Extracto
Las células cancerosas adoptan la glucólisis como la principal fuente de producción de energía metabólica para el crecimiento celular rápido. El PFKFB3 inducida por HIF-1 juega un papel clave en esta adaptación mediante la elevación de la concentración de Fru-2,6-BP, el estimulador más potente de la glucólisis. Como esta conversión metabólica ha sido sugerido para ser una característica del cáncer, PFKFB3 ha surgido como un nuevo objetivo para la quimioterapia del cáncer. En este caso, nos informan de que un inhibidor molecular pequeña, N4A, fue identificado como un compuesto de plomo inicial de inhibidor PFKFB3 con potencial terapéutico. En un intento de mejorar su potencia, se determinó la estructura cristalina del complejo PFKFB3 • N4A a 2,4 Å de resolución y, explotando la información molecular resultante, alcanzado la más potente YN1. Cuando se probó en células de cáncer cultivadas, tanto N4A y YN1 inhibidas PFKFB3, suprimiendo el nivel Fru-2,6-BP, que a su vez suprime la glucólisis y, en última instancia, condujo a la muerte celular. Este estudio valida PFKFB3 como un objetivo para nuevas terapias contra el cáncer y proporciona un marco para futuros esfuerzos de desarrollo
Visto:. Seo M, Kim JD, Neau D, I Sehgal, Lee YH (2011) Desarrollo Estructura-base de Inhibidores de moléculas pequeñas PFKFB3: Un marco para agentes terapéuticos potenciales del cáncer de focalización del efecto Warburg. PLoS ONE 6 (9): e24179. doi: 10.1371 /journal.pone.0024179
Editor: Anil Kumar Tyagi, Universidad de Delhi, India
Recibido: 2 de mayo de 2011; Aceptado: August 2, 2011; Publicado: 21 Septiembre 2011
Derechos de Autor © 2011 Seo et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo el apoyo de una beca del National Cancer Institute 1R01 CA124758-01 a Y.-HL Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
a diferencia de las células normales, se han observado células cancerosas a cambiar su metabolismo de la energía hacia la glucólisis [1]. Este fenómeno, denominado originalmente el efecto Warburg y esta transición permite que las células de cáncer para satisfacer aumento de las necesidades de biosíntesis para la biomasa y la energía [2], [3]. Los estudios han demostrado consistentemente una cantidad anormalmente alta tasa glucolítica en un amplio espectro de cánceres humanos, pero los mecanismos causales responsables de esta adaptación metabólica siguen estando mal entendido [4], [5]. Entre los posibles mecanismos, defectos respiratoria mitocondrial y la hipoxia en el microambiente tumoral se atribuyen como dos factores importantes para el efecto Warburg [6], [7], [8]. A pesar de la complejidad y el carácter de los mecanismos subyacentes responsables del efecto Warburg, las consecuencias metabólicas son una transformación constante hacia la glucólisis como la principal fuente de producción de ATP [4], [9]. Esta alteración metabólica de las células cancerosas proporciona base abiochemical para suprimir preferentemente progresión de las células malignas por la inhibición selectiva de la glucólisis [10], [11], [12].
En la vía de la glicólisis, la fosfofructoquinasa-1 (PFK- 1) cataliza la gran paso limitante de la velocidad que convierte la fructosa-6-fosfato (Fru-6-P) a fructosa-1, 6-bisfosfato (Fru-1, 6-BP) y está regulada alostéricamente por la fructosa-2,6 -bisphosphate (Fru-2,6-BP) [13], [14]. Bajo suministro de energía abundante, altos niveles de ATP inhiben fuertemente la actividad PFK-1; sin embargo, Fru-2,6-BP puede anular este efecto inhibidor y mejorar la captación de glucosa y el flujo glucolítico [15]. Como era de esperar, la síntesis de Fru-2,6-BP está regulado en muchas líneas celulares de cáncer, lo que sugiere que el agotamiento intracelular selectiva de Fru-2,6-BP en células cancerosas pueden potencialmente ser utilizado para impedir el flujo glucolítico y suprimir la supervivencia de células malignas y la progresión [16], [17], [18].
Una familia de enzimas bifuncionales, 6-fosfofructo-2-quinasa /fructosa-2,6-bisphosphatases (PFKFB1-4), son los responsables de los niveles intracelulares de Fru-2,6-BP [18], [19], [20]. Entre estas isoenzimas, PFKFB3 es dominante sobre-expresan en la tiroides, mama, colon, próstata y líneas de células tumorales de ovario [18], [21], [22]. Estudios recientes han demostrado que la inducción de la expresión PFKFB3 por HIF-1 en condiciones de hipoxia es seguida por el aumento de potencial invasivo y la resistencia a la quimioterapia [21], [23]. Tomados en conjunto, estos estudios sugieren PFKFB3 es un objetivo potencial para una nueva clase de agentes antineoplásicos que impiden la aparición de la glucólisis específica del cáncer mediante la inhibición de la oleada Fru-2,6-BP y, con el tiempo, inducir la muerte de las células cancerosas. En consecuencia, la inhibición de PFKFB3 como una estrategia terapéutica para el cáncer se ha sugerido [22].
A pesar de los méritos potenciales, la explotación de PFKFB3 para la terapia del cáncer se ha mantenido pobres. Clem et al (2008) informó de un compuesto que contiene piridinil-como un posible inhibidor de PFKFB3, basado en la estructura del receptor previsto de la de PFKFB4 [24]. Aunque prometedor, inhibidores basados en estructuras que no sean la verdadera enzima PFKFB3 pueden carecer de especificidad y limitar mejora estratégica de la potencia del inhibidor. Hemos sido capaces de superar un defecto congénito por ejemplo mediante la participación en los estudios estructurales de PFKFB3 y sus complejos con ligandos. En este informe, hemos identificado N4A como un inhibidor competitivo novela y probado su efecto inhibidor sobre la actividad PFKFB3. Para entender el mecanismo molecular de inhibidores de reconocimiento por PFKFB3, se determinó la estructura de la PFKFB3 en complejo con N4A.Guided por la base estructural para la unión del inhibidor; fuimos capaces de optimizar N4A, mediante la búsqueda de similitud y evaluación computacional, lo que resulta en un compuesto de plomo de seguimiento con una mejora de 5 veces en la potencia.
Además del mecanismo molecular de la inhibición PFKFB3 y mejora inhibidor , que también investigó la inhibición de la producción y de la glucólisis Fru-2,6-BP en células HeLa por el tratamiento con inhibidores de PFKFB3. Los inhibidores de PFKFB3 novela, N4A y YN1 reducen los niveles Fru-2,6-BP y el flujo glucolítico, resultando en la inhibición del crecimiento de células tumorales y la muerte celular masiva. Estos resultados proporcionan evidencia de que no sólo valida la orientación de PFKFB3 sino también la primera visión estructural directa en las interacciones inhibidor de la proteína, se establece una base para la optimización y desarrollo de inhibidores PFKFB3 novedosos como agentes quimioterapéuticos para el cáncer estructura asistida.
resultados
estrategia general para el cribado de inhibidores y la mejora
un diagrama de flujo esquemático que describe nuestra estrategia adoptada para el descubrimiento y la mejora de los inhibidores de PFKFB3 se muestra en la Figura 1. los candidatos para un compuesto de plomo fueron seleccionados de cribado computacional usando la estructura cristalina de PFKFB3 que hemos determinado previamente a 2,1 Å de resolución [25] se utilizó como tamiz molecular de detección (a). Los compuestos de golpe resultante de este tamiz molecular se evaluaron mediante el ensayo de inhibición enzimática y compuestos con la mayor actividad de inhibición fueron seleccionados como moléculas de plomo después de la consideración de fármaco-verosimilitud (b). A continuación, propiedades cinéticas detalladas se caracterizaron (c) y los efectos biológicos sobre las células de adenocarcinoma humano fueron investigados mediante la medición de flujo glucolítico, inhibición del crecimiento, y la muerte celular (d). Para entender la base molecular de la inhibición de la PFKFB3, de rayos X análisis de la estructura cristalográfica de la PFKFB3 • complejo inhibidor se llevó a cabo (e). Basándose en la información molecular obtenida de la etapa (e), se realizó una búsqueda de nuevos compuestos derivados con la mejora de la potencia, utilizando el compuesto de plomo como una plantilla (f). Los compuestos que resultan de esta búsqueda de similitud se evaluaron a través de acoplamiento computacional usando FlexX [26] (a) y el compuesto mejor optimizado se pasó a través de este proceso de selección de nuevo. A través de ciclos iterativos de estos procesos, hemos sido capaces de obtener un compuesto con actividad inhibidora de órdenes de magnitud por encima de la ventaja inicial y que muestra la inhibición PFKFB3 potente in vitro.
Inhibidor de detección y propiedades de unión
Durante nuestro estudio anterior, varios compuestos capaces de unirse al bolsillo Fru-6-P de PFKFB3 se identificaron a partir de cribado virtual. Para confirmar las actividades inhibidoras y para eliminar los falsos positivos de estos fármacos candidatos, la inhibición PFKFB3 se ensayó a 10 mM cada uno de los compuestos (Figura 2A). Para evitar la inhibición no específica causada por interacciones hidrofóbicas aleatorios entre inhibidor y la proteína, se realizó un mismo ensayo, en presencia de 0,1% de Tween-20. Entre los compuestos ensayados, ZINC04887558 (N4A, 5, 6, 7, 8-tetrahidroxi-2- (4-hidroxifenil) cromen-4-ona) actividad de la enzima inhibida mayor que 65% bajo las condiciones del sustrato saturante y esta inhibición no se vio afectada por la presencia de Tween-20. Seleccionamos N4A como un "líder" inicial (Figura 2B). El estudio cinético posterior reveló que N4A inhibe PFKFB3 con una CI
50 valor of2.97 ± 0,16 M (Tabla 1). Un estudio de inhibición estado estacionario mostró que N4A inhibe PFKFB3 como un inhibidor competitivo contra Fru-6-Pcon una K
i de 1,29 ± 0,26 M, como se espera de cribado virtual y como se demuestra en una representación de Lineweaver-Burk (Figura 2C) .
(A) potencias de inhibición de los compuestos candidatos. Las magnitudes de la inhibición por compuestos a 10 mM cada uno se miden a través del ensayo de la enzima y presentados como percentiles contra el control (□). Un mismo experimento también se realizó en presencia de 0,1% de Tween-20 (▪), para eliminar los falsos positivos causados por interacciones hidrófobas no específicas. (B) Las estructuras de los inhibidores PFKFB3. (C) de Lineweaver-Burk gráficas que muestran la inhibición competitiva por N4A contra Fru-6-P. Las concentraciones de inhibidor utilizadas fueron: 0 mM (▪), 1 M (○), 2 M (▴), y 3 M (Box) de N4A. También están etiquetados junto a las parcelas individuales. (D) de Lineweaver-Burk gráficas que muestran la inhibición competitiva por YN1 contra Fru-6-P. Las concentraciones de inhibidor utilizadas fueron: 0 mM (▪), 1 M (○), 2 M (▴), y 3 M (Box) de N4A. (E) Selectividad de N4A y YN1 en isoformas PFKFB. Los resultados se expresan como porcentaje de inhibición a dos veces el IC
50 concentración contra PFKFB3 (N4A = 6 M, YN1 = 1,3 M).
La mejora de la eficacia de inhibición del compuesto de plomo, N4A, mediante la optimización de la estructura de guiado es un objetivo importante de este estudio. Como los detalles serán discutidos en las siguientes secciones, se introduce solamente un resultado final breve aquí para las comparaciones tempranas. Dos inhibidores adicionales N4A, yn 1 (7, 8-dihidroxi-3- (4-hidroxifenil) cromen-4-ona) y YZ9 (acetato de 7-hidroxi-2-oxochromene-3-carboxilato de metilo) (Figura 2B) se han obtenido usando estructura de guiado de optimización. Como se resume en la Tabla 1, YN1 exhibitsIC
50 = 0,67 M y K
i = 0,24 ± 0,03 M, que muestra un aumento de 5 veces en la inhibición. Compuesto YZ9 muestra aún mayor inhibición de un orden de magnitud por encima del conductor de inicio, N4A. Todos los compuestos ensayados son solubles en varias soluciones acuosas hasta 50 M rangos en presencia de & lt;. 1% de dimetilsulfóxido (DMSO)
El compuesto de plomo, N4A, y un derivado, YN1, se ensayaron para determinar sus efectos inhibidores sobre otras isoformas PFKFB humanos. Los inhibidores tenían un efecto más fuerte en PFKFB3 que en otras isoformas PFKFB. Al doble de la IC
50 para PFKFB3 donde PFKFB3 era más del 80% inhibido, N4A exhibe inhibición de menos de 50% y YN1 muestra la inhibición de menos de 40% en PFKFB1, PFKFB2 y PFKFB4 (Figura 2E). N4A y YN1 son inhibidores relativamente selectivos de PFKFB3. La mejora de la especificidad isoforma debe ser el principal objetivo de la optimización de la etapa siguiente y tales esfuerzos se están realizando.
Efectos de N4A y YN1 en el Fru-2,6-BP niveles, la glucólisis, y el crecimiento celular
a continuación se investigó los efectos de la aplicación del N4A y YN1inhibitors vivir células HeLa. se espera que la inhibición de PFKFB3 para causar una disminución en los niveles de Fru-2,6-BP en células HeLa. Después de una exposición de 8 hora para N4A y YN1, Fru-2,6-BP se ha reducido aproximadamente un 20%; después de una exposición de 48 horas, Fru-2,6-BP se redujo más del 40% (Figura 3A). Baja regulación de los niveles de Fru-2,6-BP por N4A y YN1 fue acompañado por una disminución de la glucólisis, como se esperaba. La disminución de la Fru-2,6-BP niveles tras la exposición a N4A y YN1 condujo a una disminución en la producción de lactato, que se refleja en una disminución mayor del 30% en las secreciones de lactato. Tomados en conjunto, estos datos sugieren N4A y YN1 inhiben PFKFB3 lo que resulta en la supresión de la glucólisis (Figura 3B).
Se determinaron los niveles de Fru-2,6-BP (A) y los niveles de lactato secretada (B) enzimáticamente en puntos de tiempo 0, 4, 8, 12, 24, o 48 horas después de los tratamientos de inhibidor de células HeLa. Los resultados se normalizaron a las concentraciones de proteína de la muestra y se expresaron como una relación al valor de tratado con vehículo. Los datos son medias ± S.E.M. de al menos tres experimentos. se muestran los efectos dependientes del tiempo de 25 mM de cada uno de N4A (línea con el diamante) y YN1 (línea punteada con cuadrado hueco) en los niveles celulares Fru-2,6-BP (A) y las secreciones de lactato (B). (C) La inhibición del crecimiento por N4A, YN1, y YZ9 sobre células HeLa y T47D. El número de células se analizaron más de 36 horas por parte del conteo de azul de tripano o ensayo XTT. Los puntos de datos se expresan como% de crecimiento de células de control que contiene vehículo contra escala logarítmica de las concentraciones de inhibidor. Error destacan las rejas por intraexperimental replica desviación estándar.
El aumento de los niveles de Fru-2,6-BP precedido por un aumento de la glucólisis a menudo acompaña a la proliferación de las células transformadas, incluyendo las células del cáncer [3]. Se examinó el efecto de los inhibidores de PFKFB3, N4A y YN1, en la tasa de proliferación de las células de adenocarcinoma humano. Los tratamientos con 25 mM de cada uno de N4A y YN1 causaron 70% y más de 90% de reducción, respectivamente, en la proliferación celular, en comparación con las células no expuestas (Figura 3C). Los resultados de los ensayos de inhibición de crecimiento de células confirmó consistentemente que la inhibición de PFKFB3 por N4A y YN1 suprime el metabolismo de la energía celular y, en última instancia, el crecimiento celular y que YN1 es un inhibidor más potente con un GI
50 de 8,2 ± 0,8 M en comparación con N4A (GI
50 = 14,2 ± 1,5 M) (Tabla 1). N4A y YN1 también fueron capaces de inhibir la formación de agar blando de colonias en células HeLa (Figura 4). Las células HeLa se colocaron en placas en agar blando, con diferentes concentraciones de N4A o YN1 y se dejaron crecer durante 3 semanas para permitir la formación de colonias. Ambos compuestos inhibieron significativamente la formación de colonias en 25, 50 y 100 mM. La formación de colonias fue inhibida por 64% y 79% en presencia de N4A 25 M y YN1, respectivamente.
independiente del anclaje crecimiento celular (A) en agar blando. células HeLa se cultivaron en agar blando durante 21 días en presencia de las concentraciones indicadas de N4A y YN1 respectivamente (20 ×). (B) Análisis estadístico del experimento. Columnas, media (n = 5); bares, Dakota del Sur.
Para investigar más a fondo el mecanismo responsable del efecto antiproliferativo de los inhibidores de PFKFB3, se realizó un análisis por citometría de flujo de la muerte celular. Los resultados indican que N4A y YN1 inducidos tanto la muerte celular apoptótica y necrótica. Este patrón mixto está relacionada con la naturaleza de la apoptosis, lo que, a diferencia de la necrosis, es un proceso dependiente de ATP [27], [28]. La muerte celular inducida por los inhibidores de PFKFB3 debe correlacionar con su capacidad para agotar ATP celular y el agotamiento de ATP favorece la muerte por necrosis como especulado anteriormente [11], [27], [28]. Nuestros datos apoyan este argumento: a una concentración relativamente baja (25 mM) de N4A o YN1, un entorno en el que el agotamiento de agotamiento de la energía celular es moderada, se encontraron células a ser propensos a la apoptosis, mientras que, a concentraciones más altas (50 mM) de inhibidores, la muerte por necrosis se incrementó de manera significativa debido a la insuficiencia de la energía celular para apoyar el proceso de apoptosis (Figura 5).
las células se trataron con dos concentraciones diferentes de los inhibidores, 25 mM y 50 mM. (A) la muerte celular inducida a dos concentraciones diferentes de N4A se midió por citometría de flujo después de la doble tinción con anexina V y PI. (B) La cuantificación de los datos de citometría de flujo (media ± DE) que muestra un efecto relacionado con la dosis de N4A. (C) citogramas de YN- induce la muerte celular y (D) la cuantificación de los datos de citometría de flujo.
Estructura de la PFKFB3 • N4A complejo
deseaba utilizar el N4A inhibidor como una ventaja para la optimización de la estructura de guiado de nuevos inhibidores. Para facilitar esta tarea, era necesario determinar las características moleculares de N4A unen a PFKFB3 cristalizando PFKFB3 humano en presencia de N4A. Se determinó la estructura de este complejo de la resolución 2,4 A por un método de sustitución molecular utilizando la primera estructura PFKFB3 (código PDB: 2AXN) como un modelo de búsqueda [29]. Un