Extracto
guiada por ultrasonido (SCLC) es una enfermedad devastadora con opciones de tratamiento limitadas. Debido a su naturaleza metastásica precoz y un rápido crecimiento, la resección quirúrgica es poco frecuente. Estándar de cuidado de los regímenes de tratamiento se mantienen sin cambios desde la década de 1980, y la supervivencia de cinco años permanece cerca de 5%. de xenoinjertos derivados de los pacientes se han establecido (PDX) modelos para otros tipos de tumores, material para la investigación amplificar y servir de modelo para la experimentación preclínica; Sin embargo, la limitada disponibilidad de tejido primario ha limitado el desarrollo de estos modelos para el CPCP. El objetivo de este estudio fue establecer modelos PDX a partir de biopsias aspiración con aguja fina comúnmente recogidos de tumores primarios de SCLC, y evaluar su utilidad como modelos de investigación de los tumores primarios de SCLC. Estos aspirados con aguja transbronquial injertaron eficientemente como xenoinjertos, y histomorfología del tumor fue similar a los tumores primarios. tumores resultantes se caracterizan además por H & amp; E y la inmunohistoquímica, criopreservados, y se utilizan para propagar ratones portadores de tumores para la evaluación de calidad de los regímenes de quimioterapia cuidado, para evaluar su utilidad como modelos para los tumores en pacientes de SCLC. Cuando se trata con cisplatino y etopósido, los ratones portadores de tumores respondieron de manera similar a los pacientes de los que se originaron los tumores. Aquí, se demuestra que los modelos tumorales PDX se pueden establecer de manera eficiente a partir de aspirados con aguja transbronquial SCLC primarias, incluso después de que el envío de noche, y que los xenoinjertos de tumores resultantes son similares a los tumores primarios coincidentes en pacientes con cáncer, tanto por la histología y la quimio-sensibilidad. Este método permite a los médicos en instituciones ajenas a la investigación para contribuir en colaboración para el rápido establecimiento de amplias colecciones de PDX SCLC, lo que permite la experimentación con los tejidos y el desarrollo de mejores terapias para pacientes con CPCP clínicamente relevantes
Visto:. Anderson WC, Boyd MB, Aguilar J, Pickell B, Laysang A, Pysz MA, et al. (2015) Establecimiento y caracterización de Cáncer de pulmón microcítico xenoinjertos-derivados de los pacientes a partir guiada por ultrasonido punción transbronquial aspirados. PLoS ONE 10 (5): e0125255. doi: 10.1371 /journal.pone.0125255
Editor Académico: Daniel Chan, de la Universidad de Colorado en Denver, Estados Unidos |
Recibido: 24 Septiembre, 2014; Aceptado: March 23, 2015; Publicado: May 8, 2015
Derechos de Autor © 2015 Anderson et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
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Financiación:. WCA, JA, BP, aL, MAP, SB, JR, BCS, y SJD son empleados de Stem CentRx, Inc., una compañía biotecnológica centrada en el enfoque terapéutico de las células madre del cáncer. El donante prestado apoyo en forma de salarios de los autores de WCA, JA, BP, AL, MAP, SB, JR, BCS, y SJD, pero no tuvo ningún papel adicional en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito. Las funciones específicas de estos autores se articulan en la sección 'autor' contribuciones
Conflicto de intereses:. WCA, JA, BP, AL, MAP, SB, JR, BCS, y SJD son accionistas de Tallo CentRx, Inc ., una compañía de propiedad y con financiación privada. Esto no altera la adhesión de los autores a PLoS ONE políticas sobre los datos y compartir materiales
Introducción
Los cánceres de pulmón son la principal causa de muerte por cáncer en todo el mundo. Entre ellas, el cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC) tiene la tasa más alta de mortalidad, que representa el ~ 15% de las muertes por cáncer de pulmón en los Estados Unidos [1]. La supervivencia a cinco años para los pacientes con CPCP se mantiene cerca de 5%, con la mayoría de sucumbir a la enfermedad dentro de un año del diagnóstico. SCLC es altamente metastásico y progresa rápidamente. La resección quirúrgica no mejora la supervivencia y, por lo tanto, rara vez se prescribe. Por lo tanto, la quimioterapia sigue siendo la primera línea de tratamiento [2].
El régimen de quimioterapia se administra más comúnmente para el CPCP es cisplatino y etopósido (P /E), como lo ha sido durante más de tres décadas [2]. Este régimen se consigue respuesta inicial importante en la mayoría de los pacientes, a menudo la reducción de tumores a niveles indetectables. Por desgracia, los tumores casi siempre se repiten poco después de la interrupción del tratamiento. Los tumores recurrentes son generalmente más agresivos y resistentes a los intentos posteriores para retardar el crecimiento del tumor utilizando P /E u otros regímenes quimioterapéuticos aprobados, tales como topotecan [3-5]. Incluso en los pacientes menos afortunados, primera línea de tratamiento de P /E produce una respuesta parcial, lo que acelera la necesidad de terapia de segunda línea cuando tolerado. Aunque los regímenes quimioterapéuticos actuales se extienden supervivencia para los pacientes con CPCP (versus ningún tratamiento), los beneficios son limitados y el impacto supervivencia a 5 años es trivial. Una explicación para el progreso insignificante en el descubrimiento y desarrollo de nuevas terapias que afectan a la supervivencia del paciente SCLC es la falta de modelos de tumores apropiados con el que estudiar la enfermedad. modelos adecuados deben permitir la evaluación preclínica de terapias de investigación, se asemejan morfológicamente tumores de pacientes, y responder de manera similar a los regímenes de quimioterapia estándar
in vivo
.
xenoinjertos derivados de los pacientes (PDX) modelos, que se generan a partir tejido tumoral resecado recién implantado, que se cultiva, y se pasaron exclusivamente en ratones con inmunodeficiencia grave, cada vez se genera y se utiliza para estudiar la biología del tumor humano [6-8]. Estos modelos conservan similitudes significativas a los tumores de pacientes de los que se generaron. modelos de tumores PDX generados a partir de varios otros tipos de tumores generalmente retienen su perfil de sensibilidad a nivel de las respuestas de quimioterapia cuidado observados clínicamente. Además de facilitar el crecimiento de tumores humanos para
ex vivo
estudio, los tumores PDX también ofrecen modelos fisiológicamente relevantes con el que estudiar la biología del tumor y evaluar la eficacia preclínica de agentes terapéuticos
in vivo
. PDX modelos de tumores también pueden ser criopreservados y estudiado a fondo con el tiempo sin una amplia pases, la prevención de los resultados adversos de la prolongada
in vitro Francia culture, tales como las alteraciones genómicas que afectan a ambas líneas celulares y sus derivados xenoinjertos de líneas celulares convencionales [ ,,,0],9, 10].
Debido a SCLC rara vez se extirpa quirúrgicamente, la investigación en esta indicación no se ha beneficiado de la disponibilidad de modelos de tumores PDX generados a partir de las resecciones, aunque existen algunos modelos SCLC PDX [10-13]. El acceso a material tumoral SCLC primario está predominantemente limitada a las aspiraciones con aguja fina de diagnóstico que son comúnmente considerados demasiado pequeños para facilitar el injerto. Leong et al. han demostrado que estas aspiraciones con aguja fina pueden generar tumores PDX morfológica y genéticamente similares a los tumores primarios combinados [11]. Estas aspiraciones con aguja fina se recogen con frecuencia en las clínicas y hospitales que no tienen acceso in situ a los animales inmunocomprometidos o la infraestructura para generar nuevas líneas de PDX. Aquí, mostramos que, especímenes de SCLC primarios individuales aspiración con aguja fina, tomadas con posterioridad a la toma de muestras de diagnóstico y se envían durante la noche para una instalación de investigación colaborando, son capaces de establecer de manera eficiente los tumores morfológicamente similares a PDX del tumor primario del que se derivan. Por otra parte, hemos demostrado que
in vivo
quimio-sensibilidad de estos tumores PDX a tratamiento con P /E combinadas generalmente se conservan de los tumores primarios de sus tumores en ratones PDX correspondientes. Este trabajo demuestra que los investigadores y los médicos que trabajan en colaboración, incluso a través de grandes distancias, se pueden establecer de forma rápida y eficientemente grandes colecciones de líneas tumorales PDX a partir de aspirados con aguja fina abundantemente disponibles de SCLC. histomorfología conservado y capacidad de respuesta a nivel de atención regímenes quimioterapéuticos hacen estos excelentes modelos con los que estudiar mejor la biología del tumor SCLC, y facilitan el descubrimiento y desarrollo de terapias que mejoran la supervivencia del paciente.
Materiales y Métodos
los pacientes
el estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional Carilion Clínica. Los 12 pacientes con cáncer de pulmón de células pequeñas firmó el consentimiento informado antes de participar en el estudio. Las muestras fueron tomadas por la PTB endobronquial guiada por ultrasonido (PA guiada), ya sea desde un tumor primario central o de sospecha de afectación ganglionar. Puesta en escena clasificación corresponde tanto a la Administración de Veteranos de pulmón Grupo de Estudio y de la Asociación Internacional para el Estudio de los sistemas de estadificación del cáncer de pulmón [14, 15]. Grado de actividad se determinó en el momento del diagnóstico inicial [16] .Patients se ofrecieron estándar de las medidas de resultado de tratamiento y de atención fueron monitoreados.
PA guiada
Todos los procedimientos se realizaron bajo sedación profunda utilizando un broncoscopio flexible de ultrasonidos (CP-EEB XBF-UC260F, Olympus, Tokio, Japón) [17] y una aguja 21G Vizashot. Al menos 6 muestras de biopsia con aguja transbronquial fueron tomadas en cada tumor sospechoso o estación nodal. Las muestras iniciales se procesaron de manera institucional estándar, con la preparación de portaobjetos para la rápida interpretación citológica in situ, así como la recogida de material para construir un bloque de celdas para la evaluación patológica retardada. La última muestra recogida fue expulsado en enfriado con hielo HypoThermasol-FRS (Sigma, St. Louis, MO) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contenía un volumen de al menos 10 veces mayor que el volumen del tejido, y enviado durante la noche para Stemcentrx, Inc. para su implantación dentro de 30 horas después de la biopsia.
régimen de tratamiento clínico de pacientes con SCLC donantes post-biopsia
Ocho de los doce pacientes de los que se realizó una biopsia recibieron muestras de tumor intravenosa 60-80 mg /m
2 cisplatino en el día 1, más 80-120 mg /m
2 etopósido en los días 1-3 cada 21-28 días con una anticipación de al menos cuatro ciclos de terapia. Ambos regímenes requieren hidratación y administración de fármacos antieméticos. Si el recuento leucocitario cayó por debajo de 2.000 por mm
3, o el recuento de neutrófilos cayeron por debajo de 1000 por mm
3, granulocitos humanos factor estimulante de colonias recombinante se administra hasta que los leucocitos y /o neutrófilos fueron restaurados. Los ajustes de dosis se hicieron sobre la base de la identificación de la toxicidad de órganos asociados con la quimioterapia. Tres pacientes optaron por el tratamiento. Un paciente se perdió durante el seguimiento y así su ciclo de tratamiento es desconocida.
Los siguientes criterios se utilizaron para evaluar las respuestas del paciente a tratamiento estándar con cisplatino y etopósido (P /E). Las imágenes radiológicas, ya sea en el pecho o computarizada por emisión de positrones, se utilizó para determinar la respuesta a la terapia estándar de cuidado. Criterios de evaluación de respuesta en tumores sólidos (RECIST) se utilizó para la respuesta del tumor de grado de la siguiente manera: respuesta completa (RC): desaparición de todas las lesiones diana. Respuesta parcial (PR): Al menos una disminución del 30% en la suma del diámetro más largo (LD) de lesiones diana, tomando como referencia la suma LD línea de base. Enfermedad estable (SD): Ni la contracción suficiente para tener derecho a PR ni suficiente aumento para calificar para la enfermedad progresiva (EP), tomando como referencia la más pequeña suma LD desde que se inició el tratamiento. PD: Por lo menos un aumento del 20% en la suma de la LD de lesiones diana, tomando como referencia el más pequeño LD suma registrada desde que se inició el tratamiento o la aparición de una o más nuevas lesiones [18]. La supervivencia global (SG) se define como el intervalo entre el diagnóstico inicial y la muerte del paciente se mide en semanas.
generación PDX
Este estudio fue aprobado por el Comité de Cuidado de Animales y el empleo Stemcentrx Institucional (Protocolos SCAR -3-2.008 y el SCAR-5-2008). Se llevaron a cabo estudios con ratones, de acuerdo con la Asociación Americana de Ciencia Animal de Laboratorio. Toda la cirugía se realizó bajo anestesia isoflurano, y se hicieron todos los esfuerzos para reducir el sufrimiento de los animales. Los ratones fueron sacrificados utilizar compresores de CO
2 de gas, de acuerdo con las más recientes directrices AVMA sobre la eutanasia. Tras la recepción por Stemcentrx, cada espécimen de biopsia de tumores SCLC se sedimentó por centrifugación de luz (50 rcf durante 5 minutos), se resuspendieron en 100-150μL Medium-199 (Mediatech, Inc., Manassas, VA) y se mezclaron con un volumen igual de Matrigel (BD Biosciences, Milpitas, CA). Entonces, 100 pl de la solución se inyectaron subcutáneamente en las almohadillas de grasa mamaria inferiores de edad ratones receptores NOD /SCID hembra de 8-10 semanas. Se evaluaron la salud del ratón, el peso y volumen (s) del tumor, por lo menos, semanal. Cuando los volúmenes tumorales miden entre 800-1,500 mm
3, los destinatarios fueron sacrificados humanitariamente y se resecaron los tumores.
Propagación y el análisis de los tumores PDX
tumores resecados recién se disocian a una sola celda suspensión tal como se describe anteriormente [19, 20]. En cada paso de la propagación del tumor, origen epitelial humana fue confirmada por la tinción positiva por citometría de flujo utilizando EpCAM anti-humana (clon 9C4), y la tinción negativa con CD45 anti-humano (Clon HI30), anti-ratón CD45 (Clone 30-F11 ), y anti-ratón H-2K
d (Clon) SF1.1 anticuerpos (todos de BioLegend, San Diego, CA). Todo citometría de flujo de anticuerpos se utilizaron a una concentración final de 10 mg /ml. Para propagar los tumores PDX, se suspendieron células disociadas 1: 1 en volumen en Matrigel a una concentración de 50.000 células por 100 l de volumen final por sitio de inyección. Las células se implantaron bilateralmente con arreglo a las almohadillas de grasa mamaria inferiores utilizando una aguja 27G y el crecimiento tumoral se controló semanalmente.
tiempo hasta la progresión (TTP) se definió como el intervalo entre la respuesta al tratamiento y la identificación de la enfermedad progresiva por RECIST medido en semanas. Para medir las respuestas de xenoinjertos tumorales derivadas del paciente a tratamiento estándar con cisplatino y etopósido, se utilizaron los siguientes criterios: tiempo de duplicación fue definida como el período de tiempo medio en el que se duplicó el volumen del tumor (días); Se controló el ritmo de crecimiento del volumen del tumor, calculado mediante la fórmula d
DBL = (d
id
f) /log
2 (v
iv
f) y un promedio de todos los tumores, mientras que en el rango de 150 mm
3-1200mm
3; El porcentaje de inhibición del crecimiento del tumor (% TGI) se calculó como el volumen medio de los tumores quimio-tratados dividido por el volumen medio de los tumores tratados con vehículo 21 días después del tratamiento inicial.
biopsias de SCLC primarios y tumores PDX fueron fijadas con formalina y embebidos en parafina (FFPE), y planas secciones de bloques de tejido fueron cortadas y montadas en portaobjetos de vidrio para microscopio. Para IHC, secciones de tejido de-xileno parafinadas se trataron previamente con Antigen solución de recuperación (Dako, Carpinteria, CA), se bloquearon con suero de burro 10% en 3% de BSA en tampón PBS, y después se incubaron con el anticuerpo primario. Los anticuerpos primarios utilizados fueron los siguientes: sinaptofisina (1: 200; Clone SP11; primavera Bioscience, Pleasanton, CA), cromogranina-A (0,2 g /ml; Clone SP12; primavera Bioscience, Pleasanton, CA), y CD56 (0,2 g /ml; Clon EP2567Y; Origene, Rockville, MD), la queratina 5 (1,4 mg /ml; clon SP178, Spring Bioscience, Pleasanton, CA), la queratina 6 (0,15 mg /ml; Clone SP87, Spring Bioscience, Pleasanton, CA), queratina 7 (0,7 mg /ml; Clone SP52, Spring Bioscience, Pleasanton, CA), queratina 14 (1 mg /ml; Clon LL002, Abcam, Cambridge, MA), queratina 20 (1:50; Clon SPM140, Abcam, Cambridge , MA), TTF1 (Clon 8G7G3 /1, Biocare médica, Concord, CA), TP63 (0,125 g /ml; clon 4A4, Biocare médica, Concord, CA), Napsin A (Clon TMU-AD02, Biocare médica, Concord, CALIFORNIA). Las secciones fueron incubadas en biotina-conjugado, especies específicas de anticuerpos secundarios (Immunoresearch, West Grove, PA) seguido de incubación en estreptavidina-HRP (ABC Elite Kit; Vector Labs, Burlingame, CA). detección cromogénico se desarrolló con 3, 3 'diaminobenzadina (Thermo Scientific, Rockford, IL) y los tejidos se counterstained con hematoxilina y fotografiada con un microscopio óptico con un aumento de 40X.
Para la tinción IHC, los siguientes anticuerpos de control negativo y se utilizaron tejidos de control positivo. CHGA: IgG1 de ratón (BioLegend, Inc., San Diego, CA) y el páncreas humanos normales. Sinaptofisina: IgG de conejo (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) y el páncreas humanos normales. CD56: IgG de conejo (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) y el páncreas humanos normales. Queratina 5: IgG de conejo (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) y la próstata humana normal. Queratina 6: IgG de conejo (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) y la próstata humana normal. Queratina 7: IgG de conejo (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) y la próstata humana normal. Queratina 14: IgG1 de ratón (BioLegend, Inc., San Diego, CA) y la piel humana normal. Queratina 20: IgG2a de ratón (BioLegend, Inc., San Diego, CA) y de colon humano normal. Napsin A: IgG de conejo (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) y normales de pulmón humano. P63: IgG2a de ratón (BioLegend, Inc., San Diego, CA) y normal de próstata humano. TTF-1: IgG1 de ratón (BioLegend, Inc., San Diego, CA) y normales de pulmón humano
Resultados
Seguridad de la técnica de muestreo mínimamente invasiva
A partir de cada una de. los 12 pacientes con CPCP que consienten que participaron en este estudio, una sola muestra de biopsia con aguja adicional se recogió por PA guiada por el propósito de intentar iniciar xenoinjertos de tumores. Estas muestras de aspirado de células fueron extraídas de cualquiera de los tumores primarios de pulmón o ganglios afectados de una serie de pacientes con un promedio de 62 años (Tabla 1). Diez de estos doce tumores fueron diagnosticados como metastásico (
i
.
e
. Enfermedad extensa) y, de ellos, dos muestras se obtuvieron de los ganglios linfáticos afectados. Ninguno de los pacientes experimentaron efectos adversos atribuibles a la recogida de muestras de biopsia adicional.
PDX la generación del cáncer y caracterización
Después de la recogida, las muestras fueron enviadas durante la noche en hielo del Hospital Clínica Carilion en Roanoke, Virginia a Stemcentrx en San Francisco, California. Dentro de 30 horas de la biopsia, las células de las muestras de aspiración se implantaron subcutáneamente en ratones receptores inmunocomprometidos NOD /SCID y monitoreados para el crecimiento tumoral durante un máximo de 32 semanas. Mientras que una sola muestra de aspirado de células puede no representar plenamente la diversidad celular de un tumor del paciente, toma de muestras más completa y representativa del mismo tumor del paciente habría aumentado innecesariamente el riesgo para los pacientes. A las 26 semanas después de la implantación, las muestras de pacientes 8 de 12 (67%) producidos confirmaron tumores SCLC, con el tiempo medio para alcanzar los 150 mm
3 van de 81-151 días después del trasplante. Para facilitar ambos estudios inmediatos y potenciales, lo que resulta "paso 1" (P1), los tumores se fijaron en formalina, o disociaron en suspensiones de células individuales para la propagación inmediata en nuevos ratones receptores, más fenotípica y /o caracterización genética, o crioconservación. Entre las 4 muestras de pacientes con CPCP que no resultaron en líneas tumorales SCLC PDX útiles, tres fracasaron para iniciar tumores (LU108, LU112, LU125) y uno (LU122) consistieron en una derivación de linfoma de células B humanas. Para asegurar fiel propagación de los tumores no contaminadas, un ensayo de toma de huellas dactilares SNP se realizó en células tumorales primarias y células de PDX en cada pasaje. Estos resultados confirman que cada tumor PDX es único y derivado de su tumor primario cognado.
tumores SCLC tienen una morfología distinta caracterizado por la planeidad de las células, moldeo nuclear, y un citoplasma escaso [21]. En la mayoría de los casos, estas características se pueden utilizar para distinguir claramente SCLC de las diversas formas de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). tumores SCLC tienen una morfología variable, desde alta celularidad a las células tumorales escasos en medio de estroma y tejido necrótico. Sin embargo, la morfología característica de avena celular, moldeo nuclear, y escaso citoplasma se pueden confirmar fácilmente en muestras de tumor de PDX (Fig 1A y 1B, S1 y S2 Figs). frotis de aspirados celulares de tumores de pacientes y secciones FFPE de tumores PDX emparejados se tiñeron con Kwik-Diff mancha. se observaron similitudes morfológicas entre los tumores primarios y xenoinjertos (S5) fig. Mientras frotis de aspirados de células pobremente preservar la organización del tejido tumoral, morfologías celulares son similares.
FFPE secciones se prepararon a partir de tumores PDX (LU086p1 está representado). (A) Las secciones de tejido se tiñeron por IHC para los marcadores de diagnóstico de SCLC Chromagranin A (CHGA), sinaptofisina (SYP), o CD56. Las barras de escala representan 10um. (B) Las secciones de tejido se tiñeron por IHC para los marcadores no-SCLC diagnóstico de la queratina 5 (KRT5), la queratina 6 (KRT6A), la queratina 7 (KRT7), la queratina 14 (KRT14), la queratina 20 (KRT20), Napsin A (NAPSA) , TP63, o TTF1. Las barras de escala representan 10um. las células tumorales (C) PDX se disociaron en suspensiones de una sola célula y se analizaron mediante citometría de flujo para la expresión de EpCAM (CD326) y NCAM1 (CD56). Histogramas que muestran los niveles de expresión se muestran (línea de color negro oscuro), mientras que se determinó la señal de fondo utilizando un anticuerpo de control de isotipo (gris lleno).
Para confirmar sus identidades SCLC, los tumores fueron evaluados por su expresión de varias proteínas del sello de uso general para confirmar el diagnóstico. En primer lugar, las secciones de tejido FFPE de tumores PDX se tiñeron por IHC para los antígenos de diagnóstico de SCLC positivos cromogranina A, sinaptofisina y CD56 (Figura 1A y Figura S1). Además, las secciones de tejido PDX en general no expresan característica antígenos de no pequeñas de cáncer de pulmón de células, incluyendo queratina 5, queratina 6, queratina 7, queratina 14, queratina 20, TTF1, TP63, y Napsin A (Fig 1B y S2 Fig). La tinción positiva para la queratina 5, 6 de la queratina, queratina 14, o TP63 puede indicar carcinomas de células escamosas del pulmón. La tinción positiva para la queratina 7, TTF1, o Napsin A puede indicar el adenocarcinoma de pulmón. Queratina 20 se expresa normalmente en los cánceres del tracto gastrointestinal y su expresión negativa puede utilizarse para excluir tipos de cáncer de origen no pulmonar. Sólo 3 de SCLC 8 PDX en este estudio fueron positivos para TTF-1 de expresión. Mientras TTF-1 expresión en SCLC es común, se utiliza principalmente para identificar adenocarcinoma pulmonar y la tinción positiva probablemente se ve influenciado por el clon de anticuerpo. Por último, los tumores fueron disociadas de una sola célula suspensiones y caracterizados por citometría de flujo para verificar su origen epitelial humana (
i
.
e
. EpCAM humana +) y confirman la expresión de CD56 (Figura 1C y S3 Higo). Representante IHC y citometría de flujo se muestran imágenes de LU086 en la figura 1 y un resumen de tinción IHC para todas las líneas PDX probados se muestran en la Tabla 2.
En los tumores PDX, también se realizó resecuenciación dirigida de oncogenes (Tabla S1). TP53 es el gen más frecuentemente mutado en SCLC, que afecta a más o menos 3 de 4 tumores. Encontramos TP53 mutaciones en 6 de los 8 tumores. RB1 está mutado en aproximadamente la mitad de la SCLC y hemos encontrado mutaciones RB1 en 3 de los 8 tumores SCLC PDX probadas. Estas frecuencias de mutación son consistentes con la frecuencia de notificación de SCLC.
En resumen, los tumores SCLC PDX conservan parecido sorprendente con sus tumores primarios de SCLC a pesar de haber sido iniciado desde muy poco material. Por otra parte, la eficiencia con que los tumores PDX pueden establecerse utilizando el material de biopsia con aguja sugiere que la célula tumoral perpetuar (TPC;..
i
e
cáncer de células madre) de frecuencia es relativamente alto, lo cual cabría esperar dada la agresividad y la naturaleza refractaria de SCLC.
respuesta tumoral PDX a P /e refleja la respuesta clínica
para determinar si los tumores SCLC PDX, calculado según se describe en el presente documento, se reservan el P /E características de respuesta observadas en pacientes de los cuales se generaron los tumores PDX, tumores PDX fueron expuestos a regímenes de P /E combinados a dosis máximas toleradas cerca que equivalen a dosis similares a las del régimen utilizado en pacientes (
I
.
e página 5 mg /kg de cisplatino & amp; 24 mg /kg de etopósido, lo que equivale a aproximadamente 20 mg /m
2 cisplatino y 94 mg /m
2 etopósido). Después de la implantación subcutánea de células tumorales SCLC PDX y la aleatorización en cohortes de 5-8 ratones por grupo, una vez los tumores alcanzaron 150 mm
3-200 mm
3, los ratones se dosificaron en el día de la aleatorización con 5 mg /kg de cisplatino y 8 mg /kg de etopósido, y de nuevo el sobre después de dos días con un adicional de 8 mg /kg de etopósido cada día. Las cohortes que recibieron el vehículo se administraron 0,9% de NaCl en el mismo volumen utilizado para dosificar los ratones con P /E. La mayoría de los tumores PDX SCLC respondieron a este único ciclo de P /E quimioterapia, lo que resulta en una inhibición del crecimiento tumoral media de 79 ± 17% frente a los ratones tratados con vehículo (Tabla 3). A pesar de una robusta respuesta por la mayoría de los tumores de PDX, como se observa en los seres humanos, hubo recurrencia del tumor invariable, observado generalmente dentro de 3 semanas de la aleatorización (17 ± 10 días; n = 8), con todos los tumores SCLC PDX recurrentes dentro de 5 semanas. Por ejemplo, los tumores LU073 PDX respondieron bien a P /E, lo que demuestra una inhibición del crecimiento tumoral 82% y 35 dia (
i
.
e
. 5 semanas) tiempo hasta la progresión (figura 2A y Tabla 3), mientras que el paciente del cual se establecieron tumores LU073 PDX exhibió un tiempo de 31 semanas a la progresión en la clínica después de un ciclo completo de tratamiento (Tabla 1). Por el contrario, el modelo de tumor LU086 PDX iniciada desde una extensa paciente etapa que no responden bien al régimen clínico de P /E (TTP clínica = 7 semanas) también era mínimamente sensible a la terapia con P /E (41% TGI & amp; TTP = 0; figura 2B). En resumen, la gran mayoría de los modelos de tumores SCLC PDX establecidos demostró respuestas tumorales que se correlacionaron con las métricas TTP observados clínicamente (figura 2C; n = 5; R-cuadrado = 0,77;
P-valor = 0,050
). El valor atípico en solitario a esta tendencia fue PDX LU064 (Figura 2C; gris círculo abierto). La concordancia general entre los pacientes de tumores primarios y la respuesta del tumor a PDX P /E
in vivo
apoya la conclusión de que los tumores SCLC PDX iniciadas a partir de biopsias de tumores reflejan la biología del tumor del paciente y sirven como excelentes modelos para el mejor estudio y entender esta malignidad agresiva.
Al llegar a un volumen tumoral medio de 150 a 200 mm
3, ratones portadores de a) LU073p2 o B) los tumores LU086p3 PDX se asignaron al azar, administrado vehículo (triángulos cerrados) o P /e (círculos abiertos; 5 mg /kg de cisplatino en el día 1 y 8 mg /kg de etopósido en los días 1, 2 & amp; 3) del tratamiento, y los tumores se midieron semanalmente. El soporte indica el tiempo hasta la progresión (TTP). C) El TTP media de tumores PDX siguientes un curso de tratamiento P /E se representa gráficamente frente al TTP clínica observada. Los datos se representan como la media ± SEM y refleja cohortes de n = 5 ratones por grupo.
Discusión
Este tipo de cáncer es una enfermedad muy mortal, contra el cual poco se ha avanzado en las últimas décadas. En parte, la falta de progreso es atribuible a una escasez de modelos de tumores altamente relevantes disponibles para la investigación, derivada de la escasez percibida de tejido primario adecuado para el establecimiento de xenoinjertos de tumores derivados del paciente en ratones. CPCP se diagnostica habitualmente a través de la colección de muestras de biopsia por la PTA. El advenimiento de la USEB facilita biopsias más seguros, más fácil y más precisos, lo que permite una mayor disponibilidad de este material con fines de investigación. Aquí, se muestra que las pequeñas muestras de tejido de estas biopsias son suficientes para injertarse y establecer líneas de xenoinjertos de tumores en ratones con un riesgo mínimo para los pacientes donantes de manera eficiente. Estos tumores PDX se pueden generar por los colaboradores distantes y sus respuestas terapéuticas son similares a los de sus tumores primarios emparejados.
La eficiencia de injerto de muestras de tumores primarios en ratones inmunodeprimidos es influenciada por muchos factores, incluyendo origen del tejido, la viabilidad, tumor tipo, estadio y la agresividad, la cepa de ratón receptor, y otros factores técnicos y ambientales [6-8]. Por ejemplo, se ha informado de los tumores de mama primarios de injertarse como xenoinjertos con eficiencia 12,5%, mientras que los xenoinjertos de NSCLC han informado de la eficiencia de injerto tan altas como 90% [22-24]. Aquí, demostramos que los tumores de xenoinjertos de SCLC se pueden establecer con alta eficiencia, mantener histomorfología tumoral de los padres, y en gran medida replicar la respuesta del tumor a los padres P /E quimioterapia.
Mientras que las líneas tumorales SCLC PDX se han generado y se ha descrito previamente [9-13], el número de modelos de tumores SCLC PDX disponibles sigue siendo extremadamente limitada, y la generación más amplia de estos modelos no ha sido perseguido debido a la incapacidad percibida para iniciar xenoinjertos de material de biopsia con aguja. En este estudio, un pequeño esfuerzo de colaboración que se origina en una sola clínica produjo 8 líneas tumorales exitosas SCLC PDX en sólo 19 meses sin un requisito para el acceso local a los animales inmunocomprometidos. De hecho, el envío de noche de las muestras de aspirado con aguja fina de SCLC parecía haber tenido un impacto mínimo en la eficiencia de injerto del tumor, aunque incluso una mejor eficiencia de injerto se podría esperar con el mismo día de los xenotrasplantes. El éxito prodigioso de este estudio, se establece rápidamente una gran colección de líneas tumorales SCLC PDX a partir de una amplia gama de pacientes donantes utilizando muestras PA guiada, demuestra que este enfoque puede ser ejecutado con éxito.
Dado que los modelos tumorales fueron PDX generado a partir de una única aguja de biopsia de sitios primaria o nodales, es posible que las líneas resultantes PDX no contienen la heterogeneidad clonal completa presente en los pacientes. No obstante respuestas, 5 de 6 (83%) líneas PDX para los que se conocen tanto los datos de respuesta clínica y PDX a los regímenes de tratamiento P /E habían correlacionan
in vivo
. La concordancia de estos datos sugiere que o bien pocos clones estaban presentes en pacientes con CPCP en el momento de la biopsia o una sola pasada de la biopsia fue capaz de obtener y conferir una representación de los clones presentes. La única excepción a esta observación era LU064, que parecía tener una respuesta alterada a la P /E en ratones frente al robusta respuesta observada en el paciente de la que se deriva. Esta discrepancia puede reflejar el hecho de que un subclón más agresivo se estableció en ratones o mutaciones adicionales puedan haber revertido después de la implantación.
modelos de tumores SCLC que reflejan con precisión la enfermedad humana han sido difíciles de conseguir. líneas celulares tradicionales se propagan de forma rutinaria y estudiados en un
in vitro
entorno; sin embargo, estas líneas tienen diversas discrepancias irrevocables comparación con los tumores, tal como existen en pacientes [9, 25 a 27]. Sorprendentemente, muchas de las líneas celulares más comúnmente utilizados con el que estudiar la biología del tumor SCLC se generaron hace más de 30 años [28], y tienen alteraciones genómicas importantes probabilidades asociadas con décadas de
in vitro en Francia culture no condiciones fisiológicas [29]. Daniel
et al
. demostraron recientemente que incluso breves períodos de
in vitro Francia culture irreversiblemente altera la expresión génica en las células tumorales de SCLC [9], por lo tanto las líneas celulares se expandieron ampliamente
in vitro ¿Cuáles son poco probable que refleje adecuadamente el tumor parental.