Extracto
Antecedentes
El cáncer colorrectal (CCR) tiene la tercera mayor tasa de mortalidad entre la población de Estados Unidos. De acuerdo con el más reciente concepto de la carcinogénesis, los tumores humanos se organizan jerárquicamente, y la parte superior de la misma está ocupada por las células malignas madre (células madre del cáncer, células madre cancerosas o células iniciadoras del cáncer, AIC), que poseen ilimitada de auto-renovación y el tumor -initiating capacidades y alta resistencia a las terapias convencionales. Para reflejar la complejidad y diversidad de tumores humanos y para proporcionar modelos clínica y fisiológicamente relevante de cáncer, los grandes bancos de líneas celulares de bajo pasaje derivados del paciente caracterizados, y especialmente líneas celulares enriquecidas-CIC, se necesitan con urgencia.
principales conclusiones
Aquí mostramos el establecimiento de una novela enriqueció-CIC, altamente línea tumorigénico y clonogénico de células de cáncer de colon, CR4, derivado de las metástasis hepáticas. Esta línea celular estable se estableció mediante la combinación de cultivo 3D y 2D en medios de cultivo de células madre, subclonación de células con morfología en particular, co-cultivo con carcinoma asociado fibroblastos (CAF) y el trasplante de serie a los ratones NOD /SCID. El uso de RNA-Seq completa de perfiles de transcriptoma de la fracción tumorigénico de las células CR4 en comparación con las células tumorales a granel, se han identificado cerca de 360 transcripciones expresadas diferencialmente, muchos de los cuales representan stemness, pluripotencia y la resistencia al tratamiento. La mayoría de las células CR4 establecidas expresan marcadores comunes de la troncalidad, incluyendo CD133, CD44, CD166, EpCAM, CD24 y LGR5. El uso de inmunocitoquímica, FACS y análisis de Western blot, hemos demostrado que una proporción significativa de las células CR4 expresan marcadores clave de los marcadores de pluripotencia, incluyendo Sox-2, Oct3 /4 y c-Myc. sobreactivación constitutiva de transportadores ABC y NF-kB y la ausencia de los supresores de tumores p53 y p21 podría explicar en parte excepcional resistencia a los medicamentos de las células CR4.
Conclusiones
El altamente tumorigénicas y clonogénico CR4 enriquecido con CIC línea celular puede ofrecer una nueva herramienta importante para apoyar el descubrimiento de nuevos biomarcadores de diagnóstico y /o pronóstico, así como el desarrollo de estrategias terapéuticas más efectivas
Visto:. Rowehl RA, Burke S, Bialkowska AB, Pettet DW III, Rowehl L, Li E, et al. (2014) Establecimiento de alta Tumorígeno línea celular de cáncer colorrectal humano (CR4) con propiedades de cáncer de las células madre putativas. PLoS ONE 9 (6): e99091. doi: 10.1371 /journal.pone.0099091
Editor: Daotai Nie, Escuela de Medicina de la Universidad del Sur de Illinois, Estados Unidos de América
Recibido: 10 Enero, 2014; Aceptado: 10-may de 2014; Publicado: 12 Junio 2014
Derechos de Autor © 2014 Rowehl et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio recibió el apoyo de subvención Fusión TRO (IP Dr. Botchkina; 1104347-5-37298), del Centro del cáncer SBU, y SBU vicepresidente de Investigación (RSR 1111963-3-63845). De acuerdo con las condiciones de la fusión TRO, el Departamento de Patología, Instituto de Biología Química & amp; Drug Discovery (ICB & amp; DD) y la Fundación Simons también han contribuido en parte a este estudio. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal es la tercera tasa más alta de incidencia y mortalidad entre la población de Estados Unidos [1]. La actual falta de quimioterapias curativos y la tasa de deserción más alta de medicamentos contra el cáncer en comparación con otras enfermedades (sólo el 5% de los agentes que tienen actividad contra el cáncer en fase de desarrollo preclínico tienen licencia; [2]) crean una necesidad urgente de fuentes clínicamente relevantes de más fisiológica y las células del cáncer, así como para el más relevante
in vitro Opiniones y
in vivo y modelos. la investigación del cáncer tradicional y la evaluación preclínica de agentes contra el cáncer candidatos se basan en el uso de no seleccionada a largo plazo, de alto pasaje estableció líneas celulares de cáncer cultivadas como cultivos en monocapa. Sin embargo, a largo plazo
in vitro
mantenimiento conduce inevitablemente a la acumulación de los cambios genómicos y epigenómicos adicionales, así como la selección de las subpoblaciones de células dominantes. De hecho, se ha demostrado recientemente que las líneas celulares de cáncer establecidas más comúnmente utilizados no tienen correlación con muestras clínicas originales [3]. Esto sugiere que el uso de líneas celulares establecidas para el estudio de las alteraciones genómicas, el descubrimiento de dianas moleculares clínicamente relevantes, y el desarrollo de fármacos contra el cáncer es cuestionable, ya que el uso de estas líneas celulares no da cuenta de la complejidad y la fisiopatología de
in vivo
tumores.
está ampliamente aceptado que los tumores humanos se organizan jerárquicamente, y la parte superior de esta jerarquía es ocupada por las células madre malignas, las cuales poseen ilimitada auto-renovación y capacidades iniciadoras del tumor. De acuerdo con el más reciente concepto de la carcinogénesis, que ha revolucionado la comprensión de la tumorigénesis y el tratamiento del cáncer, única subpoblación fenotípica específica (s) de las células madre del cáncer (AIC) o células iniciadoras del cáncer (AIC) son responsables del desarrollo del tumor, la producción de todo el espectro de la progenie diferenciada que componen una masa tumoral, metástasis y resistencia a las terapias contra el cáncer [4] - [6]. Dichas células fueron recientemente aislados de todos los principales tipos de cáncer humano, incluidos los cánceres colorrectales [7] - [9]. Numerosos estudios han demostrado que los fenotipos específicos de células iniciadoras del cáncer de tumor madre-como son altamente resistentes a los medicamentos y son capaces de auto-renovación después de las intervenciones terapéuticas estándar [10] - [17]. Todas las consideraciones anteriores ponen de relieve el papel crucial de los CIC en el descubrimiento de dianas moleculares clínicamente relevantes y el desarrollo de fármacos contra el cáncer.
La identificación y caracterización de los CIC derivados del paciente, el desarrollo de una óptima
in vivo
y
in vitro
modelos preclínicos y análisis específicos-CIC de alteraciones inducidas por las drogas representan pasos críticos en la evaluación de nuevas terapias contra el cáncer. Es evidente también que con el fin de mantener la fidelidad adecuado para los tumores originales, las células iniciadoras del cáncer (AIC), así como otros tipos de células utilizadas para el perfilado genómica y proteómica, deben ser aislados de un amplio espectro de tumores primarios y metastásicos , no de las líneas celulares de cáncer establecidas. Sin embargo, es muy difícil de establecer líneas de células primarias y en particular las líneas de CIC de muestras de tumor fresco [18]. En primer lugar, hay dificultades objetivas en el aislamiento de poblaciones de células puras de los tejidos tumorales heterogéneos. impureza Tumor (diferentes niveles de contaminación de células no tumorales) y multiclonality son problemas bien documentados [19], [20]. A nivel molecular, actualmente no existen marcadores definitivos para demostrar la naturaleza maligna o no maligno de las células, así como para distinguir con precisión entre las células madre normales y cancerosas. La creciente evidencia también sugiere que los CIC podría representar una subpoblación heterogénea de las células iniciadoras del tumor [21] - [25]. Sin embargo, una combinación de múltiples enfoques y múltiples marcadores de superficie celular seguido de una caracterización funcional completa de los fenotipos celulares aisladas puede permitir la purificación de los más funcionalmente significativo, es decir, tumor y metástasis-iniciador y las células más resistentes a los medicamentos. Varias líneas de células colorrectales de diferentes características celulares, bioquímicos y moleculares se han establecido durante las últimas dos décadas [26] - [30]. Aquí mostramos el establecimiento de una novela enriqueció-CIC, línea celular de cáncer colorrectal altamente tumorigénicas aislado de metástasis hepática de un paciente CRC.
Resultados
Las muestras de pacientes y cultivos primarios
suspensiones de células disociadas de 13 carcinomas colorrectales recién resecados de diversos grados histológicos y 3 metástasis hepáticas fueron probados para clonogénico y el potencial tumorigénico
in vivo
y
in vitro
como se describe en la sección Métodos. Dos especímenes fueron severamente contaminados con bacterias, ya pesar de los repetidos tratamientos con antibióticos, las colonias primarias también estaban contaminados y por lo tanto se descartan. Dos cultivos primarios desarrollados a partir de muestras de tumores primarios y metastásicos de los pacientes tratados previamente con quimioterapia fueron sometidos a la muerte celular profunda después de 1-2 días en cultivo y no mostraron ningún células viables durante la próxima semana de observación. Los otros nueve muestras contenían una subpoblación de células de rápido adherente (FA) al colágeno de tipo I, que inicialmente proliferaron en el medio de células madre libre de suero y se indujo esferoides, que son característicos de CICs, así como agregados multicelulares sueltos en 3D flotante culturas. Sin embargo, el 6 de 9 cultivos primarios perdieron sus capacidades clonogénico y de formación de esferas después de varios pasajes, el cual está en línea con numerosas observaciones que las células cancerosas primarias tienen un (unos 5-6 pasajes) duración limitada [31]. En contraste, las células tumorales aisladas de la metástasis hepática del paciente de sexo masculino con la etapa 4 del cáncer de colon siguen a largo plazo
Hoteles en vivo y
in vitro
crecimiento de (15 pasajes, en la actualidad) y representan una establecida, línea celular de cáncer de colon enriquecido con CIC, CR4. Otros tres cultivos primarios están actualmente en fase de evolución similar a la línea celular CR4. Estas células están en el proceso de caracterización funcional, genómico, celular y molecular.
heterogeneidad celular y clonal de las células tumorales CR4
Después del aislamiento inicial de la adherente rápido para colágeno tipo I células tumorales primarias y su propagación
in vitro en medios
MSCB o SPC, varios tipos diferentes de la forma celular y la morfología clon fueron evidentes: (i) densamente poblada por células fusiformes similares a largos que representan carcinoma asociado fibroblastos (CAF) y fibroblastos normales, que eran fenotipo celular dominante pronto después del aislamiento y durante varios pasajes tempranos de cultivo (Figura 1A); (Ii) las grandes células alargadas con procesos dispersos dychotomized (Figura 1B); (Iii) clones pequeñas raras que contienen células redondas pequeñas cerca de 7-10 micras de diámetro con una capa muy fina borde del citoplasma y núcleos grandes alargados (Figura 1C, D); y entre ellos, (iv) sean raras, muy grande (≥100-200 micras), a menudo multinucleadas células (MNCs; Figura 1E). A menudo observamos tales células en ambas líneas celulares de cáncer de colon y de próstata establecidos y primarias cultivadas en condiciones que promueven la stemness. Estas células gigantes multinucleadas fueron capaces de lenta proliferación tanto, la producción de cualquiera de las multinacionales adicionales (Figura 1F) o células mononucleares grandes.
(A) que domina Inicialmente población de las células similares a fibroblastos alargados densamente empaquetadas. (B) más escasas células tumorales alargadas con procesos. (C) Aparición de pequeños grupos de células muy pequeñas (~ 7 M) adyacentes a las células similares a fibroblastos. (D) holoclone típica inducida por pequeñas células CR4. células multinucleadas (E) gigante dentro CR4 holoclone de células pequeñas. (F) Colonia de células multinucleadas.
Hemos continuado la cultura de las poblaciones de células mixtas en condiciones que promueven la stemness definidos espera que este enfoque, de manera similar a nuestro próstata primario previamente establecida línea celular CIC-enriquecido, pPT2 [32] dará lugar a la propagación de los CIC raras. De acuerdo con nuestras observaciones, se ha demostrado anteriormente que co-cultivo de las células de cáncer de colon con fibroblastos de carcinoma asociado llevado a anincrease en el número de CICs través de la activación de la vía de β-catenina [33]. Por último, los pases limitado de células primarias en un medio de células madre condujo a la aparición de numerosos, pequeños, clones densamente empaquetadas que contienen células dispersas con bordes lisos (holoclones) rodeadas por células alargadas (Figura 2A). Este patrón es característico para embrionario, pluripotentes inducidas y otros tipos de células madre co-cultivadas con fibroblastos [32], [34]. Sucloning de tales holoclones condujo al establecimiento de la línea celular de cáncer de colon purificado, CR4, con todas las características básicas de los CIC, incluyendo tumoral alta iniciadoras, 3D esferoidal y holoclone formador de capacidades y la expresión de la pluripotencia y la célula madre relevantes marcadores (descritas a continuación). Junto con los holoclones de bordes lisos putativo, las células CR4 pueden inducir paraclones con bordes difusos (Figura 2C), que son característicos de las células progenitoras. Durante los pasajes anteriores, casi todos los holoclones CR4 contenían uniformemente embalados células pequeñas del centro a la periferia del clon (Figura 2B). Sin embargo, los pasajes posteriores tenían mucho más altas relaciones de las grandes células multinucleadas situados predominantemente en la periferia del clon, mientras que las células pequeñas ocuparon la parte más central del clon (Figura 2 E, F). Los ultra-bajas pasajes de las células CR4 se mantienen en alícuotas en nitrógeno líquido; Actualmente, esta línea se en el paso 14. Para la caracterización se describe, las alícuotas congeladas se propagan ya sea como NOD /xenoinjertos de tumores de ratones SCID, flotando esferoides 3D o cultivos de colágeno de tipo I adherente.
(A) Clon de pequeñas células CR4 rodeadas de células similares a fibroblastos largos con los procesos dychotomized. (B) Después de la subclonación, pequeñas células sembradas CR4 a baja densidad en SPCM libre de suero de tipo I colágeno producido holoclones típicos densamente empaquetadas característicos de las células madre de origen diferente. (C) Paraclone de células más grandes alargadas adyacentes a las pequeñas células de CR4. (D) bajo número de células pequeñas purificadas producidas predominantemente holoclones con bordes redondos y paraclones raras adherentes al colágeno de tipo I con una alta eficiencia. (E) Un mayor aumento de las células holoclone con núcleos grandes y delgado borde de citoplasma. (F) las multinacionales grandes (≥200 m; hematoxilina y eosina). Menudo se encuentran en la periferia de los holoclones
Caracterización funcional de las células CR4
Para confirmar el estado stemness de la línea celular CR4, varios ensayos funcionales se realizaron incluyendo la evaluación de la iniciadoras de tumor potencial (capacidad para formar tumores subcutáneos en NOD inmunodeficiente /ratones SCID), de formación de esferas de capacidad (capacidad de formar esferoides flotantes densos en cultivos 3D no adherentes) y clonogenicidad (capacidad de formar adherente al colágeno de tipo I holoclones). Hemos determinado que las células CR4 poseen una alta eficiencia en la inducción de tumores en ratones NOD /SCID (figura 3A) después de trasplantes subcutáneos en serie del número de células relativamente bajo. Por lo tanto, 1 × 10
3 CR4 células o 2-3 esferoides flotantes inducidos grandes tumores en todos los ratones (6 ratones por cada grupo). Para establecer las capacidades clonogénicas y de formación de esferas de las células CR4, un número conocido de células se sembraron en placas recubiertas con colágeno adherentes de tipo I o ultra-bajas, respectivamente. Después de una semana de incubación, los clones inducidos adherentes o esferoides flotantes se contaron y la eficiencia clonogénico se calculó como la relación entre el número de células sembradas en comparación con el número de colonias o esferoides inducidos. En particular, se determinó que después de la siembra de células CR4 sin clasificar de paso 13 en dilución en serie (250, 100, 50 y 25 células /pocillo de placas de 96 pocillos) sobre una celda en 10 (10%) holoclones perfectos inducidas (Figura 2B, RE). De formación de esferas eficiencia de la fracción CD133-positivo de las células CR4 en cultivo 3D con el tipo del 5% de colágeno I en SPCM fue mayor en comparación con las poblaciones de células CD133-empobrecido (8,4 ± 2,6 frente a 3,7 ± 0,6 esferoides por cada 100 células sembradas /pocillo , respectivamente). Ambos holoclones y esferoides estaban llenas de células muy pequeñas que expresan altos niveles de marcadores stemness comunes, incluyendo EpCAM, CD133, CD44, CD166 y LGR5 (descrito más adelante). Aunque el CD133 (clon 293C3), así como cualesquiera otros marcadores comunes, no es ideal para CICs de colon, sin embargo, permite el enriquecimiento adicional de la tumor-iniciación y de formación de esferas fracción de las células CR4.
(A) tumor subcutáneo grande inducida por el trasplante de las células CR4 (1 × 10
3) en NOD /SCID mouse (paso 2). (B) esferoides flotantes densos inducidos por pasos en serie de las células en cultivo CR4 3D en las placas ultra-baja adherencia. (C) esferoide tridimensional inducida en la superficie del adherente holoclone CR4. (D) Formación de un gran 3D organoides en la superficie del adherente holoclone CR4. (E) aparición de procesos largos en las células esferoides inducida por las células CR4 en cultivo 3D que contiene 15% de gel de colágeno, lo que indica su alto potencial invasivo [35]. (F) de Long procesos desarrollados por pequeñas células adherentes CR4 dychotomized. (G) los procesos largos de las multinacionales adherentes.
La naturaleza agresiva y excepcional capacidad de formación de esferas /clonogénico de células CR4 se demuestra por su capacidad de producir esferoides flotantes no sólo en las culturas no adherentes (Figura 3B), sino también por gemación de la adherente a colágeno de tipo I holoclones y el consiguiente desprendimiento de los esferoides formados (Figura 3C). Los holoclones CR4 también fueron capaces de producir los grandes organoides de múltiples capas adherentes directamente encima de la superficie holoclone (Figura 3D). Flotante esferoides CR4 se comportaron de manera diferente en los sistemas de cultivo en 3D con y sin colágeno tipo I geles en medios de células madre (MSCBM o SPCM). Por lo tanto, esferoides cultivan sin o con bajo por ciento de gel de colágeno (hasta 5%) por lo general tienen bordes lisos (Figura 3B), mientras que una mayor concentración de gel (hasta 10-15%) dio lugar a la aparición de múltiples procesos, que se formó asterisco estructuras circundantes -como esferoides (Figura 3E). Tal fenotipo de esferoides flotantes se asoció recientemente con alta capacidad metastásica de determinadas células del cáncer [35], que está en línea con el hecho de que la línea celular se estableció a partir CR4 metástasis hepática del paciente de cáncer de colon. De manera similar a la cultura 3D, la naturaleza invasiva de las células CR4 se refleja en su capacidad para desarrollar procesos largos, grandes, dicotomizadas en el borde exterior de los clones adherentes (Figura 3F). Los grandes células multinucleadas en la periferia de los clones, se ha descrito anteriormente, así como células multinucleadas gigantes individuales, también a menudo muestran procesos largos y dychotomized (Figura 3G).
perfilado fenotípica de las células CR4
Como mencionamos anteriormente, la subclonación de los pequeños que contiene de células-holoclones condujo a un enriquecimiento espectacular de células que expresan altos niveles de los marcadores de pluripotencia y stemness (Tabla 1; figuras 4 y 5). En general, el tallo fenotipo celular
in vitro
es dinámico debido a la naturaleza dual de la CIC (es decir, su capacidad de auto-renovación y generar progenitores comprometidos). Por lo tanto, los primeros e intermedios pasajes de células CR4 primarios tenían fenotipo inestable que expresan niveles muy variables de CD133, CD44 y EpCAM (Tabla 1 y Figura 4A). Los xenoinjertos de tumores de ratones NOD /SCID inducidos por estas células expresaron niveles similares de todos los marcadores estudiados (Figura 4B). En contraste, las células CR4 purificadas conservan fenotipo relativamente estable en 3D y adherente a la de colágeno tipo I culturas. Por lo tanto, tres análisis FACS independiente durante los últimos 7 meses (pasajes 6-14) han demostrado que prácticamente todo el población de células CR4 permanece indiferenciado (sólo 3-5% marcador expresado de diferenciación, pan-queratina), y la mayoría de las células expresar altos niveles de CD133 (62-82%), CD44 (65-99%), CD166 (97-98%), EpCAM (98-99%) y LGR5 (80 a 83%; los datos de FACS representativos se muestran en la figura 4C). En particular, alrededor de 65% de las células coexpressed altos niveles de CD133 y CD44. Es importante destacar que, aproximadamente el 20% de las células son positivas para CR4 marcador de la actividad metastásica, CXCR4.
(A) análisis de FACS Representante de la diferente expresión de marcadores de superficie celular en cultivo primario temprano de las células CR4-rápidas adherente crecido en colágeno de tipo I en un medio MSCB. (B) Análisis FACS de la primera paso de las células tumorales FA aisladas de xenoinjertos de tumores de ratones NOD /SCID inducidos por células CR4-paso temprano. (C) El dramático aumento en la expresión de los marcadores comunes de la troncalidad, incluyendo CD133, CD44, CD166, LGR5 y EpCAM a finales del pasaje (p13) células CR4. Tenga en cuenta que 19% de las células también expresó marcador de CICs con actividad metastásica, CXCR4, que se identificó en varios cánceres humanos.
(A) la localización nuclear de los principales marcadores de pluripotencia, c-Myc, Sox- 2 y Oct3 /4. (B) La colocalización nuclear de c-Myc con la expresión máxima de la membrana de CD133. (A, B: Análisis inmunocitoquímico de las células cultivadas en CR4 colágeno tipo I con recubrimiento de portaobjetos con cámaras). (C) Análisis de transferencia Western confirma la expresión de c-Myc y Oct-3/4 en las fracciones nucleares de las células de CR4. Por el contrario, son negativas para p53 y p21. fracción nuclear también expresaron niveles más altos de la p65 fosforilada (que indican la activación constitutiva de NF-kB), mientras que p65 unphosphorilated se encuentra predominantemente en un citoplasma. (D, E) Representante FACS análisis muestran una mayor expresión de Sox-2 y c-Myc en las células CD133 positivas en comparación con células no clasificadas. (F) El análisis inmunohistoquímico muestra alta expresión nuclear de Sox-2 en el SCID xenoinjerto NOD inducida por CR4 /ratones del tumor. (G) Control negativo (sección de tejido sin incubación con anti-primarias Sox-2 Abs).
El uso de inmunocitoquímica, FACS y análisis de Western blot, hemos demostrado que una proporción significativa de la CR4 células expresan varios marcadores de pluripotencia clave, incluyendo Sox-2, Oct3 /4 y c-Myc. Localización nuclear de estos marcadores se muestra por ICC (Figura 5A, B) se confirmó mediante transferencia de western (C), que ha demostrado su expresión en la fracción proteica nuclear y su ausencia en el citoplasma. Hemos encontrado que el CD133
+ fracción de las células CR4 expresar mayores proporciones de varios marcadores de pluripotencia en comparación con las células CR4 sin clasificar. Por lo tanto, el análisis FACS ha mostrado que más de un cuarto de la CD133
+ población expresó Sox-2 y 10% de la población fueron positivas para c-Myc (Figura 5D). En contraste, las células no clasificadas CR4 y fracción CD133-negativas expresan niveles más bajos de estos marcadores de pluripotencia (6 y 4%, y 1,4 y 0,8%, respectivamente; Figura 5E; fracción negativa no se muestra). análisis de colocalización ha demostrado que sólo las células con la más alta expresión de CD133 por lo general tienen la tinción nuclear para los marcadores pluripotancy (Figura 5B; solamente c-Myc se muestra). Alta proporción de los Sox-2positive células y su localización nuclear también fue confirmado por IHC de los xenoinjertos de tumores de ratones NOD /SCID (Figura 5F). [Es de destacar que el uso de los anticuerpos anti-Oct3 /4 (Santa Cruz Biotechnology, CA, EE.UU.) para el análisis FACS proporcionado sospechosamente altas proporciones de células positivas (más del 90%) y estos datos no se incluyeron.] Es importante destacar que el CR4 células, línea celular de manera similar a la próstata enriquecido-CIC pPT2 [32], no expresaron los dos reguladores importantes de la apoptosis y genes supresores de tumores, p53 y p21 (Figura 5C). Además, la fracción nuclear de las células cultivadas en CR4 colágeno tipo I en un medio de células madre como holoclones separadas expresan fuertemente p65 fosforilado, lo que significa que NFkB es constitutivamente sobreexpresa en CICs colorrectales. Por el contrario, p65 fosforilada se encuentra predominantemente en la fracción citoplásmica. Todo lo anterior puede explicar en parte las altas capacidades oncogénicas y clonogénico y una excepcional resistencia a los medicamentos de esta línea celular enriquecida-CIC. En particular, las células CR4 son altamente tolerantes al tratamiento con fármacos citotóxicos utilizados comúnmente tales como paclitaxel o Taxol (Figura 6). Por lo tanto, después del tratamiento de 72 horas en rango de concentración de 10 nM hasta 10 M (ensayo de MTT), las células CR4 han mostrado poco o ningún citotoxicidad; Además, a menudo aumentaron su proliferación en respuesta a dosis más bajas de paclitaxel. Se ha encontrado que varios miembros de taxoides de nueva generación, incluyendo SBT-1214, SBT-121 602 y SBT-12834 son más eficaces contra las células iniciadoras del tumor CR4. La tasa de mortalidad IC50 se alcanzó a ≥10 M de toda la concentración de drogas. Es de destacar que la eficacia prometedora de bajas concentraciones de taxoides de nueva generación se puede mejorar aún más por su combinación con el derivado sintético de la curcumina, CMC2.24 (datos no publicados), que es de acuerdo con nuestro estudio anterior [32].
utilizado comúnmente paclitaxel (Taxol) en dosis más bajas de 10 micras no es eficaz contra las células CR4 y a menudo aumenta su proliferación. Por el contrario, varios taxoides de nueva generación inducen la inhibición dependiente de la dosis de la proliferación de estas células iniciadoras de tumores potentes. (Ensayo MTT después del tratamiento de drogas durante 48 horas). Los obtenidos
valores de p
para todas las drogas y todas las concentraciones del fármaco fueron mucho menores que 0,05. Se obtuvo el mayor
p
valor por SBT-1214 a una concentración de 10 nM (
p = 0,0131
); en particular, a una concentración de 10 mM de SBT-1214
p = 0,00032
.
histopatológico y análisis IHC de los xenoinjertos de tumores de ratones NOD /SCID
A medida que nos mencionado anteriormente, el trasplante subcutáneo de un número relativamente bajo de células CR4 (1 × 10
3 de las células disociadas CR4 o 2-3 esferoides flotantes) inducidas grandes tumores vascularizados en todo NOD inyectado /ratones SCID (Figuras 3A y 7A) . Las secciones de tejido con hematoxilina-eosina y manchado de los xenoinjertos tumorales ratones mostraron características histológicas clásicas de cáncer de colon metastásico humano (Figura 7B, C). células epiteliales altamente atípicos forman estructuras similares a las vellosidades con prominentes núcleos alargados y, en consonancia con adenocarcinoma pobremente diferenciado, numerosas figuras mitóticas atípicas. necrosis central era generalmente presentes. Son muchas las grandes células multinucleadas fueron evidentes a mayor aumento (Figura 7C; flechas). El análisis inmunohistoquímico reveló que el área de tumor todo (pero no estroma tumoral) expresaron altos niveles de la EpCAM localizado en la membrana (Figura 7D, E). patrones y niveles de expresión similares fueron característicos de CD166 (F). Por el contrario, la inmunotinción con CD44 policlonal (clon F10-44-2; Invitrogen /Biosources, EE.UU.) reveló tres patrones diferentes de la expresión en diferentes áreas del mismo tumor, es decir, claramente membrana (Figura 7G), así como citoplásmica y nuclear claramente en otras partes (Figura 7H). Cytolasmic alta expresión del marcador común de células madre de colon y CICs, LGR5, era evidente en algunas partes del tumor (Figura 7J), mientras que en otras partes, se expresa ya sea moderada o débilmente (K), o incluso inexistentes. Grandes áreas de los xenoinjertos de tumores expresan una fuerte tinción nuclear con el marcador de pluripotencia Sox-2 (Figura 7L).
(A) del tumor grande inducida por el trasplante de 1 × 10
3 CR4 células. (B) con hematoxilina y eosina sección de tejido teñido de muestra características histológicas clásicas de cáncer de colon metastásico humano. (C) magnificación de alta energía de la región de muestra en (B); flechas indican las células multinucleadas gigantes dentro de las estructuras papilares. (D, E) la superficie celular expresión fuerte del marcador epitelial, EpCAM. (F) expresión en la superficie celular de CD166 fuerte. (G) la expresión citoplásmica de CD44. (H) enfoque microscópico con nuclear fuerte y débil expresión citoplásmica de CD44. (I) Control negativo (Abs primaria se omite). (J, K) expresión fuerte y moderada, respectivamente, del marcador de células madre de colon, LGR5 /GPR49. (L) la expresión nuclear fuerte del marcador de pluripotencia, Sox-2 en grandes áreas del tumor.
RNA-Seq completa de perfiles de transcriptoma de CR4 pequeña frente a las células tumorales a granel
Uso RNA-Seq, se realizó un análisis genómico funcional en fracciones iniciadoras del tumor de CR4 células (pequeños) obtenidas adherente al colágeno de tipo I frente crecido como esferoides 3D, en comparación con las células tumorales a granel (largos y dychotomized células cultivadas bajo condiciones de cultivo estándar ). El uso de un HiSeq 2000, secuenciado entre 40 y 50 millones de lecturas por muestra biológica, tal como se describe anteriormente [35], [36], [37]. En resumen, las bibliotecas de NGS se hicieron a partir de 100 nanogramos de ARN total. La calidad de las muestras de ARN se evaluó con un Bioanalyzer Agilent. Todas las muestras de ARN tenían una RIN por encima de 8. bibliotecas de secuenciación se ha creado usando el kit de iluminación TruSeq Stranded ARNm de LT de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Se evaluó la calidad de cada biblioteca con el ensayo de alta sensibilidad de Agilent Bioanalyzer, y se cuantificó mediante qPCR (Kappa Biosystems, CT). Las bibliotecas se agruparon en 10 nM sobre la base de los resultados qPCR, y luego a la piscina se cuantificó de nuevo por qPCR. La biblioteca agrupada fue secuenciado en un carril de una celda de flujo de 100 pb final HiSeq2000 emparejado. Esto nos ha permitido detectar las transcripciones que se expresan diferencialmente entre estos tipos de células CR4, construyendo así una imagen completa de las vías de señalización activadas o reprimidos. Hemos encontrado que las pequeñas células CR4 cultivadas ya sea como holoclones separadas adherentes a colágeno de tipo I o como flotante 3D esferoides poseen un gran número de genes expresados diferencialmente en comparación con las células tumorales a granel cultivadas bajo condiciones de cultivo estándar. Por lo tanto, en células adherentes CR4 y esferoides 3D, 357 y 365 genes pequeño, respectivamente, se sobreexpresa en comparación con las células (a granel) de tumor a largo CR4. Entre estos genes, 287 fueron upregulated comúnmente, lo que significa que ambas condiciones de cultivo permiten el mantenimiento de las células pequeñas CR4 en estado stemness. En particular, tanto pequeños esferoides adherentes y 3D expresaron hasta varios órdenes de magnitud de la regulación positiva de los siguientes: (i) múltiples marcadores comunes de la troncalidad, incluyendo CD44, CD24, EpCAM, ESA, LGR5, ALDH1A1 y otros; (Ii) los factores de crecimiento, incluyendo la epidérmico (EGF), fibroblastos (FGF) y factor de crecimiento transformante beta (TGF) miembros de la familia; (Iii) factores de transcripción (TFS), incluyendo homeobox múltiple (CDX1, CDX2, CEACAM6, MSX2) y TFS pluripotencia (POU5F1B, Oct4, Sox-2, Sox-9; (iv) las citoquinas inflamatorias y sus receptores, incluyendo IL18, IL20 , IL2RG, IL20RA y otros; (v) los transportadores ABC, (vi) los genes responsables de la transferencia de fosfato de alta energía de las mitocondrias (CKMT1 y CKMT1B) y los miembros de la familia del citocromo P450, incluyendo CYP2B6, CYP2J2, CYP2S1 y otros de interés. , la fracción de iniciación de tumor de las células CR4 sobreexpresa múltiples genes que controlan la adhesión célula-a-célula, incluyendo las cadherinas (CDH 1, 3 y 17, y CDHR5); intergins (ITGB4); genes que codifican proteínas apretado nudo (CLDN3, 4 y 6, COL17A1 y otros);. y queratinas (KRT19, 20, 23 y KRTAP3-1) Este hallazgo apoya nuestro enfoque utilizado tradicionalmente para el enriquecimiento inicial de las células iniciadoras de tumores de próstata y colon en función de su capacidad de adherirse al tipo I colágeno recubiertas de superficies dentro de 15-20 minutos de incubación. los datos de RNA-Seq primas obtenidas fueron enviadas al Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) gene Expression Omnibus (GEO), un repositorio de datos de genómica funcional pública (el número de identificación es <