Extracto
cáncer de mama inflamatorio canina acciones (IMC) epidemiológica, características histopatológicas y clínicas con la enfermedad en los seres humanos y se ha propuesto como un modelo natural para el cáncer de mama inflamatorio humano (IBC). El objetivo de este estudio fue caracterizar una nueva línea celular de IMC (IPC-366) para el estudio comparativo de ambos IMC y el IBC. Se recogieron células tumorales de un perro femenino IMC clínica. Las células se cultivaron en condiciones adherentes. Se evaluaron las características de crecimiento, citológicos, ultraestructurales y de inmunohistoquímica (IHC) de IPC-366. Diez ratones hembra Balb /SCID se inocularon con células IPC-366 para evaluar su tumorigenicidad y el potencial metastático. Prueba de aberración cromosómica y Cariotipo revelaron la presencia de aberraciones estructurales, reordenamientos numéricos y neutrales, lo que demuestra una inestabilidad cromosómica. El examen microscópico de los tumores reveló una morfología epitelial con marcada anysocytosis. Citológico y el examen histológico de los frotis y cortes ultrafinos por microscopía electrónica revelaron que el IPC-366 está formado por gran ronda altamente maligno o células poligonales que se caracterizan por una marcada atipia y nucleolos prominentes y células multinucleadas frecuentes. Algunas células tenían espacios vacíos citoplasmáticos cubiertos por membrana citoplasmática se asemejan a las células endoteliales de los capilares, un fenómeno que se ha relacionado con la mímica s de origen vascular. IHC caracterización de IPC-366 era de tipo basal: las células epiteliales (AE1 /AE3 +, + CK14, vimentina +, actina, p63-, ER-, PR-, HER-2, E-cadherina, sobreexpresan la COX-2 y alta Ki- índice 67 proliferación (87,15%). a las 2 semanas después de la inoculación de las células IPC-366, se encontró una masa tumoral en 100% de los ratones. a las 4 semanas metástasis en pulmón y los ganglios linfáticos fueron encontrados. tumores xenógrafo mantienen las características originales de IHC de . el tumor perra En resumen, la línea celular IPC-366 es un modelo de crecimiento rápido línea celular triple negativo maligna del carcinoma de mama inflamatorio que puede ser utilizado para el estudio comparativo de ambos IMC y el IBC
Cita.: Cáceres S, Peña L, de Andrés PJ, Illera MJ, López MS, Woodward WA, et al (2015) Establecimiento y caracterización de una nueva línea celular de Canine inflamatorio cáncer de mama:.. IPC-366 PLoS ONE 10 (3): e0122277 doi: 10.1371 /journal.pone.0122277
Editor Académico: Rajeev Samant, Universidad de Alabama en Birmingham, Estados Unidos |
Recibido: 28. de noviembre de, 2014; Aceptado: February 17, 2015; Publicado: 25 Marzo 2015
Derechos de Autor © 2015 Cáceres et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel
Financiación:. la financiación fue proporcionada por el Ministerio español de Educación y Ciencia (proyecto de investigación sin SAF desde 2009 hasta 10572.) de Carolina del Sur, LP, PJA, MJI, y la JCI. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer de mama inflamatorio (CMI) es la neoplasia mamaria más agresivo que afecta a las perras [1, 2]. Su homólogo de la enfermedad en los seres humanos se conoce como cáncer de mama inflamatorio (IBC) y representa menos del 6% de los diagnósticos de cáncer de mama humano con una pobre supervivencia en las mujeres [3, 4]. En ambas especies, este tipo de cáncer es altamente angiogénicos y angioinvasiva [5-8]. La principal característica histológica de la enfermedad en ambas especies es la invasión masiva de los vasos linfáticos dérmicos por las células neoplásicas que bloquea el drenaje linfático causando el edema característico [1, 9].
Existen considerables similitudes epidemiológicos, clínicos e histopatológicos compartida por el CIB y el IMC, por lo tanto, éste se considera un buen modelo espontánea para estudiar la enfermedad humana [2, 8]. El uso de líneas celulares en la investigación del cáncer ofrece ventajas en el examen del crecimiento celular y la progresión [10-12]. se han establecido más de 33 líneas celulares de cáncer de mama humano de tumores primarios, tumores metastásicos y derrame pleural [10, 11, 13]. Sin embargo, para la realización de estudios sobre el IBC, la disponibilidad líneas celulares se limitan a SUM149, SUM 190 y MDA-IBC-3, FC-IBC02 [12, 14, 15].
En los últimos años varios mamaria canina líneas celulares de carcinoma se han desarrollado [16-18], aunque ninguno de ellos es una línea de células inflamatorias canina. Por lo tanto, es deseable desarrollar y establecer una línea celular canina IMC para comparar el tipo de cáncer de mama inflamatorio en ambas especies y para facilitar aún más en estudios in vitro. El objetivo de este estudio fue establecer la primera línea celular IMC (IPC-366) y caracterizar en términos de inmunofenotipo y tumorigenicidad.
Materiales y Métodos
muestra tumoral
una línea celular IMC (IPC-366) se establece a partir de una muestra IMC primaria canina obtenido inmediatamente después de la eutanasia de una perra clínica e histopatológicamente con diagnóstico de IMC, de acuerdo con las características de diagnóstico previamente IMC publicados para esta especie [1, 19] : creciendo rápidamente la enfermedad en las glándulas mamarias y la superposición de la piel, con eritema, firmeza, calor, edema, engrosamiento, y signos de dolor, de acuerdo con el clínico veterinario remitente. El tumor mamario canino original fue diagnosticado como un carcinoma sólido con émbolos tumor múltiple en los vasos linfáticos dérmicos superficial (Fig. 1), lo que confirma el diagnóstico de IMC [2, 20]. Después de la eutanasia, las muestras tumorales se obtuvieron rápidamente en la necropsia y se procesaron para la confirmación histopatológica de IMC y el cultivo celular. fragmentos de tumor (1,5 cm) se colocaron en Medio de Eagle Modificado (MEM) con una solución de penicilina-estreptomicina (Sigma Aldrich, Madrid)
secciones de parafina del tumor, H & amp;. E. A (10X) y B (20X). émbolos neoplásicas en la dermis superficial. Las células tumorales muestran una marcada anisocitosis y anisocariosis, y grandes nucleolos evidentes. Infiltran las células tumorales (flecha).
La histopatología y la necropsia se realizó en el Servicio de Anatomía Patológica del Hospital Clínico Veterinario Complutense (Universidad Complutense de Madrid). El Comité para el Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad Complutense de Madrid, España aprobó los protocolos clínicos y experimentales para este estudio (número: 115). Todos los procedimientos fueron realizados de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y se ajustaban a la Directiva de la UE pertinente.
Establecimiento de la línea celular
El tejido tumoral se fragmentó y se lavó (3 veces) con solución salina equilibrada de Hank con 1% de solución de penicilina-estreptomicina (Sigma Aldrich). A continuación, los fragmentos de tumor se desagregaron con colagenasa tipo 1A (Sigma Aldrich) a 37 ° C en una atmósfera humidificada de dióxido de carbono al 5% durante 2 horas con agitación continua. A continuación, la suspensión de tejido desagregada se centrifugó a 1.000 rpm, 20 ° C durante 5 min y las células sedimentadas se resuspendieron en medio Eagle modificado Mezcla Nutriente de Dulbecco F-12 Ham (DMEM /F12) que contiene 10% de suero bovino fetal (FBS) (Sigma Aldrich), 1% de solución de penicilina-estreptomicina y 1% de L-glutamina (Sigma Aldrich). La suspensión celular se colocó en 25 cm
2 frascos de cultivo (CONTROLTECNICA Instruments, Madrid) y se mantuvieron en una atmósfera humidificada de dióxido de carbono al 5% a 37 ° C. se observó de cultivo celular diariamente por un microscopio de contraste de fase
.
Una vez que las células cultivadas alcanzaron 90% de confluencia se lavaron con solución salina equilibrada de Hank suplementado con solución peninicilin-estreptomicina y se dispersa en 0,25% de tripsina (Sigma Aldrich) con PBS que contenía EDTA. Los subcultivos se preparan a partir de células dispersas por la resiembra en las nuevas 25 cm
2 frascos a una concentración de 1x10
5 células /ml. Otras células dispersas se suspendieron en DMEM /F12 que contiene 20% de FBS y 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) (Sigma Aldrich) y criopreservados a -80 ° C. El establecimiento de IPC-366 se examinó en el paso 30
ª.
Crecimiento Ensayo
Las células en el paso 30
ª se sembraron a 1xl0
5 células en 25- cm
2 frascos de cultivo y se mantuvieron en medio DMEM completo /F12 a 37 ° C durante 7 días. Cada 24 h, tres frascos replicativa se tripsinizaron y se contaron las células con un hemocitómetro. Se estableció una curva de crecimiento, y el crecimiento tiempo de duplicación celular se estimó a partir de su fase de crecimiento exponencial.
tumorigenicidad ensayo
Teniendo en cuenta los pros y apreciados de modelos murinos xenoinjertos, una suspensión de 10
6 IPC-366 células se inoculó por vía subcutánea en la región ventral de diez 8 semanas de edad ratones hembra Balb /SCID. Los ratones se inspeccionaron semanalmente para el desarrollo de tumores. Cuando se detectaron tumores, que se controlaron semanalmente por palpación y medidos por pinzas. Los ratones se sacrificaron después de 30 días de la inoculación, y se recogieron los tumores y órganos en la autopsia y se colocan en 4% de paraformaldehído (pH = 7,4) para examen histológico.
citología, histopatología e inmunohistoquímica
celular frotis se prepararon y tiñeron utilizando diff-Quick para la evaluación cytomorphological. IPC-366 inmunofenotipo se realizó en gránulos de tumor original y tumorales caninas utilizando los siguientes marcadores (Tabla 1): pancytokeratin (AE1 /AE3), citoqueratina 14 (CK14), p63, vimentina (vim), α-actina de músculo liso (SMA) , receptores de estrógeno y progesterona (ER y PR), epidérmico humano receptor-2 (HER-2), la ciclooxigenasa-2 (COX-2), e-cadherina (e-Cad), y Ki-67 (marcador de proliferación). secciones de parafina fueron colocados en un módulo de PT (Lab Vision) que contiene una solución tampón de EDTA (pH 8,0) (Master Diagnostica, MAD-004072R /D), se calentó durante 20 minutos a 95 ° C y se enfrió a 60 ° C. Después de este protocolo de recuperación de antígeno alta temperatura, láminas fueron lavadas en agua tibia y se colocan en un dispositivo automatizado immunostainer (Lab Vision Corporation, Fremont, CA) para inmunohistoquímica utilizando un sistema de detección de peroxidasa (Tabla 1). Después de inmunotinción las diapositivas se counterstained con hematoxilina y montado permanentemente con Depex. Correspondientes portaobjetos de control negativo se procesaron mediante la sustitución del anticuerpo primario con un anticuerpo no reactivo. Diapositivas de tumores mamarios humanos y caninos con reactividad previamente demostrado que los controles internos primarios de anticuerpos y tejidos se utilizaron como controles positivos.
El tumor primario de mama canino, la línea celular y tumores xwnotransplantado se consideraron positivos para AE1 /AE3, CK-14, p63, vimentina, actina, e-Cad y COX-2, cuando más de 10% de las células neoplásicas fueron positivas [21]. Junto a esto, los marcadores fenotípicos IPC-366 se anotó en las secciones de pellets mediante un analizador de imágenes asistido por ordenador (imagen J), contando hasta 1000 células. Para la evaluación de HER-2, 3+ dar un resultado positivo siguiendo las pautas recomendadas de la ASCO (Sociedad Americana del Cáncer Oncología, Her-2 3+) se consideró. Ki-67 índice de proliferación (PI) se determinó contando Ki-67 núcleos positivos y negativos en 1000 células neoplásicas. Cada núcleo inmunotinción se consideró positiva independientemente de la intensidad. El, se calculó PI, o proporción de células neoplásicas positivos en cada muestra [22].
microscopía electrónica
se recogieron y se fijaron con 2,5% de glutaraldehído (Panreac, Barcelona IPC-366 células, España) y solución de 4% de paraformaldehído (Panreac). A continuación, las células se incubaron con tampón de cacodilato 0,1 M a 4 ° C durante la noche. Las células fijadas fueron tratados con 2% de tetróxido de osmio (Panreac) y solución de 3% ferrocianuro (Panreac) (diluido en PBS) durante 1 h. Posteriormente fueron lavadas en agua destilada y se deshidrataron en acetonas de creciente porcentaje (30, 50, 70, 80, y 100%). Las muestras se infiltraron gradualmente en una resina de mezcla Müllenhauer (resina Lowicryl, Sigma Aldrich), y se solidifica en 60 8 ° C durante 24 h. Las células embebidas se seccionaron a la Microscopía Electrónica de Centro Nacional (Madrid). Las imágenes se obtuvieron usando un microscopio electrónico de transmisión JEOL JEM 3000 F.
citogenético
análisis
Preparación de los cromosomas para Aberración cromosómica (AC) y bandeo G, se obtuvieron a partir de cultivos celulares a corto plazo con el de Eagle modificado por Dulbecco , DMEM-F12 (Lonza, EE.UU.) que contiene 10% de suero bovino fetal (FBS) (Atlanta Biológicos, EE.UU.), solución de penicilina-estreptomicina al 1% y 1% de L-glutamina (Life Technology Gibco-, EE.UU.). La suspensión celular se colocó en 75 cm
2 frascos de cultivo (Corning, USA) y se mantuvo en una atmósfera humidificada de dióxido de carbono al 5% a 37 ° C durante 54h. Se añadió colcemid (Gibco- vida Thecnology, EE.UU.) durante 2 h antes de que se aprovechó la suspensión celular. La preparación siguió métodos para el tratamiento hipotónico (KCL) (Sigma Aldrich, EE.UU.) y la fijación con 3: 1 de metanol: ácido acético glacial (Sigma Aldrich, EE.UU.). Los portaobjetos se dejó envejecer antes de la tinción con Giemsa y G bandas [23]. Los resultados fueron procesados con Aplicada de imágenes espectrales, Versión 6.0 para la revisión de las metafases y cariotipo.
Resultados
morfología microscópica del IPC-366 y el crecimiento ensayo
IPC- 366 células adheridas a Flaks Cultura presentó morfología y características epitelio similar (Fig. 2A). La observación histológica de las células IPC-366 en frotis y H & amp; E manchadas secciones de parafina a partir de sedimentos reveló células redondas grandes o muy grandes (diámetro = 18.01μm, 583.33μm mínimo = 7.35μm-media máxima). Citoplasmas fueron ligeramente basófilo y con frecuencia contenían agregados basófilos. Los núcleos eran muy grandes (mínimo = 5,25 micras de máxima = 13,38 m), con nucleolos grandes y numerosos evidentes (mínimo = 3,74 micras de máxima = 8,24 m, y). Anisocitosis y anisocariosis fueron marcados. Con frecuencia, el IPC-366 células mostraron múltiples vacuolas citoplásmicas claras coalescentes y alargadas núcleo excéntrico. Algunas células grandes presentan características morfológicas de las células endoteliales: un borde de citoplasma rodeado alargado que contiene alargada núcleos excéntricos (células similares a las endoteliales, ELC, sugerentes de mimetismo vasculogénica) (Figs 2B, 3A y 3B.). Fácilmente se observaron células multinucleadas malignos más frecuentes (8,72% de ce4lls multinucleadas en un campo microscópico 20x).
A) células IPC-366 en cultivo a la microscopía invertida (40X). B) pellet IPC-366; una sección de parafina, H & amp; E (40X). células de tumor altamente maligno con morfología epitelial; marcada anisocitosis y anisocariosis y nucleolos evidentes. células de tipo endotelial (ELC) que muestra el espacio claro citoplasmática (flecha). IPC-366 características ultraestructurales se evaluaron por microscopía electrónica. Las células tenían proyecciones citoplasmáticas abundantes, numerosos orgánulos y productos de secreción proteináceos. Por microscopía electrónica, las vacuolas citoplásmicas claras visto por microscopía óptica, dieron como resultado espacios vacíos recubiertos por membranas citoplasmáticas que en ocasiones se unieron para formar un lumen interno (ELC, mimetismo origen vascular). (Fig. 3C-H) guía empresas
A y B) semithin secciones teñidas con azul de toluidina (40X).; algunas células de tipo endotelial se observan (flechas). C a H) ULTRAESTRUCTURA en cortes ultrafinos. C) Las células con núcleos grandes y nucleolos evidentes. Mitosis (flecha). D) Una sola célula con núcleo alargado, nucléolo muy evidentes y numerosos orgánulos, vacuolas y la secreción proteica. E) Tumor degeneró célula con núcleo encogido y la secreción proteica abundante. F) El citoplasma de una célula tumoral que contiene numerosos organelos (mitocondrias, el retículo endoplasmático) y una vacuola secretora. G) de las células tumorales con tres espacios vacíos citoplasmáticos (asteriscos) cubiertas por una membrana citoplasmática; progresión a un citoplasmática característica "lumen" de las células similares a las endoteliales. nucléolo evidente. H) de células binucleadas tumor con un espacio vacío central de citoplasmática ( "lumen", asterisco) (ELC) se asemeja a un vaso capilar (mímica origen vascular). Figs. E y G muestran diferentes campos de la misma red. En 25
º paso, las células fueron almacenamiento criogénico (-180 ° C). Re-cultivaron células descongeladas presentan un crecimiento similar y características morfológicas con una viabilidad del 95-99%. El tiempo de duplicación de las células IPC-366 a 30
º paso era aproximadamente 24 horas y las células alcanzó una meseta en el día 6 (Fig. 4).
tumorigenicidad
inyectado células IPC-366 en el lado ventral de ratones hembra Balb /SCID de originar tumores después de 2 semanas de la inoculación (100% de los ratones inoculados, n = 10, longitud: 0,6 y 0,9 cm
3, ancho: 0,2 y 0,4 cm
3). Dos semanas después de la observación de la xwnotransplantado Tumores su tamaño era de hasta 1,5 cm
3 y se sacrificaron los ratones (Extensión: entre 1,3 y 1,7 cm
3, y el ancho: entre 0,8 y 1,2) (Fig. 5A) . El examen histológico reveló una muy infiltrantes, mal delimitado, no encapsulado crecimiento neoplásico densamente celular, que se extiende hasta la dermis y músculo estriado. Las células neoplásicas dispuestas en masas sólidas con escaso estroma y tenía la morfología y la malignidad similar a la descrita para IPC-· 66. índice mitótico fue muy alto y no se observaron con frecuencia mitosis atípicas. (Fig. 5B-C). La presencia de embolias en la dermis capilares (Fig. 5D) confirmó la característica histológica de carcinoma de mama inflamatorio. La presencia de mimetismo origen vascular (células de tumor altamente maligno se asemeja a las células endoteliales y los alrededores espacios vasculares (mímica origen vascular) (Fig. 5E), fue un hallazgo frecuente.
A) IPC-366 xenoinjertos de ratón en las cuatro semanas (flecha ). B a E: secciones de parafina del tumor H & amp; E. B) la infiltración del tumor sólido de la dermis (10x). C) embolia neoplásica en un recipiente dérmica superficial linfático (flecha) y tumor sólido; edema marcado en dermis (4X). D) células de tumor altamente maligno con marcada anisocitosis y anisocariosis; nucleolos evidentes (40X) .e) canales microvasculares se alinearon por las células neoplásicas (mímica de origen vascular, flechas) (20x).
Caracterización inmunohistoquímica de IPC-366 fenotipo
inflamatorias canina Primaria células de carcinoma mamario y IPC-366 presentan inmunorreacción similar a los marcadores utilizados inmunofenotipo. Ellos fueron positivos para un marcador general de células epiteliales (pancytokeratin, AE1 /AE3), y un marcador de células basales (CK14), con un 95,11% y 92,58% de células positivas en el sedimento, respectivamente (Fig. 6A-B). Todas las muestras tenían también una reacción positiva a la vimentina, que muestra el IPC-366 un 81,14% de células positivas en los pellets. (Fig. 6C). Mioepitelial marcadores de células p63 y actina fueron negativos (Fig. 6D-E), así como los receptores hormonales (ER, PR), y HER-2. (Fig. 6F-H). Más de 90% de IPC-366 sobreexpresa E-Cad (Fig. 6I) y la COX-2 (Fig. 6J-K). COX-2 immunolabelling fue muy fuerte en 10% de las células. Todas las muestras tenían una alta tasa de proliferación medido con Ki-67. La media de Ki-67 índice de proliferación del IPC-366 en gránulos era 87.15% (figura 6 l.)
A) pancytokeratin (AE1 /AE3) (10X).; intensa immunolabeling y numerosas células positivas. B) CK14; intensa inmunomarcación y numerosas células positivas (10X). C) La vimentina; immunolabeling moderado y numerosas células positivas (10X). D) p63; negativo (20X). E) α-actina de músculo liso, células negativas (10x). receptor F) El estrógeno; células negativas (20x). receptor G) Progesterona; células negativas (20x). H) HER-2; células negativas (20x). I) E-cadherina; intensa inmunomarcación membranosa en numerosas células (20X). J) COX-2; la mayoría de las células son moderadamente positiva; algunas células son intensamente positivo (10X). K) COX-2; algunas células fuertemente positivas muestra las características de malignidad (teléfonos binucleada, flecha) (40X). L) marcador de proliferación Ki-67; muchos núcleos son positivos (10X).
Análisis citogenéticos
El análisis se realizó después de dos ciclos celulares, las células se dividen para ensayo de aberraciones cromosómicas (AC) y cariotipo. Se examinaron cuatro cientos de células y 69% de las células mostraron el cariotipo normal (2n = 78). Por otro lado, metafases examinadas detectan al menos una o más anormalidades en 31% de las células (Tabla 2). Los cromosomas autosomas tienen morfología similar, el número y todos ellos son acrocéntricos, y la metacéntrica cromosoma X. 2% de las células observadas tienen aberración numérica afectan a los cromosomas X, 12 y 17 utilizando el ideograma para el análisis de bandas G en el perro [24, 25]. La prueba de CA revela que el 30% de la celda se ve tiene pausas:. 15% cromática, 8% de aberración cromosómica y 6% brechas
Discusión
IMC y el IBC son un subtipo de cáncer de mama agresivo que afecta a los perros y los seres humanos femeninos, respectivamente [1, 2, 26].
in vitro
estudios que utilizan líneas celulares de cáncer establecidos ofrecen los conocimientos acerca de la progresión y el crecimiento del cáncer de mama en general y, en particular, IBC [11, 12]. Hay pocos modelos disponibles para el estudio de la biología de IBC [10, 12, 15]. La mayoría de los estudios se han llevado a cabo utilizando líneas celulares tales como SUM190 y SUM149. SUM149 es una línea celular triple negativo mientras que SUM190 es ER /PR negativo y HER-2 positivo. Otras líneas celulares IBC menos estudiados son: MDA-IBC3, KPL4 y WIBC-9 (todo el ER /PR negativo y HER-2 positivo). En el último año, se ha descrito y caracterizado la nueva línea celular FC-IBC02 [15]. Canine comparte IMC muchas características clínicas, biológicas y patológicas con la enfermedad en los seres humanos, por lo tanto, se ha propuesto como un buen modelo animal para el estudio espontánea la enfermedad humana [2]. Sin embargo, a lo mejor de nuestro conocimiento, IPC-366 es la primera línea celular establecida IMC canina.
IPC-366 línea celular reproduce las características histológicas del tumor primario canina. Es una línea celular muy agresiva, altamente maligno que inoculó a ratones Balb /SCID puede originar tumores que reproducen las características histológicas de la primaria IMC canino: un tumor muy infiltrante compuesta por células anaplásicos con invasión linfática de los vasos linfáticos dérmicos superficiales, siendo esta característica del sello histológico este último para los dos IBC y los diagnósticos histológicos IMC [2, 5, 26]. IPC-366 también se conserva el original inmunofenotipo IMC mamaria canina. De acuerdo con los resultados de inmunohistoquímica, IPC-366 es positivo para panCK, CK14 y vimentina, y negativas para la actina, p63, ER, PR, HER-2, lo que indica que esta línea celular es una línea de células epiteliales basales.
El tratamiento multimodal para pacientes con IBC incluye quimioterapia, seguida de radioterapia y cirugía agresiva. Al igual que en otros tipos de cáncer de mama no IBC, anti-HER-2 terapia dirigida o anti-hormonal se utiliza en pacientes positivos a estas moléculas [4]. A pesar de ello, la supervivencia de los pacientes con IBC es muy corto [4]. La supervivencia es aún más corto en casos de IBC triple negativo (TN IBC, tumores negativos para ER, PR y HER-2) que son especialmente resistentes a las terapias [27].
cáncer de mama triple negativo (forma de cáncer) representa aproximadamente el 10-15% de los cánceres de mama y tiene un peor pronóstico que los pacientes con receptores hormonales positivos [28-30]. Este tipo de cáncer de mama también una característica resultado de la agresividad, capacidad de invasión, metástasis temprana y no responde a los objetivos terapéuticos [28], y en su mayoría se trata con quimioterapia [30].
En la investigación in vitro en TN-IBC se lleva a cabo principalmente en la línea celular triple negativo SUM149. Esta línea celular se ha usado para identificar los factores genéticos del fenotipo IBC [10]. resultados inmunohistoquímicos revelaron que el IPC-366 carecía de ER, PR y HER-2 expresión, siendo otra línea celular triple negativo novela que se puede utilizar para la investigación de nuevas dianas terapéuticas.
La línea celular IPC-366 se presenta como una línea basal del epitelio de células con características mesenquimales: inmunoexpresiones positiva a pancitoqueratinas (AE1 /AE3) (marcador de células epiteliales general), citoqueratina 14 (para las células epiteliales basales) y vimentina (marcador mesenquimal general). La co-expresión de citoqueratinas y vimentina se ha descrito en los tumores de mama asociados a la malignidad [31, 32]. La expresión de vimentina también se asocia con un aumento de la malignidad de las células en cultivo [31]. Por lo tanto, el perfil inmunoexpresiones reveló que el IPC-366 comprendido en una línea celular subtipo basal-al igual que con la transición epitelio-mesenquimal (EMT) [33]. El basal-como subtipo se caracteriza por una expresión negativa de ER, PR y HER2 completado con un CK14 y vimentina positiva [28]. SUM149, una línea celular IBC bien establecida, es también del subtipo basal como [12]. El hecho de que las características caninas acciones de líneas celulares fenotípicos IPC-366 con la línea celular humana SUM149 permitirán estudios pre-clínicos comparativos en un futuro. immunoexpresion negativa a los marcadores de células mioepiteliales p63 y actina indica que IPC-366 no es de origen mioepiteliales. En contraste con el cáncer de mama humano, cáncer mamario canino tiene proliferaciones mioepiteliales que se dirigen a los tumores complejos y mixtos [20]. La ausencia de un linaje de células mioepiteliales en IPC-366 facilitará aún más estudios comparativos adecuados. Estos resultados demostraron el origen epitelial del IPC-366 y la adquisición de características mesenquimales, así como la ausencia de células mioepiteliales en esta línea celular. De este modo, el IPC-366 células son un ejemplo de la transición epitelio-mesenquimal. EMT es un proceso implicado en las células epiteliales de la progresión del tumor principales que se convierten en células mesenquimales [34, 35]. La adquisición del fenotipo mesenquimal implicado la pérdida en la expresión de marcadores epiteliales, así como la motilidad celular y la ganancia de la invasión tumoral aumentó [36]. IPC-366 sobreexpresa COX-2 en el 90% de las células. Recientemente, la sobreexpresión de la COX-2 se ha relacionado con la EMT y la invasión en líneas celulares de cáncer de mama [37].
sobreexpresión de E-cadherina en IPC-366 ha sido también demostrada. E-cadherina es una proteína de adhesión célula-célula en tejidos epiteliales codificadas por el gen supresor de tumor CDH1. Se sabe que las mutaciones en CDH1 aumento de la proliferación y la invasión tumoral y la metástasis [38-40]. Por lo tanto, la pérdida de la función de la cadherina E juega un papel muy importante en la EMT y la supervivencia del tumor [40, 41]. Se sabe que en IBC E-cadherina se sobreexpresa y localizado alrededor de la membrana de las células tumorales, que representa la formación de embolia linfovascular [42, 43].
IPC-366 también se caracteriza por una alta proliferación medido por un ensayo de crecimiento y un índice de Ki-67 (87,15%), lo que asegura en estudios in vitro. expresión Ki-67 se ha asociado con un mal pronóstico en tumores de mama malignos, tanto en las mujeres y los perros [22, 44]. IPC-366 tenía mayor índice de proliferación que el tumor original, lo que sugiere un aumento de la capacidad proliferativa, probablemente por la selección de las células más malignas. El análisis citogenético muestra la presencia de aberración estructural, reordenamientos numéricos y neutros, lo que demuestra una inestabilidad cromosómica. Estos datos pueden correlacionarse con los resultados en pacientes con cáncer de mama inflamatorio y el uso de métodos más sensibles y específicos, como el cielo, el análisis de transferencia CGH Sur y los estudios de patrón de expresión de cDNA microarray chips aumentaría el conocimiento con respecto a la aberración genética y segmentos conservados ¿Quién puede abrir la ventana para marcadores genéticos encontrados. Las características histológicas de malignidad en el tumor mamario canino temporal y la línea celular fueron similares con marcada anisocariosis y anisocitosis. La morfología típica de las células similares a las endoteliales, que se ha relacionado con el mimetismo vasculogénica (VM) fenómeno [7, 8] se observó de manera similar en el tumor primario y la línea celular derivada. La presencia de ELC debe ser considerada como un primer resultado interesante que merece investigación adicional específico. En los tumores de ratones derivadas, además de la observación de ELC, fue posible encontrar grandes canales de VM. La mayor proporción de células multinucleadas altamente malignos que se encuentran en el IPC-366 y en el tumor trasplantado en ratones podrían representar también las primeras etapas de VM en ELC altamente diferenciadas, aunque se necesitan más estudios para confirmar esta afirmación. Este fenómeno definido como mimetismo vasculogénica fue descrito primero en el melanoma humano y [45] consiste en la generación de canales vasculares por las células tumorales malignas que adquieren características endoteliales y proporciona suministro de sangre de requerido para el crecimiento tumoral y la metástasis. La generación de canales vasculares funcionales por el tumor es un marcador de malignidad fenotipo de las células tumorales [45, 46]. mimetismo origen vascular no aparece en todos los tipos de cáncer, pero con frecuencia se presenta en IBC [47] y el IMC [7]. Recientemente, también se identificó en xenoinjertos de IMC [48].
El noventa por ciento de las células IPC-366 fueron positivos para COX-2. Algunas células, incluyendo ELC, eran intensamente positivo para COX-2. COX-2 tiene un papel en el fenotipo invasivo y angiogénico de IBC [49] y se ha relacionado con la estimulación vía lymphangiogenic en IMC [8]. La relación de la COX-2 con la extravasación de tumor, la supervivencia de células tumorales y metástasis a distancia re-iniciación se ha descrito [50]. COX-2 se ha indicado que es un marcador para ELCs implicados en VM [7, 8, 51]. Aunque son necesarios para caracterizar las características angiogénicas de IPC-366 más estudios, esta línea celular podría representar un modelo muy interesante para el estudio de la VM y otras propiedades angiogénicas de IMC.
El papel de la COX-2 como una marcador de células madre ha postulado recientemente [52]. Las propiedades de células madre de IPC-366, bajo investigación, no son el objetivo del presente estudio, pero la alta proporción de COX-2 de células positivas y la presencia de numerosos ELCs parecen indicar que la tasa de células madre podría ser alta. Completar los estudios futuros sobre el fenotipo de células madre va a dilucidar este aspecto de la línea de células IPC-366.
tumorigenicidad rápida es otra característica muy importante del IPC-366. Esta línea celular es capaz de reproducir los tumores
in vivo
muy rápidamente, sin perder sus características originales, que permiten estudiar el crecimiento neoplásico en un entorno de los animales biológica. A pesar de que es una característica muy apreciada, no todas las líneas celulares establecidas son capaces de reproducir los tumores
in vivo
. MCF7 no crece en ratones, aunque otras líneas celulares tumorigénicas IBC como SUM149 o SUM190 producen tumores en xenoinjertos de ratones SCID después de 6-8 semanas de la inyección de células en almohadilla de grasa mamaria [53]. Xenoinjertos de IPC-366 en ratones Balb /SCID crecieron en 3 semanas con una frecuencia de 100%, lo que demuestra que esta línea celular tuvo un crecimiento más rápido
in vivo
. IBC e IMC tienen una fuerte tendencia a la metástasis e invadir los vasos linfáticos [1, 5, 42]. IPC-366 xenoinjertos en ratones mostraron metástasis espontáneas en el pulmón y los ganglios linfáticos con una frecuencia de 100% (todos los animales inyectados sufren metástasis). Por lo tanto, el IPC-366 podría ser considerado como un buen modelo para el estudio de los mecanismos metastásicos
in vitro
y
in vivo
. No hay líneas celulares de cáncer de mama o IBC con esta gran capacidad de metástasis en los correspondientes ratones xwnotransplantado; como ejemplo, SUM149 producir metástasis en los pulmones con una frecuencia de 2/3 [53]
En los últimos años, se han establecido varias líneas de células cancerosas mamarias caninas:. DTK-E y DTK-SME [17