requieren concentraciones mucho más altas de TZD para provocar una respuesta biológica. De hecho, dosis de hasta 100 micras, lo que excedan las concentraciones específicos para ligando informado de 10 micras o menos [12], puede ser necesaria antes de una inhibición de la proliferación se ve [35], [36], [37], [38] , [39]. Sin embargo, estas diferencias pueden deberse en parte a la utilización de diferentes líneas de células o diferencias en las condiciones de cultivo de células, donde, por ejemplo, los investigadores han utilizado 1% de FBS [39], 5% de FBS [35], [36], [37 ], [38], [39] o 10% FBS [21]. Los presentes resultados demuestran que esta disminución en la proliferación se debe a un aumento en la detención del ciclo celular en lugar de un aumento de la apoptosis. Del mismo modo, otros informes han demostrado que las TZD conducen a la degradación de la ciclina D1 en el cáncer de próstata [40], lo que provoca la detención del ciclo celular, y una disminución en la proliferación de células tumorales. Del mismo modo, en las células de cáncer de ovario A2780, CGZ disminuye ciclina D1 junto con otros factores pro-supervivencia que resulta en la detención del ciclo celular [21]. Yang y colegas [20] informó de que el tratamiento CGZ y TGZ de las células de cáncer de ovario ES-2 y AP-1 resultó en la detención del ciclo celular; Sin embargo, este cambio en la cinética del ciclo celular se asoció con un aumento de los niveles de apoptosis. Aunque nuestros estudios apoyan los resultados anteriores en diferentes células de cáncer de ovario que las TZD disminuyen la proliferación celular mediante la detención de células en la fase G0 /G1 del ciclo celular, existe la posibilidad de que las concentraciones más altas de TZDs utilizados en estos estudios anteriores resultados en la inducción de la apoptosis [20].
el presente estudio demuestra que cada una de las TZD tiene acciones distintas sobre la proliferación de células de cáncer de ovario. CGZ y TGZ causar una disminución dramática en la proliferación de células de cáncer de ovario, mientras que Rosi y Pio no tuvieron efecto. Esto no es inesperado, ya que cada TZD tiene una afinidad diferente y la unión a PPAR [7], [41], recluta diferentes coactivators [42] y puede provocar respuestas celulares distintos. Estas acciones únicas han conducido al concepto de que las TZD son moduladores selectivos de PPAR y por lo tanto se dirigen a genes distintos que resulta en la selectividad de tejidos [12], [42], [43], [44]. Además, las TZD tienen diferentes especificidades para PPARs. Por ejemplo, Rosi y Pio se consideran los agonistas de PPAR más potentes de los cuatro TZDs utilizados en este estudio [11]. Los hallazgos que estos agonistas PPAR potentes no inhiben la proliferación celular apoyar aún más nuestra hipótesis de que las acciones de las TZD pueden ser independientes de PPAR. Además, Rosi, CGZ y TGZ son específicos de PPAR mientras Pio se ha demostrado que también activar PPAR [45], [46]. Por lo tanto, nuestros datos pueden reflejar las diferencias en la modulación selectiva de PPAR, las diferencias en la especificidad de PPAR, o la activación de distintas vías independientes de PPAR.
Para comenzar a entender la modulación selectiva de PPAR por TZD en ovárico las células cancerosas, se examinaron los perfiles de ARNm y la expresión de la proteína de PPAR y la activación del promotor de PPAR después del tratamiento con TZD. Hay un aumento espectacular en la expresión de PPAR mRNA cuando las células se trataron con OVCAR3 TGZ y en menor medida con CGZ y Rosi. En contraste, se observó la máxima expresión de la proteína PPAR cuando las células fueron tratadas con Rosi. Esta discordancia entre la expresión de PPAR mRNA y proteína después del tratamiento TZD no se ha observado ni examinado anteriormente, sin embargo, los niveles de proteína PPAR después del tratamiento TZD han demostrado ser altamente variable entre 1 Pa-células de cáncer ovárico ES-2 y [ ,,,0],21]. Postulamos que el examen de un punto de tiempo de 24 horas estática podría no capturar con precisión la inducción de PPAR mRNA y proteína. por lo tanto, se evaluó el nivel de ARNm de PPAR, así como los patrones de proteínas en diferentes momentos después del tratamiento TZD y observó una falta de correlación entre PPAR mRNA y expresión de la proteína en todos los puntos de tiempo. Una teoría alternativa para explicar esta discordancia es que el aumento de la expresión de PPAR mRNA cuando las células se tratan con TGZ puede aumentar el volumen de negocios y la degradación de la proteína PPAR reduciendo de ese modo la expresión de proteínas. Esto se ha demostrado anteriormente en otros sistemas en los que se demostró que con el aumento de dosis de TZD, hubo un aumento en PPAR degradación de la proteína que resultó en una disminución de los niveles de estado estacionario de la proteína en las células endoteliales [24], [25] . Esta es la hipótesis de que ocurra porque TZDs mediar cambios en el estado de fosforilación de PPAR por MEK que deja PPAR susceptible a la degradación [47]. A la luz de esta información, nuestros datos de proteínas podrían explicarse por el hecho de que causan la degradación diferencial TZD de PPAR (después de la activación y que la tasa de rotación del PPAR (proteínas en las células tratadas con TGZ es más rápida que la de CGZ y Rosi resultante en una disminución de los niveles de proteína. Además, es posible que Rosi aumenta la estabilidad de la proteína de PPAR (mientras que los efectos sobre la proliferación después del tratamiento con CGZ y TGZ se PPAR (independiente. Alternativamente, las TZD puede causar cambios en la proteína en sí, tales como la fosforilación, lo que altera otras acciones de la proteína en lugar de simplemente cambiando su transactivación general como demostrado recientemente por Choi et al. [48].
a la luz de nuestros resultados que mostró una falta de correlación entre los niveles de PPAR (mRNA y proteína después del tratamiento TZD, hemos explorado los cambios en la activación de un PPAR (reportero como un índice de PPAR (actividad después de la exposición TZD. Sorprendentemente, PPAR (actividad no fue estimulado por cualquiera de los 4 TZDs después de 24 h de tratamiento, en contraste con los informes anteriores en otras líneas celulares de cáncer de ovario que 50 mM de CGZ aumento de la actividad de la luciferasa de un reportero PPRE por 18 h [21]. Sobre la base de este informe anterior, especuló que la activación del promotor podría estar ocurriendo en puntos de tiempo más temprano o más tarde. Por lo tanto, hemos probado el efecto de las TZD sobre la actividad del promotor a las 4, 8, 24 y 32 horas. Hubo un modesto incremento en la actividad de luciferasa en las células tratadas con CGZ a las 8 y 32 horas (datos no mostrados), que eran insuficientes para dar cuenta de los cambios en PPAR (expresión. Discordancia entre los niveles de proteína y PPAR (actividad se ha visto anteriormente en el pecho células cancerosas, pero se desconoce el mecanismo exacto que subyace a esta diferencia [34]. Sin embargo, esta observación sugiere que el análisis de sólo los niveles de proteína PPAR erróneamente puede usarse para atribuir efectos celulares o la capacidad de respuesta a los tratamientos.
el TZD hizo no aumentar la actividad PPAR endógena en estas células, sin embargo, el tratamiento aumento de la actividad de la luciferasa TZD cuando PPAR se sobreexpresa en las células OVCAR3. Esto indica que estas células se activan constitutivamente PPAR y, cuando el receptor es muy abundante, la activación adicional es posible. Esta activación no es