Extracto
cáncer de ovario epitelial (EOC) generalmente se descubre después de una extensa metástasis se han desarrollado en la cavidad peritoneal. La superficie de ovario está expuesto a presiones de fluido y las fuerzas de cizallamiento peritoneal debido a los movimientos peristálticos continua del sistema gastro-intestinal, la creación de un micro-entorno mecánico para las células. Un
in vitro
modelo experimental fue desarrollado para exponer las células EOC a tensiones inducidas por el flujo de cizallamiento de fluido estacionario (WSS). Las células fueron cultivadas EOC de la línea celular OVCAR-3 en las membranas amnióticas desnudas en pozos especiales. Wall esfuerzos de cizalla de 0,5, 1,0 y 1,5 dinas /cm
2 se aplicaron sobre la superficie de las células en condiciones que imitan el entorno fisiológico, seguido de manchas fluorescentes de actina y
fibras β
tubulina. La respuesta citoesqueleto a WSS incluye la elongación celular, la formación de fibras de estrés y la generación de los microtúbulos. Más componentes del citoesqueleto fueron producidos por las células y se organizan en una estructura más densa y más organizado dentro del citoplasma. Esto sugiere que WSS puede tener un papel importante en la regulación mecánica de EOC peritoneal difusión
Visto:.-Avraham Chakim L, D Elad, Zaretsky T, Kloog Y, Jaffa A, D Grisaru (2013) Fluid- flujo inducido muro de corte estrés y epitelial de los ovarios cáncer peritoneal Difusión. PLoS ONE 8 (4): e60965. doi: 10.1371 /journal.pone.0060965
Editor: Gil Ast, Universidad de Tel Aviv, Israel
Recibido: 18 de diciembre de 2012; Aceptado: March 5, 2013; Publicado: 10 Abril 2013
Derechos de Autor © 2013 Avraham-Chakim et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue financiado en parte por una subvención de la Asociación de cáncer de Israel. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. Sin financiación externa adicional fue recibida para este estudio
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer de ovario
epitelial (EOC) es el quinta causa principal de muerte por cáncer entre las mujeres, y tiene el índice más alto de mortalidad por caso de todos los tumores malignos ginecológicos. El desarrollo de EOC se inicia en el epitelio de la superficie y es seguida por la proliferación agresiva de las células de EOC en el ovario. Las metástasis de EOC se forman temprano en el proceso de la enfermedad mediante la difusión de las células de EOC principalmente en la cavidad peritoneal. La superficie del ovario está expuesto continuamente a presiones de fluido y las fuerzas de corte peritoneal por los movimientos peristálticos del intestino. Este micro-entorno mecánico planteó la hipótesis de que es un factor importante el control de los patrones de propagación de tumor [1], [2].
se muestran los estímulos mecánicos, tales como tensiones de cizallamiento (WSS) para afectar a muchos procesos celulares tales como la proliferación celular, la remodelación del citoesqueleto, la adhesión y la migración en varios tipos de células, y ampliamente estudiado con las células endoteliales [3]. Los experimentos realizados con células de cáncer cultivadas (por ejemplo, de colon, de ovario, de vejiga, de esófago, de melanoma) revelaron que los estímulos mecánicos como la presión o el flujo de fluido afectan a la adherencia de las células cancerosas [2], [4], [5], [6], [ ,,,0],7], [8], la migración [4], [9], cadherinas e integrinas expresión [10], [11], la capacidad de invasión [11], [12], la morfología [12], [13] y la viabilidad [14 ]. Muchos estudios exploraron el efecto del flujo de sangre en las propiedades de adhesión de las células metastásicas [4] circulante, [5], [7], [10], [11], [12], [13], [14]. Sin embargo, no son ni
in vivo ni
in vitro
estudios sobre los efectos de WSS inducida por el flujo de fluido en las células EOC.
Los mecanismos exactos por los que las células penetran en EOC el ovario y la difusión en el peritoneo aún no han sido totalmente descubierto. Por otra parte, es bien aceptado que el citoesqueleto es la estructura celular más importante que puede distribuir las fuerzas mecánicas en toda la célula para el mantenimiento de la estructura y la integridad celular. De acuerdo con ello, en este estudio hemos explorado los cambios en el citoesqueleto de las células EOC humanos en respuesta a WSS inducida por el flujo de fluido en condiciones que simulan el entorno fisiológico en la cavidad peritoneal.
Materiales y Métodos
hemos desarrollado un
in vitro
modelo de células EOC humanos mediante el cultivo de la línea celular OVCAR-3 en una membrana amniótica denudado (AM) usando pozos especiales que se pueden desmontar con el fin de permitir la instalación de la parte inferior bien con el cultued EOC células en una cámara de flujo de fluido para los experimentos en los que WSS se inducen en la parte superior de las células.
Cell Cultura y
las células fueron cultivadas EOC de la línea celular OVCAR-3 (de Cultivos Tipo Americana Collection (ATCC), Virginia, EE.UU.). Se cultivaron en Roswell Park Memorial Institute (RPMI) -1640 medio suplementado con suero bovino fetal (FBS), solución de bicarbonato de sodio al 5%, tampón Hepes 1 M, solución de glucosa 25%, solución de piruvato de sodio 100 mM, 10.000 U /ml de penicilina G y 10 mg /ml de sulfato de estreptomicina con 1250 U /ml de nistatina, y 4 mg /ml insullin bovina. Las células se cultivaron primero en frascos de plástico, y al llegar a 70-90% de confluencia (por lo general después de 2-3 días) se trataron con tripsina (Tripsina EDTA 0,25%, la solución A).
Para los experimentos de flujo que cultivó la células EOC en la AM denudado, que se recogió a partir de placentas plazo y despojada de la capa de las células epiteliales, como se describe en un estudio anterior [15]. La AM denudada es una membrana extracelular gruesa hecha de un estroma avascular que contiene colágeno y fibronectina. Tiene un gran potencial de adhesión celular, buenas propiedades mecánicas, y por lo tanto, es un sustrato apropiado para el cultivo de células de EOC para la exposición a WSS inducida por el flujo de fluido. El uso de los AM de placentas humanas fue aprobado por el comité ético de Tel Aviv Sourasky Medical Center (# 06/376) y los donantes proporcionó un consentimiento informado por escrito. La AM se instaló en los pozos de diseño personalizado que se pueden desmontar en sub-unidades para la instalación de las células cultivadas en una cámara de flujo de prueba y, a continuación, volver a montar para su posterior incubación o pruebas biológicas [16]. Las células cultivadas en el EOC AM denudada revelaron la misma apariencia cultura de una capa confluente como el cultivo regular en matraces de plástico, como se muestra en la Fig. 1. Después de la capa cultivada de células EOC alcanzó la confluencia en el AM (es decir, dentro de los 5 días), el pozo se desmontó en sub-unidades con el fin de permitir la instalación de la parte inferior bien con las células cultivadas en la cámara de flujo.
(a) En un matraz de plástico, 3 días después de la siembra. (B) En una membrana amniótica en pozos especiales, 4 días después de la siembra (50 K células por pocillo). Contraste de fase microscopio de luz. Ampliación:. X10
in vitro Aplicación de muro de corte estrés en células cultivadas
Una cámara de flujo especial ha sido desarrollada para su aplicación directa de WSS inducida por el flujo de fluido en una monocapa de células cultivadas EOC . La cámara era un conducto rectangular 17 cm de largo con una sección transversal de 28 mm x 1 mm conectadas con una bomba en un circuito cerrado (Fig. 2a). La cámara de flujo se diseñó para contener 3 fondos pocillos con las células cultivadas con el fin de reducir la longitud de un solo experimento y por tener múltiples muestras biológicas para el análisis estadístico con unas pocas repeticiones. La bomba podría generar tasas de flujo estacionario hasta un máximo de 2,52 L /min (ColeParmer, EW-07012-20) con un campo uniforme de fuerzas de cizallamiento en la superficie de las células. El medio de crecimiento de las células se utiliza como el fluido en el sistema. Su viscosidad dinámica se asumió similar a la del agua,
μ
= 0,0007 N⋅s /m
2. El espacio debajo de los así-fondos dentro de la cámara de flujo se llenó con medio de cultivo estático que estaba en contacto con el plano inferior de la AM en el pozo de fondo a lo largo de los experimentos. Los experimentos se llevaron a cabo dentro de la incubadora a las condiciones ambientales del 5% de CO2 y 37 ° C (figura 2b).
La cámara de flujo pueden contener 3 fondos así. (B) la elaboración de los componentes de la cámara de flujo y los fondos así.
Protocolo Experimental
La magnitud de WSS en la cavidad peritoneal se considera muy bajo, pero desconocido. Recientes simulaciones computacionales de los modelos gastrointestinales predijeron los valores de AAS en el rango de 0,14 dinas /cm
2 a 11 dinas /cm
2 [16]. En consecuencia, se aplicó sobre las células cultivadas EOC constante uniforme de WSS 0.5 dinas /cm
2, 1,0 dinas /cm
2 y 1,5 dinas /cm
2 por períodos de 30 minutos. Asumimos el campo de WSS que se debe a un flujo laminar para el que el número de Reynolds & lt; 2,000, y, en consecuencia, calculan la velocidad de flujo en el circuito cerrado utilizando un método descrito antes [17]
Una cantidad similar de. 50.000 células por pocillo de EOC se cultivó en la AM en todos los cultivos utilizados en este estudio. Todos los experimentos se realizaron con células de EOC bien diferenciados que se han cultivado durante 2-5 días. Los cultivos de control para cada uno de los experimentos se sembraron y se incubaron de manera similar a los cultivos estresados, y se definieron como cultivos en condiciones estáticas, mientras que todas las otras condiciones restantes de la misma. Cada experimento se repitió 3 veces con 3 partes inferiores pocillos con células cultivadas de EOC para el análisis estadístico.
tinción de fibras Citoesqueleto
manchas fluorescentes inmunohistoquímica de β-tubulina y actina F se realizaron con el fin para identificar los cambios morfológicos y estructurales en el citoesqueleto de las células. La fijación de las células se realizó mediante la incubación de los fondos así con las células en una solución de paraformaldehído al 4% durante 10 minutos a temperatura ambiente (RT) después de la eliminación del medio. Después, perforación de la membrana celular se realizó mediante la incubación de las células en el bloque burro, una dilución de 5% de suero de burro (Jackson Immunoresearch, Suffolk, Reino Unido) en PBST (PBS con 0,05% de Tween 20), durante 4-5 horas en un balancín ( 60 RPM) a TA.
fibras
beta-tubulina se tiñeron mediante la incubación de las células en una dilución 1:500 de anticuerpo monoclonal de ratón primario anti-β-tubulina, clonar 2,1 (Sigma-Aldrich, Rehovot, Israel) en el bloque burro, durante 1 hora en un (RPM 60) del eje de balancín a temperatura ambiente, y la incubación durante una noche a 4 ° C. A la mañana siguiente, las células se lavaron 3 veces durante 45 minutos con bloque de diluyente (una dilución 1:03 de bloque de burro: PBST) y se incubaron con el anticuerpo secundario - burro rodamina anti-ratón anticuerpo secundario (Jackson Immunoresearch, Suffolk, Reino Unido ) - a una dilución 1:400 en el bloque diluyente. Las células se incubaron con el anticuerpo secundario durante 4 horas, en un eje de balancín a temperatura ambiente, y después se lavaron de nuevo 3 veces durante 45 minutos con bloque de diluyente. las fibras de estrés de actina se tiñeron después de la incubación en 1:1000 dilución de faloidina marcada con FITC (Sigma-Aldrich, Rehovot, Israel) en PBS, durante 20 minutos en un agitador a temperatura ambiente y después se lavaron dos veces con PBS.
después de la finalización de las manchas, las membranas se retiran y se colocan en portaobjetos de vidrio de microscopio. cubreobjetos se montaron en los portaobjetos de vidrio utilizando una sola gota de DAPI + gel de montaje (Santa Cruz Biotechnology, Inc a través de Enco, Petah-Tikva, Israel), que también tiñe el núcleo de la célula. Las células se examinan bajo un SP5 Leica y Zeiss 410 microscopio confocal utilizando un objetivo de aumento del agua X40.
Análisis de alteraciones estructurales del citoesqueleto
Observación de imágenes confocal después de exponer las culturas EOC a WSS reveló celular alargamiento de poligonal y redondeado a elipsoidal. Al igual que en otros estudios [13], que caracteriza la forma elipsoidal de la relación de aspecto, que define la razón entre los diámetros largo y corto de una elipse. El uso de las aplicaciones de imágenes de microscopios confocales medimos estos diámetros que eran perpendiculares entre sí en las imágenes de células (Fig. 3). La relación de aspecto se calculó para la estimación del nivel de la elongación celular con 1,0 representa un círculo.
Estimación de los microtúbulos y la formación de fibras de estrés hecho por la observación. Se definieron tres niveles de formación de fibras de estrés o los microtúbulos, de acuerdo con su aparición en las imágenes adquiridas (Fig. 4): "Low Level" indica que la actina o β-tubulina se tiñeron prominente en el anillo cortical de la célula y casi nada en el centro de la celda (Figs. 4AA, 4Ba). "Nivel Intermedio" indica que en su mayoría salientes, microspikes y fragmentos de actina o β-tubulina eran visibles (Fig. 4AB, 4BB). "Alto Nivel" indica que la mayor parte de la zona central de la celda contenía fibras de estrés o los microtúbulos, casi sin fragmentos de fibras y poca tinción en las zonas periféricas de la célula (Fig. 4ac, 4BC)
.
(a) bajo nivel, sobre todo actina cortical y casi sin fibras de estrés, (b) nivel intermedio, se forman algunas fibras, sobre todo en las protuberancias celulares, y (c) de alto nivel, la mayor parte de la zona central de la celda es abundante con las fibras de estrés. (B) Tres niveles diferentes de formación de microtúbulos: (a) el nivel bajo, en su mayoría fragmentos de β-tubulina y casi sin microtúbulos citoplasmáticos, (b) Nivel intermedio, algunos microtúbulos se forman dentro de la célula, y (c) de alto nivel, una densa la red de microtúbulos se genera en el interior de las células.
análisis estadístico
una vía y de dos vías de análisis de varianza (ANOVA, SPSS 11.5.1) seguido de una prueba de Tukey fueron utilizada para realizar comparaciones múltiples entre los resultados obtenidos después de la exposición de las células EOC a diferentes tensiones de cizallamiento. Para los resultados de la formación de fibras de estrés y los microtúbulos se llevó a cabo una prueba de chi-cuadrado y se puso a prueba la importancia de una asociación lineal por lineal.
Resultados
El presente estudio demuestra que los cambios morfológicos de las fibras del citoesqueleto de las células cultivadas en el EOC AM despojado después de la exposición a WSS flujo de fluido. Las imágenes confocales mostraron transformación de las células en su forma con formas poligonales y redondeadas para formas elipsoidales después de la exposición 30 min a WSS (Fig. 5A). Los diámetros largos y cortos de 541 células (es decir, cm
2, respectivamente, 136, 64, 223 y 118 células de TC de 0.0 (control), 0,5, 1,0 y 1,5 dinas /) fueron medidos y sus relaciones de aspecto correspondientes fueron calculado. La relación media de aspecto se ha incrementado en 12,4%, 19,2% y 27,8% en comparación con la del control comparación de las células expuestas a WSS de 0,5, 1,0 y 1,5 dinas /cm
2, respectivamente. Para el análisis estadístico se utilizó el logaritmo de estos valores numéricos, lo que permite analizar los resultados con una distribución normal (Fig. 5B). La relación de aspecto aumentó significativamente con respecto al grupo de control como WSS incrementó (p & lt; 0,001). Existe una diferencia significativa, así entre el 0,5 dinas /cm
2 y los 1,5 dinas /cm
2 grupos, y entre el 1,0 dinas /cm
2 y 1,5 dinas /cm
2 grupos ( p & lt; 0,05). Sin embargo, no existe una diferencia significativa entre el 0,5 dinas /cm
2 y el 1 dina /cm
2 grupos en sí.
Las flechas apuntan en la representación de las células. (A) Control de la cultura, (b) 0,5 dinas /cm
2 de cultivo, (c) 1,0 dinas /cm
2 la cultura, y (d) 1,5 dinas /cm
2 cultivos. (B) Variación del valor logarítmico de la relación de aspecto que definen el nivel de la elongación celular con el nivel de la tensión de cizallamiento aplicada (± desviación estándar).
formación de una red filamentosa de espesor de estrés fibras se observó en las células expuestas a esfuerzo de cizallamiento, en comparación con los cultivos de control en el que la actina estaba presente principalmente en las áreas periféricas de la célula. Se observó la formación de fibras de estrés en células 640; 235, 78, 142 y 185 células para WSS de 0,0 (control), 0,5, 1,0 y 1,5 dinas /cm
2, respectivamente. Imágenes representativas de tinción de actina en cultivos de células de EOC que han sido expuestas a la diferente WSS durante 30 minutos en comparación con cultivos estáticos se presentan en la Fig. 6A. Más estrés fibras se formaron en el interior del citoplasma de células como el WSS se incrementó (Fig. 6B). En general, el porcentaje de células que muestran un nivel bajo de formación de fibras de estrés se redujo en comparación con el grupo de control como WSS aumentó (es decir, de 80% en el grupo estática en comparación con 28,1% en el 1,5 dinas /cm
2 grupo) . El porcentaje de células con un nivel intermedio de la formación de fibras de estrés aumentó en comparación con el grupo de control como WSS aumentó (es decir, de 18,3% en el grupo estático a 49,2% en el 1,5 dinas /cm
2 grupo). El porcentaje de células con un alto nivel de formación de fibras de estrés generalmente aumenta en los grupos de estrés en comparación con el grupo de control (es decir, de 1,7% en el grupo estático a 22,7% en el 1,5 dinas /cm
2 grupo). prueba de Chi-cuadrado mostró que lineal por lineal asociación de estos resultados fue estadísticamente significativa (p & lt; 0,001), lo que significa que había una relación lineal entre la magnitud de WSS y el nivel de formación de fibras de estrés y que el nivel de las fibras de estrés formación dependía de la magnitud de la tensión de cizallamiento.
(a) cultivo de control (sin WSS), (b) las células expuestas a WSS de 0,5 dinas /cm
2, (c) las células expuestas a WSS de 1.0 (d) las células expuestas a WSS de 1,5 dinas dinas /cm
2, y /cm
2. (B) El porcentaje de células en cada uno de tres niveles de la formación de fibras de estrés, para diferentes niveles de tensión de corte. (C) La relación de aspecto media logarítmica de la elongación celular para todos los niveles de formación de fibras de estrés (± 2 · error estándar).
También exploramos la relación entre la formación de fibras de estrés y elongación celular. Para este análisis estadístico, las largas y cortas diámetros de 221 células (es decir, 110, 13, 62 y 36 células para WSS de 0,0 (control), 0,5, 1,0 y 1,5 dinas /cm
2, respectivamente, se midieron y se sus relaciones de aspecto correspondientes se calcularon para todos los niveles de formación de fibras de estrés, haciendo caso omiso de la tensión de corte (Fig. 6C). se encontró una diferencia significativa entre la relación de aspecto del grupo de bajo nivel de formación de fibras de estrés (denotado "a") y la grupos intermedios y de alto nivel de la formación de fibras de estrés (denotado "b"), a & lt; b (p & lt; 0,05). al considerar el esfuerzo cortante, así, la interacción entre la formación de fibras de estrés y el esfuerzo cortante (en relación a su efecto sobre la relación de aspecto) no se encontró estadísticamente significativa (p & gt;.. 0.05) Este resultado sugiere que el efecto de la formación de fibras de estrés en las relaciones de aspecto de las células alargadas era independiente del nivel de tensión de cizallamiento
a denso y red organizada de los microtúbulos del citoesqueleto se genera después de exponer las células a esfuerzo de cizallamiento, en comparación con los fragmentos de tubulina y tinción lateral en los cultivos control. Se observó la formación de microtúbulos en células 494; 156, 33, 111 y 194 células para WSS de 0,0 (control), 0,5, 1,0 y 1,5 dinas /cm
2, respectivamente. Imágenes representativas de los microtúbulos mancha en cultivos de células de EOC que han sido expuestas a la diferente WSS durante 30 minutos en comparación con cultivos estáticos se representan en la Fig. 7A. Es evidente que se formaron más los microtúbulos en el citoplasma de las células como el WSS aumentó (Fig. 7B). En general, el porcentaje de células que muestran un nivel bajo de formación de microtúbulos se redujo en comparación con el grupo de control como WSS aumentó (es decir, de 84% en cultivos estáticos a 20,6% en el 1,5 dinas /cm
2 grupo). No hubo un comportamiento coherente para el nivel intermedio, como el porcentaje de células que demuestran un nivel intermedio de la formación de microtúbulos inicialmente aumentó entre la estática y 0,5 dinas /cm
2 grupos (es decir, 16% y 63,6%, respectivamente), y fue entonces ligeramente disminuido en el 1,0 y 1,5 dinas /cm
2 grupos (es decir, 55% y 54,6%, respectivamente). El porcentaje de células que muestran un alto nivel de formación de los microtúbulos aumentó de 0% en el dinas estática y 0,5 /cm
2 grupos a casi el 10% en el 1,0 dinas /cm
2 grupos y más del 24% en el 1,5 dinas /cm
2 grupos. prueba de Chi-cuadrado estableció que asociación lineal por lineal para estos resultados es estadísticamente significativa (p & lt; 0,001), lo que significa que existe una relación lineal entre la magnitud de la tensión de cizallamiento y el nivel de la formación de microtúbulos y que el nivel de la formación de microtúbulos depende de la magnitud de la tensión de cizallamiento
.
(a) cultivo de control (sin WSS), (b) las células expuestas a WSS de 0,5 dinas /cm
2, (c) las células expuestas a WSS de 1,0 dinas /cm
2, y células (d) expuesta a WSS de 1,5 dinas /cm
2. (B) el porcentaje de células en cada uno de tres niveles de la formación de los microtúbulos, para diferentes niveles de tensión de corte. (C) La relación de aspecto media logarítmica de la elongación celular para todos los niveles de formación de los microtúbulos (± 2 · error estándar).
Se evaluó también la conexión entre la formación de microtúbulos y la elongación celular. Para este análisis, los diámetros largo y corto de 191 células (es decir, 82, 8, 58 y 43 células para WSS de 0,0 (control), 0,5, 1,0 y 1,5 dinas /cm
2, respectivamente, se midieron y su correspondientes relaciones de aspecto se calcularon para todos los niveles de formación de los microtúbulos, haciendo caso omiso de la tensión de corte (Fig. 7C). se encontró una diferencia significativa entre las relaciones de aspecto del grupo de bajo nivel de formación de los microtúbulos (denotado "a") y el intermedio y alto grupos de nivel de formación de los microtúbulos (denotado "B"), a & lt; b (p & lt; 0,05). al considerar el esfuerzo cortante, así, se encontró que la interacción entre la tensión de cizallamiento y la formación de los microtúbulos (en relación con sus efectos sobre la relación de aspecto) estadísticamente significativa (p & lt; 0,05). la implicación era que el efecto de la formación de los microtúbulos en las relaciones de aspecto de las células alargadas dependía del nivel de tensión de cizallamiento
Discusión
el cáncer de ovario es el. causa más común de muerte entre los tumores malignos ginecológicos y generalmente se diagnostica en una etapa avanzada [18]. Las células EOC superficie están expuestos a presiones de fluido y las fuerzas de cizallamiento peritoneal debido a los movimientos peristálticos del sistema gastro intestinal, creando un ambiente micro mecánico para las células [2], [19]. estímulos mecánicos como WSS han sido demostrado que afectan a muchos procesos celulares en diversos tipos de células [3]. El presente trabajo se investigaron los efectos de la TC en la remodelación del citoesqueleto de las células cultivadas EOC. Con este fin, hemos desarrollado un nuevo modelo de EOC cultivadas en la AM denudada, que es una membrana de colágeno de fácil acceso y más de cerca simula el
in vivo