Extracto
La contaminación de las células normales está casi siempre presente en las muestras tumorales y afecta a sus análisis moleculares. La metilación del ADN, una modificación epigenética estable, es dependiente del tipo de célula, y diferente entre el cáncer y las células normales. Aquí, el objetivo fue demostrar que la metilación del ADN se puede utilizar para estimar la fracción de células cancerosas en una muestra de ADN del tumor, el uso de carcinoma esofágico de células escamosas (CECA) como un ejemplo. En primer lugar, por una serie Infinium HumanMethylation450 BeadChip, aislamos tres regiones genómicas (
TFAP2B
,
ARHGEF4
, y
RAPGEFL1
) i) altamente metilados en cuatro líneas celulares CECA, ii) casi no metilado en una muestra conjunta de las mucosas no canceroso, un grupo de muestras de la mucosa esofágica normal y los linfocitos circulantes, y iii) frecuentemente metilado en 28 ESCCs (
TFAP2B
, 24/28;
ARHGEF4
, 20/28; y
RAPGEFL1
, 19/28). En segundo lugar, el uso de ocho pares de muestras de células cancerosas y no cancerosas preparados por captura láser microdissection, se confirmó que al menos una de las tres regiones fue metilado casi completamente en las células CECA, y todas las tres regiones eran casi completamente no metilado en la no-cáncer Células. También confirmó que las alteraciones del número de copias de ADN de las tres regiones en 15 muestras CECA eran raros, y no afectó la estimación de la fracción de células cancerosas. Entonces, la fracción de células cancerosas en una muestra de ADN del tumor se define como el nivel de metilación más alta de las tres regiones, y que confirmó una alta correlación entre la fracción evaluado por el marcador fracción metilación del ADN y la fracción evaluado por un patólogo (r = 0,85; p & lt; 0,001). Finalmente, se observó que, mediante la corrección del contenido de células de cáncer, las islas CpG en las regiones promotoras de los genes supresores de tumores estaban casi completamente metilados. Estos resultados demuestran que la metilación del ADN se puede utilizar para estimar la fracción de células cancerosas en una muestra de ADN del tumor.
Visto: Takahashi T, Matsuda Y, Yamashita S, Hattori N, R Kushima, Lee Y-C, et al. (2013) La estimación de la fracción de células cancerosas en una muestra de ADN tumoral usando la metilación del ADN. PLoS ONE 8 (12): e82302. doi: 10.1371 /journal.pone.0082302
Editor: Qian Tao, la Universidad China de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 6 Junio, 2013; Aceptado: 22 Octubre 2013; Publicado: Diciembre 2, 2013
Derechos de Autor © 2013 Takahashi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por la Tercera plazo Estrategia de control Integral del cáncer del Ministerio de Salud, Trabajo y Bienestar, Japón (http://www.mhlw.go.jp), y por el Proyecto para el Desarrollo de la investigación innovadora sobre la terapéutica del cáncer (P- DIRECTO) del Ministerio de Educación, Cultura Deportes, Ciencia y Tecnología, Japón (http://p-direct.mext.go.jp). T. T. y Y.M. son los destinatarios de un residente de Becas de Investigación de la Fundación para la Promoción de la Investigación del Cáncer (http://www.fpcr.or.jp). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
La contaminación de las células normales, como las células epiteliales normales, fibroblastos y leucocitos periféricos, está casi siempre presente en las muestras tumorales. Tal contaminación influye en los resultados de los análisis del genoma del cáncer [1-4], y el análisis de expresión de ARN [5,6]. Si la fracción de células cancerosas en una muestra de ADN del tumor puede evaluarse fácilmente, podemos llevar a cabo análisis más preciso mediante la exclusión de las muestras con contenido extremadamente bajo de células tumorales, y por la normalización de los datos en bruto sobre la base de la fracción de células cancerosas. Tradicionalmente, una fracción de células cancerosas en una muestra de tumor se ha evaluado mediante el análisis patológico utilizando secciones vecinas. Sin embargo, la preparación de tales secciones es a veces difícil o imposible debido a la disponibilidad de la muestra, y, sobre todo, los patólogos expertos son necesarios para este tipo de análisis.
Para superar estos problemas, las tecnologías para estimar una fracción de las células cancerosas se han desarrollado recientemente utilizando microarrays polimorfismo de nucleótido único (SNP) y la secuenciación de próxima generación (NGS) [7-10]. Con SNP microarray, la fracción de células de cáncer se puede calcular mediante la detección de regiones genómicas con alteraciones de número de copias y medir el grado de desequilibrio alélica utilizando SNPs en las regiones genómicas [7-9]. Con NGS, las mutaciones específicas de tumor pueden ser identificados, y la fracción de las células cancerosas se pueden calcular en base a la frecuencia del alelo mutante [10]. Desde estas tecnologías se desarrollaron originalmente para el análisis de SNPs o mutaciones, sufren de complicadas fórmulas de cálculo, reactivos costosos, y la necesidad de analizar muestras normales apareadas.
metilación del ADN es una modificación epigenética estable, y en algunas regiones genómicas están metilados en un tipo celular dependiente de manera [11-13]. Entre el cáncer y las células normales, se presentan muchas regiones genómicas para ser metilado diferencialmente en muchos tipos de cáncer, y algunos de ellos son causalmente implicados en el desarrollo y progresión del cáncer [14-18]. Entre tales regiones genómicas diferencialmente metiladas, algunas regiones genómicas específicas pueden ser completamente metilado en las células cancerosas, pero aún completamente no metilado en las células normales, como las células epiteliales normales, fibroblastos y leucocitos periféricos. Si es así, los niveles de metilación del ADN de las regiones genómicas específicas pueden reflejar la fracción de células cancerosas en una muestra (Figura 1A), y dicha estimación de la fracción de células de cáncer utilizando la metilación del ADN puede llegar a ser un método útil para estudios de cáncer.
(A) El concepto de la estimación de la fracción de células cancerosas en una muestra de ADN del tumor mediante la metilación del ADN. (B) Selección de regiones genómicas específicas, que eran completamente metilado en células CECA y completamente no metilado en diversas células normales, por el análisis de metilación de todo el genoma utilizando una matriz Infinium HumanMethylation450 BeadChip. Catorce sitios CpG se seleccionaron finalmente, y los que se derivaron de 11 regiones genómicas. (C) Tres regiones genómicas (TFAP2B,
ARHGEF4
, y
RAPGEFL1
) seleccionados como componentes de un marcador fracción. Gene estructura y la ubicación de una isla CpG se muestran en la parte superior, y se muestran los valores de beta de los sitios CpG analizadas por la serie de bolas Infinium. El sitio CpG identificada por la serie de bolas Infinium se encajona por un rectángulo con una línea de puntos. Un mapa CpG alrededor del sitio (s) identificado CpG se muestra en la parte inferior. Las líneas verticales (sólidos y rotos) muestran los sitios CpG y las líneas discontinuas muestran los sitios CpG cuyos valores β se midieron por la serie de bolas. flechas cerradas muestran cebadores para MS-HRMA.
En este estudio, el objetivo fue demostrar que la metilación del ADN podría ser utilizado como un marcador de fracción para la estimación de una fracción de células cancerosas en una muestra de ADN del tumor, el uso de carcinoma de células escamosas de esófago (CECA) muestras como un ejemplo. Con este fin, se realizó un análisis de metilación de todo el genoma para buscar regiones específicas del genoma completamente metilados en células CECA y completamente no metilados en diversas células normales.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
Este estudio se llevó a cabo con la aprobación de la Junta de Revisión Institucional del Hospital Nacional del Centro del Cáncer, el Hospital Universitario de la ciudad de Osaka, y la hospital de la Universidad nacional de Taiwán. consentimientos informados escritos se obtuvieron de todos los individuos.
Las muestras y líneas celulares CECA
Un total de 160 muestras CECA se recogieron en el Hospital Nacional del Centro del Cáncer, el Hospital Universitario de la ciudad de Osaka, y el Hospital de la Universidad Nacional de Taiwán. Las 160 muestras CECA consistían en 39 muestras de biopsia y 121 especímenes quirúrgicos. Las muestras de biopsia se derivaron de 39 pacientes que se sometieron a biopsia endoscópica y fueron diagnosticados de tener una ESCC (33 hombres y 6 mujeres; media de edad = 63, rango = 30 a 78). Las muestras se almacenaron en RNAlater (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.) a -80 ° C. Las muestras quirúrgicas se derivaron de 121 pacientes que fueron diagnosticados de tener un CECE invasiva histológicamente y habían sido sometidos a esofagectomía (98 hombres y 23 mujeres, con una edad media = 65, rango = 41-82). Entre los 121 especímenes quirúrgicos, 25 muestras se obtuvieron a partir de muestras incluidas en el bloque de cera de parafina después de la fijación con formalina o 70% de etanol, y las otras 96 muestras se obtuvieron de muestras almacenadas en RNAlater (Applied Biosystems) después de la resección. Además, se realizó la captura de microdisección por láser (LCM) durante ocho especímenes quirúrgicos integrados en el bloque de cera de parafina utilizando LM200 (Arcturus, Mount View, CA, EE.UU.) como se describe [19].
Cuatro líneas celulares CECA KYSE30, KYSE50, KYSE220, y KYSE270 [20] fueron adquiridos de Ciencias de la Salud de Investigación de Recursos del Banco (Osaka, Japón). ADN genómico fue extraído mediante el método de fenol /cloroformo.
Genoma en todo el análisis de metilación del ADN
Todo el genoma de selección de sitios CpG metilados diferencialmente se realizó utilizando una matriz Infinium HumanMethylation450 BeadChip, que cubre 482,421 sitios CpG (Illumina, San Diego, CA, USA ) como se describe anteriormente [21]. Se excluyeron los 11.551 sitios CpG en los cromosomas sexuales, y los sitios CpG 470,870 restantes se utilizaron para el análisis. El nivel de metilación de cada sitio CpG estaba representada por un valor β, que osciló entre 0 (completamente no metilado) a 1 (completamente metilado).
sensibles a la metilación de alta resolución de fusión Análisis (MS-HRMA)
Para MS-HRMA, en primer lugar, 1 mg de ADN digerido con
Bam HI
fue tratado con bisulfito de sodio y se suspendieron en 40 l de tampón de TE como se describe [22]. En segundo lugar, la PCR se llevó a cabo utilizando alícuota de 1 l de la ADN tratado con bisulfito de sodio, cebadores capaces de amplificar tanto el ADN metilado y no metilado (Tabla S1) [23], SYBR Green I (Aplicaciones BioWhittaker Molecular, Rockland, MD, EE.UU.), y un termociclador iCycler (Bio-Rad Laboratories, CA, USA). En tercer lugar, HRMA del producto de PCR se llevó a cabo para obtener el perfil de fusión del producto de PCR mediante el trazado de la derivada negativa de la fluorescencia sobre la temperatura (-df /d
T
vs.
T
), usando el software iCycler Thermal Cycler (Bio-Rad Laboratories, Ver. 2,1). Por último, el nivel de metilación de una muestra se evaluó por comparación de su perfil de fusión con las de los controles totalmente metilados y no metilados, junto con mezclas de 0, 20, 40, 60, 80, y 100% de los controles metilados. Como control totalmente metilado, ADN genómico en tratamiento con
se utilizó Sss
I metilasa (New England Biolabs, Beverly, MA, EE.UU.). Como control completamente no metilado, se utilizó ADN de bisulfito de sodio modificados obtenidos a partir de las mucosas del esófago no canceroso sin metilación de las regiones analizadas.
Análisis Número de copias de ADN genómico
Copia alteraciones en el número de las regiones genómicas fueron analizados por cuantitativa en tiempo real PCR utilizando un termociclador iCycler (Bio-Rad Laboratories) con SYBR Green I (Bio Whittaker Molecular aplicaciones). Se midió el número de moléculas de ADN en una muestra para tres regiones que flanquean los genes candidatos y control de los genes [
ALB gratis (4q13.3),
GAPDH gratis (12p13) y
(12p13.32)] que se encuentra en regiones cromosómicas con alteraciones del número de copias infrecuentes. Las secuencias de los cebadores se muestran en la Tabla S2. El número de moléculas de ADN de los tres genes candidatos se normalizó a las de los genes de control. El número normalizado de moléculas de ADN en una muestra se comparó con la del ADN de leucocitos humanos para obtener copia alteraciones numéricas. Todos los análisis se llevó a cabo por triplicado. copia significativas alteraciones en el número (subir o bajar) se definieron como más que un aumento de 1,5 veces o menos de una disminución de 0,67 veces.
análisis patológico de la fracción de células de cáncer de
A partir de especímenes quirúrgicos incluidos en parafina, se prepararon secciones rebanada de serie con un espesor de 3 micras. Una de las secciones se tiñó con hematoxilina-eosina y las secciones restantes se utilizaron para la extracción de ADN. Un patólogo experimentado (R. K.) estima la fracción de células de cáncer por examen microscópico.
Análisis estadísticos
La correlación entre la fracción de células de cáncer estimados por el marcador de fracción y la evaluada por el patólogo se analizó mediante el coeficiente de correlación momento-producto de Pearson. A diferencia de las fracciones medias de las células cancerosas se analizó mediante la prueba t de Student, y la diferencia en las varianzas de la fracción de células de cáncer se analizó mediante el test de Levene. Todos los análisis se realizaron con SPSS versión 18.0 (SPSS Inc. Japón, Tokyo, Japón), y los resultados se consideraron significativas cuando los valores de P & lt; 0,05 se obtienen mediante un ensayo de dos caras.
Resultados
Selección de regiones específicas mediante el cribado de todo el genoma
Genoma en todo el análisis de metilación del ADN se realizó a través de i) 28 ESCCs obtenidas por biopsia endoscópica, ii) cuatro líneas celulares CECA (KYSE30, KYSE50, KYSE220, y KYSE270), iii) los leucocitos periféricos de un voluntario sano, iv) un grupo de la mucosa esofágica normal de cuatro voluntarios sanos, y v) un grupo de la mucosa esofágica no canceroso de ocho CECA pacientes. Se realizaron búsquedas de sitios CpG que estaban altamente metilados (valor de β & gt; 0,8) en todas las cuatro líneas celulares CECA y casi no metilados (valor β & lt; 0,1) en los linfocitos circulantes, la piscina de la mucosa normal, y el grupo de no canceroso mucosas, y aisladas 2.752 sitios CpG de 470,870 sitios CpG informativos. De los 2.752 sitios CpG, se seleccionaron 14 sitios CpG en el que la incidencia de la hipermetilación (valor β & gt; 0,5) en los 28 ESCCs era más del 50% (Figura 1B).
Los 14 sitios CpG se derivaron de 11 regiones genómicas, que nos definen como regiones dentro de 500 pb por conveniencia (Tabla 1). A partir de las 11 regiones genómicas, se excluyeron
SOX2OT
, que fue reportado a ser altamente amplificado en células CECA [24], y tres regiones sin genes conocidos. Para las siete regiones restantes, hemos intentado diseñar cebadores para MS-HRMA, que se conoce como un método sensible y específico para evaluar los niveles de metilación del ADN [25]. Hemos sido capaces de diseñar cebadores para tres regiones (
TFAP2B
,
ARHGEF4
, y
RAPGEFL1
) (Figura 1C). Nº
Gen Gen símbolo
Chr
nt, número
sonda ID
Relación con la isla CpG
Posición de gen
Incidencia
a
1
TFAP2B
** El factor de transcripción AP-2 beta650791202cg27260772IslandBody2450791419cg22248052IslandBody142
SOX2OT
Sox2 superposición transcript3181438216cg05513806S_ShoreBody223
ARHGEF4
** factor de intercambio de nucleótidos de guanina Rho (GEF) 42131792772cg13024709IslandBody204
RAPGEFL1
** factor de intercambio de nucleótidos guanina Rap (GEF) -al igual 11738347603cg20668644IslandBody1938347968cg24903006S_ShoreBody1938347710cg00129651IslandBody145
GRK7
*G quinasa del receptor acoplado a la proteína 73141516705cg25640519S_ShoreBody186
-
2200327334cg07835424Island-187
-
2119607885cg09385093Island-188
KCNA3
*Potassium dependiente de voltaje del canal, subfamilia relacionada con shaker-, miembro de 31111217194cg20302133Island1stExon159
BCAT1
* cadena ramificada aminoácido transaminasa 1, cytosolic1225055967cg20399616IslandBody1410
KLF16
* factor de Kruppel como 16191857004cg04998634IslandBody1411
-
1170630558cg23089825Island 1. -14Table regiones genómicas identificadas por el análisis BeadChip
NOTA:
a
Incidencia de la frecuencia de hipermetilación (βvalue & gt; 0,5) en 28 ESCCs.. ** Los cebadores para HRMA fueron diseñados con éxito. * Los cebadores para HRMA no podían ser diseñados. Descargar CSV CSV
Calificación de las tres regiones como una fracción de marcador
Para confirmar que las tres regiones eran completamente no metilado en las células no cancerosas, y completamente metilado en las células cancerosas, se analizaron sus niveles de metilación en i ) ocho muestras de células no cancerosas LCM-purificado a partir de ocho ESCCs, ii) ocho muestras de células de cáncer de LCM-purificado a partir de los ocho ESCCs, iii) los ocho ESCCs antes de LCM, iv) los leucocitos periféricos de un voluntario sano, y v) los cuatro CECA líneas celulares (Figura 2A).
(A) se analizaron los niveles de metilación de las tres regiones en i) ocho muestras de células no cancerosas LCM-purificado a partir de tres ESCCs, ii) ocho muestras de células de cáncer de LCM-purificado a partir de los tres ESCCs, iii) la ocho ESCCs antes de LCM, iv) los leucocitos periféricos de un voluntario sano, y v) cuatro líneas celulares CECA. Una o más de las tres regiones fueron casi completamente metilado en las células cancerosas purificadas y líneas celulares de cáncer, y todos fueron casi no metiladas en células no cancerosas. (B) Copiar alteraciones en el número de las tres regiones se analizaron mediante PCR cuantitativa utilizando 15 ESCCs.
En las ocho muestras de células no cancerosas LCM-purificado y los linfocitos circulantes, las tres regiones eran casi completamente no metilado, y en las cuatro líneas celulares CECA, todos ellos estaban completamente metilado. En las ocho muestras de células de cáncer de LCM-purificada, al menos una de las tres regiones fue casi completamente metilado. Sin embargo,
TFAP2B Hoteles en Et5T muestra,
ARHGEF4 Hoteles en Et1T, Et2T, Et4T, y Et5T, y
RAPGEFL1 Hoteles en Et2T no estaban completamente metilado, posiblemente debido a la heterogeneidad entre los Células cancerígenas. Tales regiones no eran adecuados como marcador fracción para algunas muestras específicas. Al mismo tiempo, la región con el nivel de metilación más alta en las muestras de células de cáncer de LCM-purificada también mostró el nivel de metilación más alta de los ESCCs antes de LCM. Por lo tanto, el nivel de metilación más alta de las tres regiones se considera que refleja la fracción de células cancerosas en el ESCCs.
El nivel de metilación de una región en una muestra puede ser afectado por una alteración del número de copias de la región. Por lo tanto, se analizaron las alteraciones del número de copias de las tres regiones que utilizan ESCCs 15 (Figura 2B). Para
ARHGEF4
, no se observaron alteraciones de número de copia significativa. Por el contrario, para
TFAP2B
y
RAPGEFL1
, se observaron alteraciones del número de copias significativa en las frecuencias bajas (
TFAP2B
, 1.64-1.65 veces los cambios en tres de los 15 ESCCs;
RAPGEFL1
, cambio de 0,60 veces en uno de los 15 ESCCs). Suponiendo que el número de copias alteraciones 2 veces o 0,5 veces estaban presentes en las células cancerosas, una desviación del nivel de metilación medida desde la verdadera fracción de las células cancerosas se calculó que era de menos de 17,2% (Figura S1). Además, la incidencia de alteraciones significativas del número de copias de
TFAP2B
y
RAPGEFL1
fue baja (
TFAP2B
, 20%;
RAPGEFL1
, 6,7%) . Por lo tanto, el efecto de las alteraciones del número de copias de
TFAP2B
, y
RAPGEFL1
fue considerado como mínimo en la estimación de una fracción de las células cancerosas. Finalmente, definimos la fracción de células de cáncer como el nivel de metilación más alta de las tres regiones.
Análisis de la exactitud de la Fracción marcador
A continuación, analizó si la fracción de células de cáncer estimado por el marcador fracción realmente refleja la fracción de células de cáncer estimados por el examen microscópico. Se midió los niveles de metilación de las tres regiones en 20 ESCCs (Figura 3A), y se estimó la fracción de células de cáncer en cada muestra, utilizando el valor más alto de las tres regiones. En los 20 ESCCs,
TFAP2B
,
ARHGEF4
, y
RAPGEFL1
mostró los valores más altos en nueve, nueve y dos muestras, respectivamente. Independientemente, la fracción de células de cáncer se estimó mediante el examen microscópico de secciones en serie. Hemos sido capaces de observar una buena correlación entre los dos métodos (r = 0,85; p & lt; 0,001) (Figura 3B). Este resultado confirmó que la fracción de células de cáncer estimados por el marcador fracción refleja con precisión la verdadera fracción de células cancerosas en una muestra de tumor.
(A) los niveles de metilación de las tres regiones se analizaron en 20 ESCCs por MS-HRMA. La fracción de células de cáncer en cada muestra se define como el nivel de metilación más alta de las tres regiones. (B) Correlación entre la fracción de células de cáncer estimados por el marcador de fracción y que evaluado por examen microscópico. La correlación entre los dos métodos, calculado mediante el coeficiente de correlación momento-producto de Pearson, era suficientemente alta (r = 0,85).
Aplicación de la Fracción marcador
aplicó el marcador fracción de comparar las fracciones de células de cáncer entre las muestras de biopsias y piezas quirúrgicas. Las fracciones de células cancerosas en 39 muestras de biopsia y 96 especímenes quirúrgicos fueron evaluados utilizando el marcador de fracción. Entre las 135 muestras,
TFAP2B
,
ARHGEF4
, y
RAPGEFL1
tuvo los valores más altos en el 60, 37, y 38 muestras, respectivamente, y los valores más altos fueron definidos como las fracciones de las células cancerosas en las muestras. La fracción media de las células cancerosas en las muestras de biopsia (media ± SD, 53,5 ± 17,1%; rango, 7,3 a 86,7%) no fue significativamente diferente de la de las muestras quirúrgicas (56,7 ± 18,9%; 14,0 a 87,3%) (p = 0,377) (Figura 4A). Las varianzas eran grandes, tanto en las muestras de biopsia y en las muestras quirúrgicas, y no hubo diferencia significativa entre las muestras de biopsia y muestras quirúrgicas (p = 0,076). Esto confirmó que la contaminación de las células normales hay que tener cuidado de para el análisis de muestras de ADN tumoral con contenidos celulares de cáncer desconocidas.
(A) Aplicación del marcador fracción de la comparación de la fracción de células de cáncer entre las muestras de biopsias y piezas quirúrgicas. Las fracciones de células de cáncer en 39 muestras de biopsia y 96 muestras quirúrgicas se estimaron por el marcador de fracción, y no se observó diferencia significativa. (B) Aplicación del marcador fracción de análisis de metilación del ADN. Los valores beta en bruto, de dos sitios CpG [cg22879515 (MIR34B), cg23180938 (CDO1)] fueron corregidos por el contenido de las células cancerosas en 28 ESCCs. Algunos ESCCs tenían metilación casi completa (valor β ≥ 0,8).
El marcador de fracción se aplicó también a excluir el efecto de la contaminación de las células normales en el análisis de la metilación del ADN. Para este fin, se seleccionaron los sitios CpG dentro de los 200 pb de los sitios de inicio de transcripción (TSS200) para los dos genes supresores de tumores (cg22879515 (
MIR34B
) [26], y cg23180938 (
CDO1
) [27]), y la distribución de cuotas de sus valores beta obtenidos en el análisis inicial de metilación de todo el genoma. Se utilizaron los sitios CpG en TSS200 de los genes supresores de tumores, ya que se espera que no tenga o metilación total en muestras de cáncer debido a la ventaja de crecimiento conferida por su metilación. Los βvalues de los dos sitios CpG eran de menos de 0,1 en los leucocitos periféricos, la piscina de la mucosa normal, y el conjunto de las mucosas no canceroso, y los dos sitios CpG se consideraron casi completamente no metilado en las células normales. Los valores beta primas de los dos sitios CpG y βvalues corregidos por el contenido de las células cancerosas [Valor corregido valor β = β /(una fracción de células CECA en la muestra (%) /100)] se compararon (Figura 4B). Utilizando los valores beta corregidos por el marcador fracción, algunas muestras mostraron metilación completa (valor β ≥ 0,8), algunas muestras casi no mostró metilación (valor β & lt; 0,2). Este resultado sugiere que mediante el uso del marcador de fracción, hemos sido capaces de minimizar el efecto de la contaminación de ADN normal de las células en muestras de ADN tumorales para el análisis de metilación.
Discusión
En este estudio, la fracción de células cancerosas en una muestra ESCC se estimó con éxito utilizando los niveles de metilación del ADN como marcador fracción. Para lograr esto, hemos aislado tres regiones genómicas (
TFAP2B
,
ARHGEF4
, y
RAPGEFL1
) que fueron altamente y frecuentemente metilado en las células CECA, pero no en las células normales , mediante el análisis de metilación de todo el genoma. Este es el primer estudio en el que se estima una fracción de células cancerosas en una muestra de ADN del tumor mediante la metilación del ADN. Recientemente, regiones genómicas diferencialmente metiladas entre el cáncer y las células normales se han identificado en muchos tipos de cáncer [14-18]. Por lo tanto, podemos esperar para identificar regiones genómicas específicas y con frecuencia altamente metilados en en los otros tipos de células cancerosas, pero no en las células normales. Mediante la medición de los niveles de metilación de ADN de dichas regiones genómicas específicas, la fracción de células de cáncer puede ser también estimada en muestras de ADN de otros tipos de cáncer.
La precisión del marcador fracción se verificó mediante la comparación de la fracción de células de cáncer estimados por el marcador de fracción con la estimada por examen microscópico. Un gran precisión fue apoyada por una buena correlación entre las fracciones de células de cáncer estimados por los dos métodos (r = 0,85). Además, los niveles de metilación de CpG en dos sitios TSS200 de dos genes supresores de tumores (
MIR34B
y
CDO1
) fueron corregidos, y algunas muestras de cáncer mostraron metilación casi completa. análisis gráfico de dispersión de los valores de beta antes y después de la corrección mostró que algunas de las muestras con valores bajos de beta tenían grandes aumentos (figura S2). Prácticamente, nuestra marcador fracción tiene la ventaja sobre el examen microscópico, ya que puede ser utilizado para las muestras solamente con el ADN y la dedicación de patólogos experimentados no es necesario. Nuestra marcador fracción también tiene una ventaja sobre los enfoques que usan SNP microarrays y NGS, ya que puede ser utilizado incluso sin muestras normales emparejados, y se puede analizar de forma relativamente fácil y económica. Por lo tanto, el uso de un marcador fracción tiene una exactitud razonable, y ventajas prácticas sobre los otros métodos.
Una limitación de nuestro marcador fracción es que la estimación puede ser influenciada por la heterogeneidad entre las células del cáncer debido a que las tres regiones no siempre son completamente metilado en las células cancerosas. Puesto que las células cancerosas son teóricamente clonal, la heterogeneidad se consideró que era debido a la metilación o desmetilación durante la progresión del cáncer. Para minimizar el efecto de la heterogeneidad entre las células cancerosas, se seleccionaron tres regiones como los que tienen la más alta incidencia de hipermetilación (βvalue & gt; 0,5) entre los 28 ESCCs. También confirmó que, utilizando ocho cancerosas y células no cancerosas muestras LCM purificado emparejados, al menos una de las tres regiones fue metilado casi completamente en las células cancerosas. Otra limitación es que las alteraciones del número de copias pueden influir en la estimación. Para excluir los efectos de las alteraciones del número de copias en la estimación, que también investigó el número de copias alteraciones de las tres regiones en 15 ESCCs, y confirmó que las alteraciones del número de copias que podrían causar una gran desviación de la estimación de la fracción de células cancerosas no se observaron en las tres regiones. Debido a estas características, el marcador fracción hecho de las tres regiones puede ser utilizado para la gran mayoría de ESCCs. Finalmente, en Et3N muestra, una muestra de células no cáncer LCM-purificada, las tres regiones fueron ligeramente metilados. Esto se considera que es debido a la purificación incompleta por LCM porque límites entre grupos de células de cáncer y grupos de células no cancerosas eran extremadamente claro en esta muestra.
En conclusión, la metilación del ADN se puede utilizar para la estimación de la fracción de células cancerosas en una muestra de ADN del tumor. La estimación se considera que es un método práctico y precisos para el análisis molecular de los tejidos de cáncer en el que casi siempre están contaminadas células normales. Se espera que el marcador de la fracción de la metilación del ADN para ser altamente ventajoso en muchos aspectos de la investigación del cáncer.
Apoyo a la Información
Figura S1.
nivel de metilación de medición y la verdadera fracción de las células cancerosas. Suponiendo un aumento de número de copias de 2 veces estaba presente en las células cancerosas, la verdadera fracción de las células cancerosas se calculó como el [nivel de metilación Medido (%) /(nivel de metilación de 200 Medido (%))] x100. Suponiendo una pérdida del número de copias de 0,5 veces estaba presente en las células cancerosas, la verdadera fracción de las células cancerosas se calculó como el [nivel 2xMeasured metilación (%) /(100 + nivel de metilación medido (%))] x100. Una desviación del nivel de metilación medida desde la verdadera fracción de las células cancerosas se calculó que era de menos de 17.2%, tanto en la ganancia de 2 veces y en la pérdida de 0,5 veces.
doi: 10.1371 /journal.pone.0082302.s001 gratis (TIF)
figura S2.
Comparación de los valores beta antes y después de la corrección. Los valores beta prima de dos sitios CpG [cg22879515 (
MIR34B
), cg23180938 (
CDO1
)] fueron corregidos por el contenido de las células cancerosas en los 28 ESCCs. El eje X muestra los valores de beta primas, y el eje y muestra los valores de beta después de la corrección.
doi: 10.1371 /journal.pone.0082302.s002 gratis (TIF)
Tabla S1.
Los cebadores y las condiciones para MS-HRMA
doi: 10.1371. /journal.pone.0082302.s003 gratis (DOCX): perfil del cuadro S2.
Los cebadores y las condiciones para la PCR cuantitativa
doi: 10.1371. /journal.pone.0082302.s004 gratis (DOCX)
Reconocimientos
Agradecemos al Sr. Marcos para Glaire la prueba de lectura de nuestro manuscrito y de las instalaciones del Centro Nacional de Investigación del cáncer del núcleo para la preparación de las secciones de especímenes quirúrgicos incluidos en parafina en este estudio.