Extracto
líneas celulares de cáncer estándar no modelan la situación heterogeneidad intratumoral suficientemente. Selección clonal da lugar a una población homogénea de células por la deriva genética. La heterogeneidad de las células tumorales, sin embargo, es particularmente crítico para los estudios terapéuticamente relevantes, ya que es un requisito previo para la adquisición de resistencia a los medicamentos y la recurrencia de los tumores. Aquí, se presenta el aislamiento de una línea celular de cáncer de páncreas primaria altamente carcinogénico, llamado JoPaca-1 y su caracterización detallada en múltiples niveles. Implantación de tan sólo 100 células JoPaca-1 en ratones inmunodeficientes dio lugar a tumores que eran histológicamente muy similar al tumor primario. La alta heterogeneidad de JoPaca-1 se reflejó por diversa morfología celular y un número sustancial de aberraciones cromosómicas. Comparado secuenciación de todo el genoma de JoPaca-1 y BxPC-3 reveló mutaciones en los genes alterados con frecuencia en el cáncer de páncreas. Excepcionalmente alta expresión de marcadores de células madre del cáncer y un alto potencial clonogénico
in vitro
y
in vivo
se observó. Todos estos atributos hacen de esta línea celular de un modelo extremadamente valiosa para estudiar la biología de los farmacéuticos y los efectos sobre el cáncer de páncreas
Visto:. Fredebohm J, M Boettcher, Eisen C, Gaida MM, Heller A, Keleg S, et al. (2012) Establecimiento y caracterización de un altamente tumorigénico y Cáncer Células Madre Enriquecido línea celular de cáncer pancreático como un sistema modelo bien definido. PLoS ONE 7 (11): e48503. doi: 10.1371 /journal.pone.0048503
Editor: Nathan A. Ellis, de la Universidad de Illinois en Chicago, Estados Unidos de América
Recibido: 5 de Julio, 2012; Aceptado: September 26, 2012; Publicado: 12 Noviembre 2012
Derechos de Autor © 2012 Fredebohm et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El trabajo contó con el apoyo financiero del Ministerio alemán de Educación e Investigación (BMBF) como parte del consorcio NGFN PaCaNet (BMBF-01GS08117). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Jörg Hoheisel y Jörg Tost sirven como editores de PLoS ONE. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y materiales ..
Introducción
El cáncer de páncreas es uno de los tipos más agresivos de cáncer de intercambio. La mortalidad es casi idéntica a la incidencia. Con una tasa de supervivencia a cinco años de menos del 5%, que es la cuarta causa más común de muertes relacionadas con cáncer en los países desarrollados [1]. Las razones para el mal pronóstico son el diagnóstico clínico tarde [2] y la resistencia del tumor a la quimioterapia estándar [3]. Con alrededor de 90% de los casos, adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) es la forma más común y responsable de la alta mortalidad; otros, los subtipos de cáncer poco comunes, tales como tumores quísticos, son menos letales. PDAC se supone que surgen de las células epiteliales del sistema ductal pancreático [4]. Distribución de las células tumorales en el tejido maligno es típicamente difusa y contiene zonas con diferentes grados de diferenciación histológica. También se caracteriza por una población de células tumorales heterogénea general (heterogeneidad intratumoral) [5], [6].
Un número sustancial de líneas de células PDAC de diferentes características se han establecido y proporcionar una fuente celular para investigar molecular aspectos de esta enfermedad devastadora (revisado exhaustivamente por Ulrich y col. [7]). Sin embargo, el cultivo de líneas de células bajo condiciones bien definidas inevitablemente conduce a la selección de las subpoblaciones en el tiempo. Por lo tanto, las líneas celulares normales no modelan la situación de heterogeneidad intratumoral, ya que la selección clonal ha tenido lugar durante muchos pasajes
in vitro
. Esto conduce a una población homogénea de células por la deriva genética [8]. Por el contrario, las líneas celulares primarias se asemejan muy estrechamente a la heterogeneidad del tumor primario y por lo tanto proporcionan un buen recurso para experimentos de cultivo celular.
La
in vivo
heterogeneidad de las células tumorales es especialmente crítico para experimentos probar los efectos de la quimioterapia, debido a la heterogeneidad proporciona la base para la selección de subpoblaciones resistentes, que a su vez forma la base de la resistencia a fármacos adquirida y la recurrencia del tumor [3], [9]. Entre la población de células resistentes, las células madre del cáncer desempeñan un papel especialmente relevante, ya que poseen la capacidad de auto-renovación [3] y son capaces de repoblar el tumor en el sitio primario o dar lugar a la formación de metástasis en sitios distantes [10].
células madre cancerosas o células iniciadoras de tumores que están impulsando la progresión tumoral han recibido mucha atención en los últimos decenios [11], [12], [13]. Para el cáncer de páncreas, varios marcadores moleculares se han sugerido para ser característico para células madre de cáncer. Entre ellas se encuentran la expresión del triplete CD44, CD24 y la ESA [14], la proteína de la superficie celular CD133 (prominin I) [15], [16], [17], y - más recientemente - aumento de la actividad de la aldehído deshidrogenasa 1 (ALDH1 ) [18]. Expresión de ALDH1 también se ha correlacionado con la invasión y la migración, así como características mesenquimales del tumor [19]. Por otra parte, se ha asociado con la supervivencia global pobre. Curiosamente, sin embargo, dos estudios muestran que en conflicto alta [19] o baja [20] expresión de ALDH1, tiene un efecto adverso sobre la supervivencia del paciente. Otra característica distintiva de la iniciación del tumor es la capacidad de formar esferoides tumorales o esferas en suspensión [21], [22]. También se cree que las células madre del cáncer de contribuir al desarrollo de resistencia a los medicamentos. Al mismo tiempo, se ha demostrado que el contenido de células que expresan CD133 puede ser enriquecido por el tratamiento gemcitabina [23], [24], [25] lo que sugiere un papel fundamental de este marcador CSC en la resistencia gemcitabina.
Aquí, se presenta el aislamiento y la caracterización de una nueva línea de células primarias derivadas directamente de una muestra de tumor humano de un paciente con adenocarcinoma ductal pancreático. Esta línea celular, denominada JoPaca-1, presenta una alta diversidad en la morfología y lleva a muchas aberraciones cromosómicas. Patológico, de ratón xenoinjertos y el tumor primario tienen un alto grado de similitud en términos de diferenciación de difusión y la infiltración de los tejidos circundantes de páncreas y no pancreática. células JoPaca-1 expresan la mesotelina marcador de tumor y varios citoqueratinas. Aparte de su gran heterogeneidad, probablemente la característica más importante de esta nueva línea celular es su alto contenido de tumor de células iniciadoras como se demuestra por
in vivo
ensayo de dilución limitante y los altos niveles de expresión de marcadores de células madre del cáncer. En vista de su gran parecido con el tumor original y en combinación con la caracterización molecular a fondo, la línea celular proporciona un excelente recurso para cualquier tipo de célula basada en lugar de un análisis basado en los tejidos.
Materiales y Métodos
consentimiento por escrito
Ética declaración
informado se obtuvo de los pacientes. La aprobación ética se obtuvo de la Comisión de Ética de la Facultad de Medicina de la Clínica Universitaria de Heidelberg, Alemania. Todos los cuidados y procedimientos de los animales siguieron las regulaciones legales alemanes y fueron previamente aprobados por la junta de revisión gubernamental del estado de Baden-Württemberg, Alemania.
Célula de aislamiento
tejido fresco se obtuvo a partir de un 46- años de sexo masculino paciente que sufre de cáncer de páncreas, que se sometió a una pancreatecto-duodenectomía conservadora del píloro. Durante la operación, se tomó una muestra del tumor extirpado y se almacenan directamente en solución de sales equilibrada de Hank (HBSS, H6648, Sigma Aldrich, Taufkirchen, Alemania) a 4 ° C durante 12 horas antes del procesamiento adicional. A continuación, la muestra de tejido se cortó en trozos de aproximadamente 5 mm de diámetro y se transfiere a un matraz de cultivo que contiene de Ham /F-12 Medio (21765-029, Life Technologies, Darmstadt, Alemania), suplementado con suero reactivo de reemplazo (S0638, Sigma Aldrich) . Las piezas de tejido unidas al sustrato y células crecieron a cabo después de una semana, la formación de grupos alrededor de los fragmentos de tejido. Fibroblastos y células estrelladas se eliminaron mediante dos rondas de separación enzimática de serie con 0,05% de tripsina /EDTA (25300054, Life Technologies). La población resultante de células tumorales se congeló a paso número cuatro y se almacena en alícuotas. Para los experimentos descritos aquí, se utilizaron JoPaca-1 en las células en los pasajes 6 a 19. La inmortalización de las células aisladas no era necesario.
Cultivo de células
Las líneas celulares de cáncer de páncreas bien establecidos MiaPaCa -2, MDAPanc-28, BxPC-3, AsPC-1, y Capan-1 se obtuvieron de ATCC (Rockville, MD, EE.UU.). Además, FamPAC fueron amablemente proporcionados por el profesor Eisold [26] y las células HPDE c7 por el profesor Francisco Real (Centro de Investigación español Nacional del Cáncer, CNIO) [27]. BxPC-3 fue autenticado por la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (DSMZ, Braunschweig, Alemania). Todas las líneas celulares estaban libres de micoplasmas, virus y contaminación línea celular como probado por PCR [28]
Las células se cultivaron en medio y los suplementos estándar, que se obtuvieron de Life Technologies, Darmstadt, Alemania menos que se especifique lo contrario.: JoPaca-1 en de Isocove medio de Dulbecco modificado (IMDM), 10% de suero de ternero fetal (FCS) y 1% de penicilina-estreptomicina (P /S) (Cat No. 21,056.); BxPC-3 en Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640, 10% de FCS, y 1% de PS (Cat No. 21,875.); c7 HPDE en queratinocitos libre de suero Medio (KSFM), receptor del factor de 0,15 ng /ml de crecimiento epidérmico, y 25 mg /ml de extracto de pituitaria bovina (Cat. No. 17005075) [29]. Para la formación de esfera tumor, JoPaca-1 células fueron cultivadas en /F12-medio de Ham suplementado con 20 ng /factor de crecimiento básico de fibroblastos ml (bFGF, F0291, Sigma Aldrich, Munich, Alemania), 1 × B-27 suplementos (Cat. No . 0080085-SA), 2 mM de L-glutamina (Cat. Nº 25.030.024), y el 1% P /S en placas de unión bajas (Cat. No. 3473, Corning, Amsterdam, Países bajos). Las células se dividieron en una proporción de 1 a 10 a menos que se indique lo contrario. La viabilidad celular después del tratamiento con gemcitabina (G6423, Sigma Aldrich) se determinó mediante el ensayo de resazurina [30]. Para el tratamiento a largo plazo con gemcitabina, células JoPaca-1 en el paso 10 se sometieron durante un período de 72 horas a concentraciones crecientes de la droga: 10, 15, 20 y 25 nM. Las células se dividieron tercera después de cada ronda de tratamiento y se compararon con un control en el paso 13 para la expresión de CD133. Imágenes de los padres JoPaca-1 y sub clones en la cultura fueron tomadas en un microscopio invertido (DM IRBE, Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania) equipado con una cámara CCD (exploración progresiva CV-M1, JAI, Frankfurt, Alemania). Se añadieron las barras de escala en ImageJ (NIH, Bethesda, MD, EE.UU.) mediante el cálculo de tamaños de píxel medidos
Citogenética -. fluorescencia multicolor
In situ
hibridación (mFISH)
JoPaca -1 células fueron tratadas con 10 ng /ml de vinblastina a 37 ° C, 5% de CO
2 durante 4 h para detenerlos en la metafase. metafase para untar se prepararon de acuerdo con los protocolos estándar [31]. En resumen, las células en suspensión se trataron con KCl 75 mM durante 20 min a 37 ° C y se fijaron con solución de hielo frío Carnoy (ácido methanol:acetic = 3:01) en tres etapas de lavado. La solución de células fijadas se redujo de 1 metro en un portaobjetos inclinado que previamente se había humedecido con 70% de etanol. mFISH se realizó usando el color de múltiples kit sonda 24XCyte (MetaSystems, Altlussheim, Alemania) según las instrucciones del fabricante. diferenciales metafase hibridados se analizaron utilizando un microscopio de fluorescencia asistida por ordenador (Axioplan 2, Zeiss, Göttingen, Alemania) equipado con conjuntos de filtros apropiados. Las imágenes fueron grabadas con una cámara CCD (Fotometría, Tucson, AZ, EE.UU.) y analizados mediante burlas ™ Software SpectraVysion (Vysis, ahora distribuido a través de Applied Imaging).
Clonigénicas potencial y tumourgeneity
In vitro
-Limitar ensayo de dilución.
JoPaca-1 en las células se sembraron en una placa de 96 pocillos en una serie de diluciones uno a uno a partir de 125 células por pocillo, de cada dilución en 16 replica. El medio no se cambió para permitir la señalización autocrina. Después de 10 días, se contaron los pocillos que muestran colonias distintas. Después de 15 días, se fotografiaron las colonias que muestran diversos fenotipos morfológicos.
En vivo
-Limitar ensayo de dilución.
experimentos de xenoinjertos iniciales se llevaron a cabo mediante la inyección de células Mio 1 en ratones NOD. cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl (NOD /SCID /o γ GSN) ratones. Para evaluar en la tumorigenicidad in vivo de JoPaca-1, 104, 103 y 102 células, respectivamente, se inyectaron en 70 l de Matrigel (2 mg /ml) (BD, Heidelberg, Alemania) en el cuerpo de páncreas de ratones GSN. el injerto con éxito de tumores y el crecimiento subsiguiente se controló por palpación regular del sitio de implantación.
Para cuantificar la frecuencia de potencial y de iniciación de tumor clonogénico, los datos se analizaron mediante un algoritmo de regresión de ajuste (ELDA) [32].
H & amp; e tinción inmunohistoquímica y de xenoinjertos de tumores primarios y
tumores explantados fueron incrustados en bloques de parafina y se cortaron secciones de 4 micras de espesor utilizando un microtomo. Hematoxilina y eosina (H & amp; E) tinción así como inmunohistoquímica (IHC) se realizaron de acuerdo con procedimientos estándar. Brevemente, las muestras de tejido fueron deparaffinised usando Roticlear (A538, Carl Roth, Karlsruhe, Alemania) y se hidrataron en una serie de etanol. La recuperación del antígeno se consiguió mediante calentamiento en 10 mM de tampón de citrato (pH 6,1). Los portaobjetos se bloquearon utilizando Power Block (BioGenex, Fremont, CA, EE.UU.) y se incubaron con el anticuerpo primario anti-ALDH1 (. Mat N ° 611194, BD Biosciences) utilizados en 1:1000; anti-citoqueratina 19 utilizado en 1:50; anti-citoqueratina AE1 /AE3 (código M3515, Dako) utilizado en 1:300; anti-CD133 /1 (AC133) (130-090-422, Miltenyi Biotech) que se utiliza a las 1:50; y un control que contiene universales IgG de ratón negativos (IS750, DakoCytomation) utilizaron a una dilución de 1:02. Los portaobjetos se incubaron a 4 ° C durante 16 h. Para la detección del anticuerpo primario, un anticuerpo anti-ratón secundario conjugado con peroxidasa (K4001, DakoCytomation) se aplicó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La reacción de color con diaminobenzodine (DAB) se counterstained con hematoxilina. Por último, las diapositivas fueron vistos usando un microscopio Axioplan 2 e imágenes tomadas por una cámara CCD AxioCam HRc (Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Alemania). Las barras de escala se han añadido en el software que lo acompaña AxioVision 4.
inmunofluorescencia
Por inmunofluorescencia de mesotelina y citoqueratina 19, JoPaca-1, las células fueron cultivadas BxPC-3 y c7 HPDE en portas de cultivo (Cat . 354559, BD Biosciences), se fijaron con paraformaldehído al 2% y se permeabilizaron con 0,2% Triton X-100 durante 5 min. Los portaobjetos se bloquearon en solución salina tamponada con fosfato (PBS) con 10% de albúmina de suero bovino (BSA) y epítopos recuperado con PBS suplementado con 10% de proteinasa K. anticuerpos IgG1 contra mesotelina K1 (Cat. Sc-33672, Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Alemania ) y citoqueratina 19 (clon RCK108, Code-Nr. M 0888, DakoCytomation, Hamburgo, Alemania), así IgG1 de ratón (MCA928, Serotec, Puchheim, Alemania) como control negativo se utilizaron a una dilución de 1:50. El anticuerpo secundario Alexa Fluor 488 cabra anti-ratón IgG1 (A-11001, Life Technologies) se utilizó a una dilución de 1:500. Los portaobjetos se montaron con medio acuoso que contiene 4 ', 6-diamidin-2-fenilindol (DAPI) a los núcleos tinción de contraste (sc-24941, Santa Cruz Biotechnology). Las imágenes fueron tomadas en un microscopio de campo amplio equipado con una cámara CCD AxioCam (Zeiss Observador de la célula, Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Alemania).
fluorescente de células asistida (FACS)
La expresión de CD133 fue detectada por FACS (FACS Canto II, BD Biosciences, Heidelberg, Alemania), utilizando conjugado con ficoeritrina CD133 /2 (293C3) y CD133 /1 (AC133) anticuerpos (Milteny Biotech, Bergisch Gladbach, Alemania). Actividad de ALDH1 se midió utilizando Aldefluor inhibidor de sustrato +/- DEAB (STEMCELL Technologies, Grenoble, Francia). Se detectaron células ALDH-brillante (ALDH
BR) en el canal FITC y compensados contra la ficoeritrina y viceversa usando células marcadas individualmente como controles. La expresión del triplete CD44 /CD24 /ESA fue probada usando los siguientes anticuerpos de BD Biosciences: (Cat. 347200) (Cat. 560533) EpCAM (ESA) -APC, CD44-PE-Cy7, CD24-FITC (Cat 555427). . La incubación de las células con anticuerpos y sustratos, FcR de bloqueo y etapas de lavado se hicieron según las instrucciones del fabricante.
genoma entero secuenciación
ADN genómico de las líneas celulares JoPaca-1 (paso 8) y BxPC-3 se extrajo utilizando protocolos estándar. secuenciación del genoma completo y alineación lectura se realizó usando un secuenciador 2000 Illumina HighSeq en el Centro Nacional de Génotypage (Evry, Francia). Los datos de los mejores 17 no es sinónimo de codificación de los genes mutados en el cáncer de páncreas se obtuvo del Instituto Sanger catálogo de mutaciones somáticas en el sitio web del cáncer (http://www.sanger.ac.uk/cosmic) [33]. Además, se incluyeron tres genes de la base de datos OMIM bajo el término de búsqueda "cáncer de páncreas" (http://www.omim.org/entry/260350) [34]. Todos estos genes fueron revisados en busca de mutaciones no sinónimas en exonic BxPC-3 y JoPaca-1 (Tabla S2). Por otra parte, las variaciones no codificantes asociados con el cáncer de páncreas se obtuvieron a partir de estudios de asociación de todo el genoma (GWAS) (Tabla S3). La enumeración de tipo salvaje y mutado lee hecho por la mano usando el contar cada mapeado leer Ensembl Genome Browser [35] y el genoma espectador integrador [36].
secuenciación de Sanger de
KRAS
La región que rodea el codón 12 del
KRAS
se amplificó a partir de ADNc generado a partir de las líneas celulares mediante PCR estándar utilizando Phusion polimerasa (F-530, Fermentas, St. Leon-Rot, Alemania) y los siguientes cebadores : KRAS-F (5'-CGC CCC CAT TTC GGA CTG GG-3 ') y KRAS-R (5'-ACT CCT CTT GAC CTG CTG TGT CG-3'). Los productos de PCR fueron secuenciados por GATC (Constanza, Alemania) usando el cebador KRAS-F.
Resultados
células JoPaca-1 se derivan de adenocarcinoma ductal pobremente diferenciado del páncreas
para el aislamiento de las células del tumor primario, se obtuvo tejido fresco de una de 46 años de edad paciente varón de cáncer de páncreas, que se sometió a una pancreatecto-duodenectomía conservadora del píloro (Whipple pp-operación). Él murió cinco meses después de la cirugía. El examen histopatológico del tejido reveló un adenocarcinoma ductal pobremente diferenciado del páncreas, con infiltración tumoral del duodeno, el conducto biliar intrapancreática y el tejido blando peripancreática. Perineural, lymphogenic y la infiltración tumoral hematógena se pudo encontrar, así como dos metástasis ganglionares en 22 ganglios linfáticos regionales. El estadio TNM era pT3, pN1 (2/22), G3. Clínicamente, no había aparición de metástasis de órganos distantes. La línea celular primaria JoPaca-1 se aisló a partir del tejido resecado cáncer como se describe en detalle en la sección de métodos. La población resultante de células tumorales puros se congeló después de cuatro pasajes de crecimiento. Para los experimentos descritos a continuación, se utilizaron células de 6 a 19 pasajes. Las células se cultivaron en medio IMDM estándar de cultivo celular suplementado con 10% de FCS y 1% de PS.
subclones de JoPaca-1 revelan la heterogeneidad fenotípica de la población parental
células individuales de JoPaca-1 crecido en completo aislamiento dio lugar a colonias que mostraban una morfología variable (Fig. 1). Por lo general, se pudieron observar dos formas de crecimiento: la formación cercana isla de contacto y sin contacto de dispersión (Figura 1B, C.). heterogeneidad celular también se refleja en la variedad de formas diferentes de células que se observaron. Ronda y las células vesiculares se produjeron al igual que un fenotipo de tipo huso. Además, la formación de seudópodos largos podría ser visto (Fig. 1D-F). Ambos, diferentes características de crecimiento y de las diversas formas de células también puede ser detectada en la población parental (Fig. 1A), indicando su buena representación de las sub aislados clones.
Imágenes de contraste de fase se presentan de JoPaca 1-células parentales y subclones que muestra diferentes características de crecimiento y morfologías. A. JoPaca-1 población celular parental. ANTES DE CRISTO. Dos características de crecimiento diferentes se pueden observar: Primer contacto de formación de islas (B) y la difusión de no contacto (C). D-F. Se observaron tres formas diferentes de células:. redondo y vesicular (D), de tipo huso (E), y la pseudo-pod formación de células (F) guía empresas
células JoPaca-1 son tetra a pentaploid y genómicamente inestable
JoPaca-1 fue detenido en metafase para estudiar las aberraciones cromosómicas y cariotipo. Se analizaron en metafase para untar de 26 células. Ellos muestran un tetra- a cariotipo pentaploidic con cinco aberraciones cromosómicas comúnmente observados (Fig. 2). Estas son las translocaciones t (17; 5) (5; 17), t (7; 4), t (13; 12) y t (2; 9) y una inversión del cromosoma 13 (I13). En total, se observaron 47 aberraciones diferentes en los 26 karyograms. Pero para las aberraciones relativamente frecuentes de arriba, la mayoría (38) se observaron sólo una vez. Otros tres translocaciones se encontraron dos veces o tres veces (Tabla S1). El cromosoma Y se perdió en 20 de los 26 karyograms.
Un representante de karyogram JoPaca-1 se muestra aquí. JoPaca-1 es un tetra a la línea celular penta-ploidic. Debajo de la imagen resumen, se presentan los cinco aberraciones más comúnmente observados en 26 karyograms. Las translocaciones pueden ser identificados por hibridación de sondas de diferentes colores resultantes en los cromosomas de dos colores. Inversión del cromosoma 13 (i13) es la fusión de dos q-brazos en el cinetocoro. El cromosoma Y se pierde a menudo en las células tumorales, ya que es en esta representación.
shows JoPaca-1 aumentó la resistencia a la gemcitabina más de BxPC-3
JoPaca-1 se compararon células a BxPC-3 en su respuesta a la gemcitabina, la primera línea de tratamiento quimioterápico estándar del cáncer de páncreas. En ausencia de la droga, el tiempo de duplicación fue de 28 h para JoPaca-1 y 19 h para BxPC-3. Durante un período de crecimiento 72 h, esto corresponde a 3,79 divisiones celulares de BxPC-3 y 2,57 de JoPaca-1. Con el fin de dividir 3,79 veces, JoPaca-1 requeriría 106 h. Por consiguiente, una incubación prolongada con gemcitabina tenía un efecto más fuerte sobre la viabilidad celular de JoPaca-1 (Fig. 3A). En comparación con BxPC-3, JoPaca-1 mostraron una tolerancia sustancialmente superior a la gemcitabina con una CI
50 de 28 nM en comparación con 11 nM de BxPC-3, incluso después de la mitad de la población de células se sometieron a una ronda adicional de mitosis (3.79+ 0.49 = 4.28 divisiones celulares = 120 h) (Fig. 3B). Por lo tanto, el aumento de la resistencia de JoPaca-1 es independiente de la tasa de proliferación.
Células
BxPC-3 y JoPaca-1 que trata con concentraciones crecientes de gemcitabina durante 72, 96, y 120 horas. La viabilidad celular se normalizó a los controles no tratados. Los puntos de datos representan los resultados de seis experimentos repetidos con desviaciones estándar indicadas por barras de error en promedio. A. El aumento de tiempo de incubación con resultados gemcitabina en un aumento de la citotoxicidad de JoPaca-1. B. La viabilidad celular se comparó entre 3.79 y 4.28 divisiones celulares para BxPC-3 y JoPaca-1, respectivamente. JoPaca-1 muestra una mayor tolerancia hacia la gemcitabina de BxPC-3, incluso después de una incubación prolongada de 0,49 divisiones celulares.
células JoPaca-1 son altamente tumorigénicas y han aumentado el potencial clonogénico
Para establecer potencial clonogénico de JoPaca-1, las células en el paso 10 se contaron y se sembraron en una serie 1-1 dilución en dos placas de 96 pocillos a partir de 125 células por pocillo abajo a 4 células por pocillo. Cada dilución se realiza 16 veces. Después de 15 días de incubación, se contaron los pocillos que contenían colonias distintas. análisis computacional de los recuentos de colonias utilizando el "Extreme LDA" algoritmo [32] mostró que una celda en 48 (~ 2%) fue capaz de formar una colonia (Fig. 4A). Este potencial clonogénico es diez veces mayor que la de la línea celular establecida Capan-1 con 0,2% [19].
Clonigénicas potencial y tumourgenicity de JoPaca-1 se determinaron mediante la limitación de ensayos de dilución
in vitro
y
in vivo
. A. La dilución de las células en una placa de 96 pocillos y recuento de células que contienen de colonias después de 10 días conduce a un potencial clonogénico de 1 célula en 48 tal como se calcula por ELDA [32]. B. inyección ortotópico de 10.000, 1.000 y 100 células JoPaca-1 en 6 NOD.Cg-
Prkdc
SCID IL2Rg
tm1Wjl
ratones cada uno dio lugar a la formación de tumores que fueron extirpados, ponderada y fotografiado. Se muestran las masas medias tumorales.
Para establecer la tumourgenicity de JoPaca-1
in vivo
, tres grupos de seis NOD.Cg- inmune comprometido
Prkdc
SCID IL2Rg
tm1Wjl
los ratones fueron inyectados con 10 ortotópica
4, 10
3 y 10
2 células, respectivamente. Después de 100 días, todos los ratones estaban todavía vivos. En total, 11 ratones se habían formado tumores: 6/6 de los animales con 10
4 células, 4/6 con 10
3 células y 1/6 con 10
2 células (Fig. 4B). la frecuencia del tumor iniciadoras se estimó mediante el algoritmo ELDA a 1 célula en 831 con un límite inferior y superior de 1 en 2114 y 1 de cada 327, respectivamente. Los tumores fueron extirpados y ponderados. El peso del tumor se correlaciona directamente con el número de células inyectadas. Con 10
4 células, el peso medio del tumor fue de 927 mg; inducción con 10
3 células dio lugar a tumores de 618 mg en promedio. El tumor único resultante de 10
2 células tenía 300 mg.
células JoPaca-1 invaden el tejido circundante normal y aparecen metástasis potencial in vivo
tejido muscular liso
El tumor primario había invadido de el duodeno proximal (Fig. 5A). xenoinjertos de tumores no fueron encapsulados; Además revelaron un frente invasivo con áreas de expansión tumor infiltrante en el tejido páncreas normal adyacente (Fig. 5B) Las metástasis se pudo observar en uno de cada tres ratones durante los experimentos iniciales, pero no se analizaron más (Fig. 5C).
A continuación se ilustran H & amp; e manchas de primaria (A) y cortes de tejido de xenoinjerto (B). A. tejido del músculo liso del duodeno fue infiltrada por células tumorales del tumor primario. B. frente invasivo de tumores de xenoinjertos con áreas de expansión del tumor infiltrante en el tejido normal adyacente páncreas (puntas de flecha). C. Uno de cada tres ratones NSG desarrolló metástasis durante los experimentos iniciales, cuando se inyectaron células Mio 1 ortotópica (puntas de flecha).
Los tumores primarios y xenoinjertos recaudados de JoPaca-1 tienen muy similar histología
Histológicamente, los tumores de xenoinjertos muestran un alto grado de similitud con el tumor primario. patrones de morfología celular y crecimiento fueron en general poco diferenciado caracterizan por un crecimiento celular o solo sólido. Sin embargo, no se encontraron áreas de los patrones de crecimiento micropapilares y formaciones ductular tanto en el tejido primario y xenoinjerto (Fig. 6A). Además, se observó el comportamiento migratorio e invasivo en un grado similar. tejidos primarios y xenoinjertos mostraron infiltración perineural y la invasión en linfoides y los vasos sanguíneos (Figura 6B, CII y 11c.)
A continuación se ilustran H & amp;. E manchas de tumores primarios y xenoinjertos. A. Primaria y xenoinjertos de tumores muestran fenotipos de diferenciación similares que van desde la mala diferenciación global (-) sobre el crecimiento micropapilar (x) a las formaciones ductular más diferenciados (*). B. Perineuronales invasión se puede observar en ambos tumores primarios y xenoinjertos (cabezas de flecha). C. Aquí se presentan áreas de necrosis tumoral, delimitadas por los granulocitos neutrófilos (C i, asteriscos) y la infiltración tumoral de los vasos linfáticos (C II, cabeza de flecha). D. Distribución del estroma (S) en el tejido del tumor primario y xenoinjerto. Las células tumorales de ambas muestras están incrustados en estroma tumoral desmoplásico. Mientras que en el estroma del tumor primario se dispersa por todo el tumor, se localiza más en el xenotrasplante.
Características debido a las características inmunológicas fueron naturalmente más pronunciada en el tumor primario que en el xenoinjerto como los ratones del GSN son incapaces de montar una respuesta inmune innata o adaptativa. Estas características inmunológicas incluyen áreas de necrosis de tumor que fueron demarcadas por los granulocitos neutrófilos (Fig. 6CI) así como las células inflamatorias que infiltran, principalmente los linfocitos y los granulocitos. En el tumor primario, las células se incrustan en el estroma del tumor desmoplásico. xenoinjertos de tumores se intercalan en parte con el tejido del estroma también. Aquí, estas áreas son localizados y no tan omnipresente como en el tumor primario (Fig. 6D).
JoPaca-1 expresa citoqueratinas y el marcador de tumor mesotelina
inmunohistoquímica de citoqueratinas se realizó en primaria y cortes de tejidos tumorales de xenoinjertos. Ambos, tumores primarios y xenoinjertos tiñeron positivo para los clones pan-citoqueratina AE1 y AE3. La expresión de citoqueratinas en el tumor primario fue ligeramente más dispersos que en los xenoinjertos, en los que claramente manchado las células epiteliales que recubren el lado luminal de los conductos. Más específicamente, la expresión de citoqueratina 19 fue aún más característicamente ductal en ambos tejidos. Isotipo controles fueron negativos (Fig. 7). Inmunofluorescencia confirma la expresión de citoqueratina 19 en células aisladas JoPaca-1. La citoqueratina 19 es una proteína de filamentos intermedios y fue expresada por JoPaca-1 en la creciente frente de una colonia de células (Fig. 8A). Además, JoPaca-1 se ensayó para la expresión de la mesotelina marcador tumoral. La línea establecida de células de cáncer pancreático BxPC-3, y la línea celular normal c7 HPDE ductal pancreático se utilizaron como controles positivos y negativos, respectivamente. La expresión de la mesotelina se pudo detectar en JoPaca-1 y células BxPC-3, pero no en las células del conducto pancreático HPDE c7 normal. Isotipo controles fueron negativos (Fig. 8B).
La inmunohistoquímica se realizó en cortes de tumores primarios y xenoinjertos. Citoqueratinas AE1 /AE3 y más específicamente citoqueratina 19 se expresaron en las estructuras ductales de tumores primarios y xenoinjertos (marrón). controles de isotipo fueron negativos.
imágenes de contraste de fase se presentan muestran que la mesotelina y citoqueratina 19 tal como se detecta en JoPaca-1 fijo, BxPC-3 y células c7 HPDE. Ambas proteínas se marcaron con el anticuerpo secundario primario y conjugado con FITC (verde). Los núcleos se tiñeron con DAPI (azul). controles de isotipo fueron negativos. A. La citoqueratina 19 se expresa en la creciente frente a células JoPaca-1. B. JoPaca-1 y la línea celular establecida BxPC-3 ambos expresan mesotelina mientras que la normal, c7 pancreático ductal HPDE línea celular no lo hace.
células JoPaca-1 son altamente enriquecido en los marcadores de células madre del cáncer
se cree que las células madre del cáncer de auto-renovación de ser la fuerza impulsora detrás de la progresión del tumor y la responsable de la resistencia contra la quimioterapia.