Extracto
Antecedentes
Estudios recientes han puesto de relieve los vínculos causales entre los microARN desregulación (miRNAs) y el desarrollo de tumores. En el carcinoma hepatocelular (HCC), más y más miRNAs fueron identificados como biomarcadores de cáncer de diagnóstico y pronóstico, así como herramientas terapéuticas adicionales. Este estudio tuvo como objetivo investigar la importancia funcional y mecanismo de regulación de la agrupación de miR-199a2 /214 en la progresión del HCC.
métodos y las conclusiones
En este estudio, se demostró que el miR-214, como se así como miR-199a-3p y los niveles de miR-199a-5p se redujeron significativamente en la mayoría de los examinados 23 HCC tejidos y líneas celulares HepG2 y SMMC-7721, en comparación con sus homólogos no tumoral. Para explorar más a fondo el papel de miR-214 en hepatocarcinogénesis, nos da a conocer que el ER estrés inducido por el factor pro-supervivencia XBP-1 es un objetivo de miR-214 mediante ensayo de transferencia Western y ensayo indicador de luciferasa. Re-expresión de miR-214 en líneas celulares de HCC (HepG2 y SMMC-7721) inhibió la proliferación y la apoptosis inducida. Además, la expresión ectópica de miR-214 suprimió drásticamente la capacidad de las células de HCC para formar colonias in vitro y el desarrollo de tumores en un modelo de xenotrasplante subcutáneo de la /c atímicos ratones desnudos BALB. Por otra parte, la reintroducción de XBP-1 atenúa mediada por la supresión de miR-214 de células HCC proliferación, la colonia y la formación de tumores. Para comprender mejor el mecanismo de la miR-199a /214 clúster abajo-expresión en el CHC, se encontró que thapsigargina (TG) y tunicamicina (TM) o la respuesta de la proteína desplegada inducida por hipoxia (UPR) suprime la expresión de miR-199a /214 clúster en células de HCC. Por análisis de promotor del gen miR-199a2 /214, que conjeturamos NFkB como un potencial regulador negativo. Encontramos, además, que la UPR y la activación de NFkB inducida por LPS suprimidos miR-199a2 /214 transcripción, y esta supresión se invirtió por la inhibición de NFkB en las células de HCC.
Conclusiones
Nuestro estudio sugiere que la modulación de los niveles de miR-214 pueden proporcionar un nuevo enfoque terapéutico para el tratamiento del cáncer y reveló que la UPR puede ofrecer una nueva explicación de por qué el /clúster 214 miR-199a se redujeron regulado en la progresión de HCC
Visto:. Duan Q, Wang X, Gong W, Ni L, Chen C, Él X, et al. (2012) El estrés ER modula negativamente la expresión del miR-199a /214 clústeres para Regula tumor supervivencia y la progresión en cáncer hepatocelular humano. PLoS ONE 7 (2): e31518. doi: 10.1371 /journal.pone.0031518
Editor: Terence Lee, Universidad de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 16 Septiembre, 2011; Aceptado: 9 Enero 2012; Publicado: 16 de febrero 2012
Derechos de Autor © 2012 Duan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 30930039, 81000097 y 30770882), y el Programa Nacional de Investigación básica de China (973 Programa Nº 2007CB512004). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
MiRNAs son una nueva clase de endógeno, ARN 19-25 nucleótidos de longitud que median la represión de los transcritos diana mediante la unión a secuencias de semillas complementarios en las regiones 3 'no traducidas (UTRs) de los ARNm diana [1 no codificante ]. Desde la observación inicial, más de 1400 miRNAs humanos se han registrado en miRBase (v.17.0). Estudios previos han sugerido dysexpression de miRNAs se ha observado en varios tipos de cánceres y también se asocia con el resultado clínico de pacientes con cáncer [2]. Además, las capacidades de miRNAs para lograr un ajuste fino simultánea de numerosos genes diana diferentes los hace reguladores fundamentales de la señalización celular y los implica en la progresión del tumor [3], [4]. Sin embargo, sus funciones específicas y las funciones de los principales tipos de cáncer y la progresión maligna del cáncer aún no se han aclarado completamente.
El carcinoma hepatocelular (HCC) es uno de los cánceres más comunes en todo el mundo y entre las principales causas de cáncer- muerte relacionada en Asia, especialmente en china [5]. Varios miRNAs, como miR-101 [6], el miR-122 [7], [8], [9] el miR-373 [10], el miR-221/222 [11], [12], [13], miR-195 [14], el miR-30d [15], el miR-125 ter [16], el miR-18a [17], el miR-139 [18], el miR-223 [19] y miR-29 [20], tiene ya se ha informado de regular la progresión del tumor HCC y metástasis mediante la regulación de los genes clave como MCL-1, ADAM17, YAP, DDIT4, ciclina D1, CDK6, E2F3, Galphai2, LIN28B, los receptores de estrógenos-α, Rho-quinasa 2, estatmina 1 y Bcl-2 y así sucesivamente. Sin embargo, los datos existentes no pueden explicar plenamente la complejidad de HCC.
Recientemente, el miR-199a-3p /5p se verificó que ser disminuida en los tejidos HCC, y su disminución se correlaciona significativamente con la supervivencia de los pacientes con HCC, delineando un marcador potencial para predecir el pronóstico de los pacientes con HCC [5], [21], [22]. Es bien conocido que hay dos genes que codifican potencialmente pri-miR-199a, el precursor principal de hsa-miR-199a. El primer gen es MIR199a1 en el cromosoma 19 (NCBI geneid 406.976) y el segundo es MIR199a2 en el cromosoma 1 (NCBI GeneID 406977) [23]. Curiosamente, en el extremo 3 'de la transcripción pri-miR-199a2, está la secuencia precursora de otra miARN par HSA-mir-214 y HSA-mir-214 * [24]. miR-199a2 y miR-214 se han notificado a ser producido a partir de una única transcripción intrón-menos de Dinamina 3 opuesto (Dnm3os) que está incrustado en la cadena opuesta dentro de un intrón de Dinamina en ratón y ser humano [23], [24] . Además, se muestra la región miPPR-199a2 aquí para ser el promotor de miR-199a2 auténtica que produce la transcripción primaria que alberga el miR-199a-3p, miR-199a-5p y miR-214 secuencias como un grupo [25]. Más y más estudios documentado que el miR-214 está implicado en el cáncer de ovario humano, cáncer de cuello uterino y la progresión tumoral de melanoma [26], [27], [28], [29]. Sin embargo, el conocimiento actual acerca de la expresión y función de miR-214 en el CHC sigue siendo poco clara. Además, los mecanismos subyacentes de miR-199a2 /214 desregulación en el CHC aún no es clara.
En el presente estudio, hemos demostrado que el miR-199a-3p, miR-199a-5p y miR-214 fue la expresión redujo significativamente en los tejidos HCC. XBP-1 ha demostrado ser un objetivo directo de miR-214 por la interacción con la 3'-UTR. Además, se estudió el efecto supresor de miR-214 en la formación de tumores y el crecimiento CHC
in vitro
y
in vivo
, y la reintroducción de XBP-1 atenuados mediada por la supresión de miR-214. Se identificaron además que NFkB activadas por la respuesta de la proteína desplegada (UPR) suprime el miR-199a2 /214 transcripción, y demostramos que la activación de la UPR y el estrés del retículo endoplasmático (ER) representa un importante mecanismo responsable de miR-214 y miR-199a-3p /5p baja regulación en el desarrollo de HCC.
resultados
miR-199a /214 es downregulated en líneas celulares y tejidos HCC
Para estudiar el papel de la miR-199a /214 clúster en el HCC, los niveles de miR-214 y miR-199a-3p /5p se determinaron en 23 pares de HCC y tejidos benignos adyacentes usando PCR en tiempo real. Los resultados mostraron que estos miRNAs fueron significativamente las reguladas y miR-199a-3p & gt; miR-199a-5p & gt; miR-214 en comparación con los tejidos del hígado nontumorous adyacentes. Se observó disminución de la expresión de miR-214 en el 65% de HCC (15 de 23 casos), y consistente baja regulación tanto de miR-199a-3p y miR-199a-5p también fueron detectados en tanto como el 73% de HCC (17 de 23 casos) (Figura 1A y B). De forma paralela, en líneas celulares de HCC HepG2 y SMMC-7721, miR-199a-3p /5p y miR-214 expresión se redujo notablemente en comparación con el de hígado humano normal (Figura 1C).
(A) Box trazar representaciones gráficas de 23 HCC y tejidos benignos adyacentes emparejados agrupados de acuerdo con el miR-199a-3p y la expresión de miR-199a-5p. (B) Diagrama de cajas pantallas gráficas de 23 HCC y tejidos benignos adyacentes emparejados agrupan de acuerdo con el miR-214 expresión. (C) miR-199a /b-3p y miR-214 expresión en el hígado humano normal, HepG2, y SMMC-7721 líneas celulares de HCC se detectó utilizando en tiempo real QRT-PCR. Columnas, con una media de tres experimentos independientes; bares, SD; * P & lt;. 0,05 versus control
miR-214 se dirige directamente a XBP-1 por la interacción con la identificación 3'-UTR
de objetivos de genes regulados-miARN es un paso necesario para entender las funciones de los genes miARN. A pesar de que el miR-199a-3p y miR-199a-5p han sido reportados para contribuir a la carcinogénesis hepática [5], [21], [22], el papel de miR-214 en el CHC tumorigénesis no se ha dilucidado. Por lo tanto, el próximo realizaron búsquedas de los genes diana de miR-214 en el CHC. supuestos objetivos de miR-214 se prevé utilizar los programas de predicción de destino, y miRBase TargetScan. Se encontró que la alineación de secuencias de hsa-miR-214 con 3'-UTR de la XBP-1 gen humano identificado un miR-214 sitio de unión (Figura 2A). Para confirmar que XBP-1 es un objetivo putativo de miR-214, se construyó dos vectores indicadores de luciferasa de tipo salvaje XBP-1 3'UTR y mutado (la secuencia complementaria XBP-1 en la región 3'UTR de semillas de miR 214 sitio de unión fue mutado). Cuando se co-transfectadas con el miR-214 en células HepG2 imita, la actividad luciferasa relativa de un indicador de luciferasa XBP-1 3'UTR se suprimió significativamente por ~ 50% en comparación con la transfección de control negativo. En contraste, no se observó cambio en la actividad luciferasa relativa en las células transfectadas con el reportero mutante o vector vacío (Figura 2B). Estos resultados sugieren que miR-214 objetivos XBP-1 por la unión directa de la 3 'UTR de XBP-1.
(A) Secuencia de la alineación de miR-214 humana con 3'-UTR de XBP-1. La secuencia de semillas de miR-214 coincide con 3'-UTR de XBP-1 para crear el constructo indicador XBP-1 3'-UTR o luciferasa mutante. (B) de miR-214 inhibe reportero XBP-1 3'-UTR, pero no mutante o reportero de la actividad del indicador vacía. Las células HepG2 fueron transfectadas transitoriamente con plásmidos indicados con miR-control, miR-214 imita. Después de 36 h de incubación, las células se sometieron a ensayo de luciferasa. Columnas, con una media de tres experimentos independientes; bares, Dakota del Sur. * P & lt; 0,05 frente a miR-aire. (C) de miR-214 reduce XBP-1 de expresión en células HepG2 (izquierda) y SMMC-7721 células (derecha) analizados por Western Blot.
Estamos, además, que la transfección transitoria de células HepG2 y SMMC-7721 células con miR-214 reducen eficientemente XBP-1 los niveles de proteína detectadas por análisis de transferencia Western (Figura 2C), que era independiente de ATF6 y IRE1 de señalización (Figura S1). Resultados similares se han alcanzado en las células epiteliales humanas de cáncer de cuello de útero HeLa (Figura S2). Estos datos sugieren que miR-214 reconoce directamente la 3'UTR de XBP 1-ARNm e inhibe XBP-1 traducción.
Además, el análisis de transferencia Western mostró que XBP-1 nivel de proteína se incrementó en miR-214- HCC tejidos humanos regulados negativamente en comparación con los tejidos del hígado nontumorous adyacentes (Figura S3). Nuestro análisis reveló que XBP-1 era un objetivo potencial de miR-214.
miR-214 regula la proliferación celular y la apoptosis HCC
Los estudios previos han implicado XBP-1 como un factor de supervivencia esencial para estrés ER y el crecimiento del tumor [30], por lo tanto si elegimos el miR-214 ejerce un efecto contrario en el CHC para una mayor investigación. Para determinar el impacto de la proliferación de las células de miR-214 en el CHC, HepG2 y células SMMC-7721, respectivamente, fueron transfectadas con el miR-214 imita o miR-control y analizados para el crecimiento celular. El ensayo de proliferación de CCK-8 mostró que el crecimiento celular se redujo en 214 miR-imita-transfectadas células de HCC en comparación con las células transfectadas de control de miR o las células no tratadas (figura 3A). Resultados similares fueron observados por ensayo de incorporación de Br-dU en HepG2 y células SMMC-7721 (Figura 3B). Los resultados de la
in vitro
ensayos indicaron que exógena de miR-214, inhibió la proliferación de líneas celulares de hepatoma.
(A) Número celular relativa de las células HepG2 y SMMC-7721 a las 48 horas después de la transfección se evaluó mediante CCK-8 ensayo. tasa de crecimiento (B) de la célula de HepG2 y células SMMC-7721 a las 48 horas se evaluó después de la transfección usando un ensayo de incorporación Br-DU. (C) Después de 48 horas miR-214 imita la transfección, las células se marcaron con anexina V y se analizaron por citometría de flujo. (D) Después de 48 horas agomir-214 de tratamiento, las células SMMC-7721 se marcaron con anexina V y se analizaron por citometría de flujo * P & lt;. 0,05 vs sin tratar (HepG2 o SMMC-7721) tratan-miR-con o
Además, hemos probado si upregulated miR-214 induce la apoptosis de células HCC y la muerte celular, mediante la determinación del número de células HepG2 de apoptosis temprana y tardía siguientes tratamientos con miR-214 imita por análisis de citometría de flujo. Como se esperaba, se detectaron pocas células anexina V positivas en las células tratadas con miR-control o sin tratar, mientras que miR-214 restauración aumentó el porcentaje de células apoptóticas (~ 20% en HepG2) a juzgar por la tinción con anexina V (Figura 3C) . Consistentemente, también se detectaron efectos similares en las células SMMC-7721 tratadas con miR-214 imita el colesterol conjugado 2'-O-metilo-modificados (agomir-214) (Figura 3D). Estos resultados indican un papel inhibidor del crecimiento de miR-214 en el CHC.
miR-214 regula la formación de tumores HCC y el crecimiento in vitro e in vivo
Los resultados anteriores nos llevó a explorar la biológica importancia de miR-214 en el CHC tumorigénesis in vivo. Como paso inicial, se evaluó la capacidad de formación de colonias de células SMMC-7721 transfectadas con agomir-214 y agomir control negativo (agomir-NC). Los resultados mostraron que agomir tratados con-214 células muestran mucho menos y más pequeñas colonias en comparación con agomir-NC células tratadas (Figura 4A), que fueron consistentes con el ensayo de proliferación celular. Se inyectaron células SMMC-7721 Además, tratados 214-agomir agomir-NC- y s.c. en cada flanco posterior de los mismos ratones desnudos, respectivamente. Después de 4 semanas, se examinó el tamaño de los nódulos tumorales. Se encontró que los tamaños de los tumores y el peso del tumor en el extremo de la observación se redujo significativamente en el grupo de tratamiento agomir-214 en comparación con la del grupo de tratamiento agomir-NC (Figura 4B). También se encontraron resultados similares en xenoinjertos de células HepG2 trandfected con miR-214 imita en vivo (Figura S4 y S5) .Estos resultados sugieren que el miR-214 puede funcionar como un supresor tumoral putativo en células de HCC.
(A ) XBP-1 reintroducido invierte la supresión de la formación de colonias inducida por el tratamiento agomir-214 en las células SMCC-7721. (B) XBP-1 reintroducido invirtió la supresión de la formación de tumores inducidos por el tratamiento agomir-214 en las células CCPA-7721 ratón desnudo modelo de xenoinjerto. El peso del tumor 4 semanas después de la inoculación se midió. (C) XBP-1 reintroducido invierte la supresión de la proliferación de las células inducida por el tratamiento agomir-214 en las células CCPA-7721. Los resultados fueron reproducibles en tres experimentos independientes. * P & lt; 0,05 vs tratada agomir-NC;#P & lt; 0,05 frente a agomir-214 o agomir-214 + tratados con el vector
A fin de verificar un papel potente para la vía de miR-214 /XBP-1 en la mediación de la supervivencia células tumorales y en la regulación. el crecimiento del tumor HCC, que re-expresa XBP-1 en el miR-214 células de HCC tratados. Los resultados mostraron que restauró XBP-1 de expresión mediante la transfección de pCMV-XL5-XBP-1s atenuadas agomir-214 mediadas XBP-1 de supresión y efectos supresores de tumores
vitro
en y
in vivo
(Figura S6 y 4A-C).
respuesta a proteínas desplegadas regula a la baja de miR-199a /214 expresión en células de HCC
a medida que el miR-214 objetivos XBP-1 y XBP-1 es un efector clave de la UPR y ER estrés [31], [32], se investigó más a fondo si podría haber un vínculo entre el miR-214 abajo-expresión y la activación de la UPR en el CHC en células de hepatoma. Para validar el impacto de la UPR en el miR-214 expresión en células de HCC, dos clásicos thapsigargina inductor UPR (TG) y tunicamicina (TM) fue utilizado para inducir la activación de la UPR en las células HepG2. La incubación de células HepG2 con TG (5 mmol /L) y TM (5 mg /ml) marcadamente elevada la GRP94 y el nivel de proteína XBP1 de empalme, lo que indica la activación de UPR. Los resultados en tiempo real RT-PCR mostraron que la expresión de miR-214 fue significativamente las reguladas en las células HepG2 después del tratamiento TG y TM durante 24 h (Figura 5A). A medida que el miR-199a-3p, miR-199a-5p y miR-214 secuencias fueron un clúster, también se encontró que los niveles de miR-199a-3p y miR-199a-5p se redujeron en comparación con un grupo de vehículos (Figura 5A). Además, hemos probado aún más el efecto de la hipoxia inducida por la UPR en el nivel de miR-199a 214 de expresión /. Los niveles de expresión de miR-199a y miR-214 también fueron más bajos en las células de HCC expuestos a la anoxia inducida por CoCl
2 (100 mmol /L) (Figura 5B). Por lo tanto, el miR-199a y miR-214 niveles de expresión se redujeron regulado por la UPR en diversas condiciones fisiológicas y patológicas
.
células HepG2 (A) tratados con tapsigargina (TG, 5 mmol /L) y tunicamicina (TM , 5 mg /ml) durante 24 h fueron analizados por Western Blot para GRP94 y los niveles de expresión XBP1 y analizado por tiempo real de RT-PCR para miR-199a-3p /-5p y miR-214 expresión. Las células HepG2 (B) tratados con CoCl
2 (100 mM) durante 24 h fueron analizados por Western blot para los niveles de expresión de GRP94 y XBP1 y analizados por tiempo real de RT-PCR para miR-199a-3p /-5p y MIR -214 expresión. Columnas, con una media de tres experimentos independientes; bares, SD; * P & lt;.; 0,05 frente al no tratado (HepG2) o tratadas DMSO-
NFkB es un regulador negativo potencial de la miR-199a-2 /miR-214 gen
Como se muestra en Figura S7, miR-199a2 y miR-214 se regulan como un racimo de pri-miR-199a2 dentro de los genes humanos Dnm3os; el próximo examinado la región promotora de miR-199a2 para el factor de transcripción sitios de unión, y se identificaron 3 sitios de unión putativa NFkB potenciales en un fragmento de ADN de 1,2 kb aguas arriba a la pre-miR-199a2 (Figura S8). Así que, si la prueba NFkB participa en la regulación de miR-214 199a2 expresión /. Como se muestra en la Figura 6A, lipopolisacárido (LPS) (10 g /ml), un conocido inductor de la actividad de NFkB, la activación de NFkB inducida e inhibido miR-199a2 /214 expresión en células SMMC-7721. Por el contrario, la transfección de siRNA dirigidos a p65 humana reduce la expresión de NFkB y el aumento de miR-199a2 /nivel 214 en las células SMMC-7721 (Figura 6B). Estos datos indicaron que NFKB es un potencial regulador negativo de la miR-199 bis-2 /miR-214 clúster.
(A) LPS (10 mg /ml) inducida por el tratamiento expresión NFkB p65, atenúa la miR-199a /214 expresión en células SMMC-7721. (B) siRNA dirigidos específicamente a la subunidad P65 de NF-kB humana (100 nM) dereased expresssion NFkB p65 y el aumento de la expresión de miR-199a /214 en las células SMMC-7721. (C) NF-kappa B se activa por el estrés ER y la hipoxia en las células HepG2 analizados por transferencia Western. (D, E) miR-199a /214 expresión en células HepG2 tratadas con inductor de estrés ER (5 mmol /L TG y 100 mM CoCl
2) y los inhibidores de NFkB PDTC (100 m). * P & lt; 0,05 vs sin tratar (HepG2 o SMMC-7721) o DMSO o siRNA con-tratada;#P & lt;. 0,05 frente a TG o CoCl
2 de tratamiento
Además, se encontró que la exposición a la activación de NFkB inducida TG en células HepG2 (Figura 6C), y suprimió el miR-199a2 /214 expresión ( Figura 5A). De acuerdo con estos resultados, el pirrolidinaditiocarbamato inhibidor de NFkB potente (PDTC) (100 M) revirtió significativamente el efecto supresor de la UPR en el miR-199a2 /214 expresión (Figura 6D), poniendo de relieve la importancia de la vía de la UPR /NFkB en el miR-199a2 /214 expresión.
además, también exploró si NFkB es capaz de regular el miR-199a /214 expresión a la anoxia. Los resultados mostraron que 100 mol /L CoCl
2 de tratamiento también indujo NFkB y la disminución de los niveles de miR-199a2 /214 en las células HepG2 de forma simultánea, y la inhibición de NFkB atenúan la reducción de los niveles de miR-199a2 /214 observados después del tratamiento anóxico (Figura 6C y e). Por lo tanto, estos datos sugieren que la UPR mediada la regulación negativa de miR-199a2 /214, aunque la activación de NFkB para participar en la progresión del HCC.
Discusión
MiRNAs son reguladores negativos de la expresión génica y pueden funcionar como supresores de tumores u oncogenes [33]. Se informaron algunos miRNAs específicos que se expresó diferencialmente en el cáncer diferentes, tales como el cúmulo 214 /miR-199a. Aumento del nivel de miR-214 se encontró en el cáncer de ovario [28], cáncer gástrico [34] y melanoma [26], la inducción de resistencia a la quimioterapia o la metástasis tumoral. Pero en el cáncer de cuello de útero [27], [29] y el cáncer de mama [35], el miR-214 expresión se redujo, lo que sugiere una función gen-como supresor de tumores. La posible explicación es que los miRNAs individuales objetivos múltiples objetivos en diferentes células. Varios miR-214 objetivos se han caracterizado en varios tipos de tumores (cáncer de ovario, cáncer cervical y melanoma), incluyendo MEK3, JNK1 [29], PTEN [28], [36], Plexin-B1 [27], Ezh2 [35], [37], y TFAP2C [26] y así sucesivamente. En nuestro estudio, hemos identificado más de XBP-1 como una nueva diana de miR-214 mediante la unión de su extremo 3 'UTR en células de HCC. Por otra parte, se encontró que las expresiones de Ezh2 y plexin-B1 no se correlacionaron negativamente con el miR-214 en muestras de tumores de HCC downregulated-miR-214 (datos no mostrados). Sobre la base de estas observaciones, se asumió que XBP-1, pero no Ezh2 y plexin-B1, es el objetivo "principal" de miR214 en el CHC, en función de los diferentes contextos celular.
Como sabemos, XBP- 1, un importante regulador de la transcripción de la respuesta de proteína no plegada, regula un subconjunto de genes de chaperonas ER residente en la respuesta proteína desplegada para proteger las células de cáncer de un entorno inadecuado, como la hipoxia o privación de glucosa [31], que se encuentran comúnmente por más sólida tumores incluyendo HCC. supervivencia clonogénico de las células tumorales XBP-1-deficiente se redujo significativamente durante severa hipoxia /anoxia in vitro y las células tumorales XBP-1-knockout fueron incapaces de crecer como tumores in vivo [30], lo que sugiere que XBP-1 es esencial para la supervivencia de las células tumorales en condiciones hipóxicas y la formación de tumores sólidos y el crecimiento. Estudios anteriores demostraron que la elevación de la empalme de XBP 1-mRNA, dando como resultado la activación de XBP-1product, así como GRP78 y ATF6, se produjeron en los tejidos HCC con un aumento de la clasificación histológica [38]. Del mismo modo, encontramos que XBP-1 nivel de proteína se incrementó en HCC tejidos humanos downexpressed-miR-214. En conjunto, estos estudios indicaron que las reguladas miR-214 en el cáncer de HCC induce la expresión sobre-de XBP-1, que a su vez acelera la tumorigénesis. Curiosamente, resultado similar de mediada-214 de miR XBP-1 represión también se logró en células Hela. Es consistente con informes recientes de que el miR-214 es el regulado en el cáncer de cuello de útero humano y regula negativamente la proliferación de células Hela [27], [29]. Será interesante ahora para determinar si la sobreexpresión de miR-214 o la modulación de su orientación podría proporcionar una nueva modalidad de tratamiento para el tumor de miR-214-deficientes, tales como HCC, cáncer de mama y cáncer de cuello uterino.
en el otro lado, nuestro estudio mostró que se observó una significativa baja regulación de la 214 cluster /miR-199a en HCC tejidos humanos y líneas celulares de HCC en comparación con el hígado normal, consistente con las observaciones anteriores de perfiles de expresión de miRNAs en HCC [ ,,,0],9], [39], [40], [41], [42]. Pero ¿cuál es el mecanismo de la miR-199a /214 clúster abajo-expresión en HCC? La creciente evidencia ha revelado que durante el estrés ER, el EPU representa un mecanismo de adaptación que soporta la supervivencia y la quimio-resistencia de las células tumorales, y también ha estado emergiendo como un medio para que las células tumorales para aumentar la supervivencia bajo condiciones de estrés metabólico, la hipoxia, y tal vez incluso la quimioterapia [43]. Además, se ha informado de la activación de MEK /ERK y mTOR para jugar un papel crítico en el control de la supervivencia celular o muerte celular de señalización inducidas por el estrés ER [44], [45], [46]. A medida que el factor de transcripción de la UPR se identificó XBP-1 como diana de miR-214 y estudios recientes han puesto de manifiesto las importantes funciones de miR-199a /b-3p en el CHC carcinogénesis y la progresión, la orientación de mTOR y c-Met o PAK4 /Raf /MEK /ERK en células de HCC [5], [21], decidimos investigar más a fondo la correlación entre la activación de la UPR y miR-199a /214 abajo-expresión. Mostrar resultado que el miR-214 y miR-199a-3p /5p fue significativamente las reguladas en las células HepG2 después de los tratamientos de TG y TM o anoxia, lo que sugiere, además, que la UPR activa vía XBP-1 o mTOR y ERK para proteger la supervivencia de las células tumorales a pesar de la supresión de la agrupación de miR-199a2 /214 en el CHC.
Para empezar a desentrañar los mecanismos de regulación de miR-199a2 /214 expresión bajo condiciones UPR en mayor detalle, encontramos además que la UPR activa NFkB con supresión concomitante de miR 199a2 /214 transcripción, y esta supresión se invirtió por PDTC inhibidor de NFkB en las células HepG2, lo que sugiere que NFkB es un regulador negativo potencial de la agrupación de miR-199a-2 /miR-214. NFKB es un importante factor de transcripción que ha surgido como un modulador clave de los programas de genes alterados y fenotipo maligno en el desarrollo de tipos de cáncer [47]. Los primeros estudios indicaron que muchos tipos de cáncer, como el cáncer de mama, cáncer de pulmón y linfoma, y HCC, constitutivamente expresan altos niveles de NFKB [48], [49]. Además, la hipoxia en las células y tejidos HCC indujo la sobreexpresión NFkB y /o la activación constitutiva [50], [51]. Había una red de regulación de NFkB Sp1 //HDAC /miR-29b para controlar la expresión de oncogenes en la leucemia mieloide aguda (LMA) [52]. En nuestro estudio, hemos demostrado que NFkB y XBP-1 se expresan predominantemente pero miR-214 se redujo significativamente en los tejidos HCC humanos, miR-214 se dirige directamente a XBP-1, y la UPR o inducida por NFkB activación hipoxia controla negativamente la miR-199a /214 transcripción clúster en células de HCC. Por lo tanto, un nuevo UPR /NFkB /miR-214 /XBP-1 circuitos de regulación se sugirió en la progresión del HCC, en el que NFkB se activó mediante la UPR y participó en la regulación negativa de miR-199a /214 para regular la progresión del carcinoma hepatocelular (Figura 7) . Este mecanismo regulador explica en parte por qué el tratamiento PDTC inhibe la activación de NFkB, promovido HCC células apoptosis y suprimió el crecimiento del tumor [53], mientras que el tratamiento con LPS indujo la activación de NFkB y promovió la proliferación de células tumorales y el crecimiento metastásico [54], [55], [56], [57]. Ciertamente, se necesitan más evidencias del sitio de enlace NFkB en el promotor de la agrupación 214 /miR-199a en el futuro para apoyar esta hipótesis y más investigaciones son necesarias para dilucidar si el estrés ER también activan otros factores (egSp1) junto involucrados en la regulación a la baja de miR-199a /214 en el CHC. Sin embargo, una mayor comprensión de los mecanismos moleculares y de la red por el cual el miR-199a /214 funciones de racimo puede proporcionar nuevas vías de investigación que podría ayudar al diagnóstico precoz y el tratamiento de este tumor altamente maligno.
El miR-214 /vía XBP-1 se muestra en este trabajo, mientras que el miR-199a-3p /mTOR y miR-199a-5p /DDR1 vías fueron reportados por otros estudios.
en resumen, nuestros resultados revelaron que las ER estrés suprime la expresión del 214 cluster /miR-199a mediante la activación de NFkB regular al alza favor de la supervivencia de expresión de XBP-1, lo que sugiere una novela UPR /NFkB /miR-214 /XBP-1 circuitos de regulación cuya disfunción puede contribuir a la supervivencia del tumor y progresión de HCC. Nuestro estudio ofrece una nueva visión de la actividad supresora de tumores conferida por el miR-199a /214 y los mecanismos potenciales de hepatocarcinogénesis.
Materiales y Métodos
Materiales y Reactivos
Materiales eran obtienen de los proveedores siga: anticuerpos contra XBP-1, ATF6, NFkB, GAPDH y β-actina eran de Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA); antibodie contra GRP94 de Señalización Celular Tecnología (Beverly, MA); aganist anticuerpos p-IRE1 eran de Thermo Scientific Pierce anticuerpos (Rockford, IL); el recuento de células kit-8 se obtuvieron de Beyotime Instituto de Biotecnología (Nantong, China); la proliferación de células Br-dU kit ELISA se obtuvo de Roche (Penzberg, Alemania); pCMV6-XL5-XBP-1 plásmido fue adquirido de Origene (Rockville, MD); control negativo miARN (miR-aire y anti-miR-CON), miR-214 imita y anti-miR-214, agomir-214 y agomir-NC, antagomir-214 y antagomir-NC, siRNA dirigidos NFkB humana /se obtuvieron p65 de RiboBio (Guangzhou, china); Todos los demás productos químicos y reactivos fueron adquiridos de Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich Inc. de China, Shanghai, China) a menos que se especifique lo contrario.
muestras de tumores humanos
Un total de 23 de la normalidad congelaron rápidamente y los tejidos malignos del hígado (14 hombres y 9 mujeres; rango, 50-78 y; edad media, 65,0 años), fueron recolectados en el hospital Tongji (Wuhan, Hubei, china). tejidos normales del hígado humanas se obtuvieron a partir de tejido de hígado normal distal de los pacientes hemangioma hígado. Este estudio fue aprobado por el Comité de Revisión del Hospital de Tongji y Tongji Medical College. Los sujetos reclutados para el estudio siempre y consentimiento informado por escrito. La investigación se ajusta a los principios esbozados en la Declaración de Helsinki. Las muestras de tejido se obtuvieron y se mantuvieron congeladas en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C hasta su uso.
Cultivo de células
línea celular de hepatoma humano HepG2 y línea celular de cáncer cervical humano HeLa se obtiene a partir de la American Type Culture Collection (Manassas, VA), y la línea celular de hepatoma humano SMMC-7721 era del Comité de Type Culture Collection de la Academia china de Ciencias (Shanghai, china), y se mantienen según lo recomendado por la fuente. Las células se cultivaron en DMEM, ajustado para contener 4 mM L-glutamina, 1,5 g /l de bicarbonato de sodio, 4,5 g /l de glucosa, 10% de FBS, 100 unidades /ml de penicilina, y 65units /ml de estreptomicina. Todas las líneas celulares se mantuvieron a 37 ° C en una incubadora humidificada que contiene 5% de CO
2.
transfección de células y tratamientos
HepG2 y células SMMC-7721 fueron transfectadas con los genes miARN /ARNip control negativo (MIR-con y sIR-cON), miR-214 imita o siRNA dirigidos humana NFkB /p65 (RiboBio, Guangzhou, china) utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) siguiendo el protocolo del fabricante. Las secuencias de siRNA para NFkB humana /p65 fueron: 5'-CGC CUA UCC CUU UAC GUC A-3 '[58]. células SMMC-7721 fueron tratados con 100 nM agomir-214 y NC-agomir, antagomir-214 y NC-antagomir y se recogieron 24 horas después del tratamiento para los xenotrasplantes en ratones desnudos Modle y ensayo de incorporación de Br-DU. Células HepG2 fueron tratadas con 5 g /ml de thapsigargin y 5 mmol /L tunicamicina y se recogieron 24 horas después del tratamiento para el Western Blot (WB) y los análisis de la extracción de RNA. condiciones de hipoxia se crearon utilizando 100 mM de CoCl
2 durante 24 horas antes de la recogida de células.
Western blot
Las proteínas de lisados celulares (20 g) fueron separados por SDS al 10% electroforesis en gel de poliacrilamida y se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno. Después de bloquear en 5% de leche sin grasa, manchas de proteínas se incubaron con un anticuerpo específico seguido de incubación con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa en tampón de bloqueo.