Extracto
vascular factor de crecimiento endotelial (VEGF) es un importante regulador de la angiogénesis. La expresión de VEGF es regulada hasta en respuesta a las señales de micro-ambientales relacionados con la falta de riego sanguíneo, como la hipoxia. Sin embargo, la regulación de la expresión del VEGF en células de cáncer no se limita a la respuesta al estrés debido al aumento de volumen de la masa tumoral. mediadores de lípidos, en particular ácido araquidónico derivado de la prostaglandina (PG) E
2 son reguladores de la expresión de VEGF y la angiogénesis en el cáncer de colon. Además, el aumento de la osmolaridad que se genera durante la consolidación de absorción de agua y las heces del colon parece activar las células de cáncer de colon y promover PGE
2 generación. Tal estimulación fisiológica puede proporcionar señalización para la promoción del cáncer. Aquí se investigó el efecto de la exposición a un medio hipertónico, para emular entorno del colon, en la producción de VEGF por las células de cáncer de colon. El papel de los PGE
2 generación y MAPK activación concomitante fue dirigida por la inhibición farmacológica específica. línea celular de cáncer de colon humano Caco-2 se expone a un entorno hipertónico respondió con marcada VEGF y PGE
2 producción. la producción de VEGF se inhibió por inhibidores selectivos de la ERK 1/2 y vías p38 MAPK. Para abordar el papel regulador de PGE
2 en la producción de VEGF, Caco-2 células fueron tratadas con la cPLA
2 (ATK) y la COX-2 (NS-398) inhibidores, que bloquean completamente PGE
2 generación . Las células Caco-2 también se trataron con una PGE
2 antagonista del receptor no selectivo. Cada tratamiento aumentó significativamente la producción de VEGF inducida por el estrés hipertónica. Por otra parte, la adición de PGE
2 o EP selectiva
2 agonista de los receptores de células Caco-2 activados inhibieron la producción de VEGF. El papel inhibidor autocrino para PGE
2 parece ser selectiva con el medio ambiente hipertónico ya que la producción de VEGF inducida por la exposición a CoCl
2 fue disminuida por la inhibición de PGE concomitante
2 generación. Nuestros resultados indican que la hipertonicidad estimula la producción de VEGF en líneas celulares de cáncer de colon. También PGE
2 juega un papel inhibitorio sobre la producción de VEGF por las células Caco-2 expuestas a estrés hyperosmotic través EP
2 activación
Visto:. Gentil LB, Piva B, BL Díaz (2011) hipertónica El estrés induce la producción de VEGF en la línea celular de cáncer de colon humano Caco-2: papel inhibidor de PGE autocrina
2. PLoS ONE 6 (9): e25193. doi: 10.1371 /journal.pone.0025193
Editor: C. B. Ben Ko, Universidad China de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 17 de diciembre de 2010; Aceptado: 30 Agosto 2011; Publicado: 28 Septiembre 2011
Derechos de Autor © 2011 gentil et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de Consejo Nacional de Desarrollo Científico y do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ, Brasil) (BLD) y un Ministerio de Salud (Brasil) Doctor Tecnológico (CNPq, Brasil) y la Fundación Carlos Chagas Filho de Amparo a la Pesquisa comunión (a LBG). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de vasculatura preexistente es un proceso fundamental en el desarrollo de la mayoría de los tumores especialmente los sólidos. Este proceso se llama angiogénesis y está regulada por el equilibrio de señales bioquímicas negativos y positivos. Los vasos sanguíneos recién formados son responsables de suministrar oxígeno y nutrientes para el crecimiento de la masa tumoral y una ruta para la diseminación de las células cancerosas metastásicas. VEGF es el regulador positivo más prominente de la angiogénesis debido a su capacidad para reclutar células endoteliales a los sitios de hipoxia y estimular la proliferación de este tipo celular, la promoción de la diferenciación de las estructuras vasculares [1]. La expresión del VEGF se correlaciona positivamente con el resultado negativo en pacientes con cáncer. En el cáncer de colon, la expresión de VEGF se correlaciona con el aumento de potencial metastásico [2], mientras que la expresión de su receptor es un marcador de la supervivencia postoperatoria más corta [3].
expresión de VEGF es de hasta regulado en respuesta a las micro señales ambientales relacionados con la falta de riego sanguíneo, como la hipoxia [4], la acidosis [5] y los bajos niveles de nutrientes [6]. En los tumores, disminución de los niveles de O
2 conduce a la estabilización de HIF-1α, una subunidad de la HIF-1, y la activación transcripcional posterior de los genes que presentan un elemento sensible a la hipoxia (HRE) en sus promotores, tales como VEGF factor de transcripción . Sin embargo, la regulación de la expresión del VEGF en células de cáncer no se limita a la respuesta al estrés debido al aumento del volumen de la masa tumoral. Varios otros factores se han demostrado inducir VEGF tales como las especies reactivas de oxígeno [7] - [9], factores de crecimiento [10], [11], citoquinas [12], y mediadores lipídicos [13] - [16]. ácido derivado de prostaglandina (PG) E araquidónico
2 es un importante regulador de la expresión de VEGF y la angiogénesis en varios tipos diferentes de cáncer y el cáncer de colon en particular. Exógena PGE
2 induce HIF-1α estabilización [13] y la expresión de VEGF [17] en líneas celulares de cáncer de colon. VEGF y COX-2 expresión y la angiogénesis tumoral se correlacionan positivamente en muestras de cáncer de colon [18] - [20]
Sin embargo, la hipoxia no es el único estímulo de estrés externo que activa las respuestas celulares en el cáncer de colon.. El contenido continuamente cambiantes de luz intestinal exponen las células epiteliales normales y cancerosas a una miríada de estímulos. Tal estimulación fisiológica puede proporcionar señalización para la promoción del cáncer. De hecho, el aumento de la osmolaridad que se genera durante el proceso de absorción de agua del colon y consolidación heces [21] - [23] parece activar las células de cáncer de colon y promover la expresión COX-2 y PGE
2 generación, pero no se activará normal del intestino las células [24]. Nuestro objetivo en este estudio fue determinar el efecto del estrés hipertónica en la producción de VEGF por las células Caco-2 línea celular de cáncer de colon. El papel potencial de autocrina PGE
2 y MAPK vías en la modulación de la generación de VEGF señalización también fue analizado.
Métodos
Reactivos
El cloruro de sodio (NaCl) se obtenida de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) y se disolvió en agua estéril para una solución madre a una concentración 2 M. IPLA
2 inhibidor, bromoenol lactona (BEL), el la cPLA
2 /iPLA
2 inhibidor, araquidonil trifluorometil cetona (ATK), y la prostaglandina E
2 fueron adquiridos de Cayman Chemical Co. ( Ann Arbor, MI) y se diluyó en etanol de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los inhibidores de COX-2, NS-398 (Cayman); p38, SB202190; JNK, SP600125; MEK1 /2, U0126 (todos de BIOMOL, Plymouth Meeting, PA) se diluyeron en DMSO (Sigma). Los anticuerpos monoclonales para ensayos de inmunoblot fueron anti-COX-2 IgG de ratón (clon 33) BD Transducción Laboratories y anti-GAPDH (clon 6C5) IgG de ratón de Santa Cruz de Biotecnología (Santa Cruz, CA), diluido a 0,003 g /ml. Se utilizó la cabra HRP-anticuerpo secundario ligado IgG anti-ratón de Santa Cruz Biotechnology a 0,1 mg /ml
cultura. células y tratamientos
Caco-2 (ATCC HTB-37, don de El Dr. José Morgado Díaz, del Instituto Nacional de Cáncer, Brasil) línea celular se mantuvo en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS), bicarbonato sódico 44 mM
3, 1 mM NaH
2 PO
4.H
2O, piruvato de sodio 1 mM, HEPES 10 mM, MEM solución vitaminas, MEM solución aminoácidos esenciales y no esenciales, 2 mM L-glutamina, 55 mM β-mercaptoetanol, 100 U /ml de penicilina, y 100 mg /ml de estreptomicina (todos los reactivos de cultivo de células de Invitrogen). IEC-6 línea celular (Cell Rio de Janeiro Bank, Brasil) se mantuvo en DMEM suplementado con 5% de FBS y 100 U /ml de penicilina, y 100 mg /ml de estreptomicina. Las células se mantuvieron en frascos de cultivo (área de superficie de crecimiento de células 25, 75 y 150 cm
2). Las células se recogieron en un 0,25% de tripsina y 0,38 g /l de EDTA en HBSS sin Ca
++ y Mg
++ y 5 × 10
5 células /pocillo se sembraron en placas de 6 pocillos de fondo plano (área de 9,03 cm
2 /pocillo, Techno Plastic Products, Suiza). 1,9 ml de medio de cultivo DMEM suplementado fresco se añadió a los pocillos de cultivo con o sin inhibidores farmacológicos y las células se incubaron durante 15 min (30 min para los inhibidores de MAP quinasas) a 37 ° C. Todas las células recibieron la misma cantidad de vehículo, por lo tanto, la concentración final fue por debajo de 0,1% de DMSO o etanol y no modificó la activación celular. Las células se estimularon con la adición de 0 a 100 l de solución 2 M de NaCl. DMEM se añadió al pozo para completar el volumen final de 2 ml. osmolaridad final del medio después de la adición de NaCl 100 mM fue de aproximadamente 540 mOsm, en comparación con 367 mOsm de medio isotónico. osmolaridad El medio se determina empíricamente mediante la congelación método usando un osmómetro (Advanced Instruments Inc., Norwood, MA). Para minimizar la variación en los experimentos cinéticos el tiempo total en la cultura después de la siembra fue el mismo para cada punto de tiempo analizado.
Determinación de PGE
2 y VEGF en sobrenadantes
Los PGE
2 de producción por la línea celular Caco-2 se determinó mediante EIA en sobrenadante de cultivo de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Cayman) y como se ha descrito antes [25]. Brevemente, el medio de cultivo se recogió 24 h después de la activación celular por el estrés hipertónica y se centrifugó a 250 xg durante 5 min para eliminar las células flotantes y se congeló a -70 ° C. PGE
2 niveles se analizaron utilizando un anticuerpo monoclonal PGE
2 Kit de EIA. Después de la placa de desarrollo se leyó a 405 nm en un lector de placas (Spectra Max 190, Molecular Devices, Sunnyvale, CA). La producción de VEGF por la línea celular Caco-2 se determinó mediante ELISA en el sobrenadante de cultivo de acuerdo a las instrucciones del fabricante (R & amp; D Systems, UK). Brevemente, el medio de cultivo se recogió 24 h después de la activación celular por el estrés hipertónica y se centrifugó a 250 xg durante 5 min para eliminar las células flotantes y se congeló a -70 ° C. los niveles de VEGF se analizaron utilizando un VEGF humano DuoSet (R & amp; D Systems, UK). Después de placa de desarrollo se leyó a 450 nm en un lector de placas (Spectra Max 190, Molecular Devices, Sunnyvale, CA).
El análisis por inmunotransferencia
Las células se recogieron con un raspador celular (Costar) y se añadieron 100 l de SDS al 10% por pocillo de la placa de cultivo celular de 6 pocillos. 100 l de 2 x tampón de carga (1,4 M β-mercaptoetanol, la base de 184 mM Tris, 80 mM de bromofenol azul, 3% de glicerol, 8% de SDS, pH 6,8) se añadió al lisado celular. Los lisados celulares se calentaron inmediatamente a 100 ° C durante 5 minutos antes de la sonicación a 30% de la amplitud y 30 J de energía en un procesador de alta intensidad ultra-sónico. Las muestras fueron resueltas por electroforesis en un SDS-PAGE en gel de poliacrilamida 10% a 29 mA /gel durante 1 h. Las proteínas separadas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Santa Cruz) y se bloquearon en leche seca no grasa 5% en 1 x TBS (Tris 10 mM; NaCl 150 mM pH 7,4) durante 12 h para la COX-2 etiquetado, o para 2 h para todos los otros anticuerpos a temperatura ambiente. Después del lavado, las membranas se incubaron con anticuerpos primarios diluidos en TTBS (TBS con 0,2% de Tween 20) y azida de sodio al 0,05% durante 2 horas a temperatura ambiente para la COX-2 o 12 horas a 4 ° C para otros anticuerpos. Tras el marcaje secundario con enlaces HRP-anticuerpos anti-IgG, las proteínas se analizó utilizando el sistema ECL Western Blot Analysis (Amersham Biosciences).
El análisis estadístico
Los datos se expresan como media ± error estándar de la media (SEM) de los experimentos realizados por triplicado. Los gráficos y las transferencias de Western mostrados son representativos de al menos tres experimentos independientes. Múltiples comparaciones entre grupos se realizaron mediante ANOVA de una vía seguido por la prueba de Dunnett de Bonferroni o de (Prism versión 4.03, GraphPad Software, Inc. La Jolla, CA). Los símbolos
+ y * representan
p
valores. & Lt; 0,05 grupo en comparación con el grupo control no estimulado o estrés hipertónica /CoCl estimuló-2
respectivamente
Resultados
hipertónica estrés induce la producción de VEGF por las células Caco-2 y PGE
2 modula la producción del factor angiogénico en este estrés ambiental
hipertónica estrés estimula la producción de VEGF por las células Caco-2 después de 24 horas de la activación ( Figura 1A) siguiendo el mismo respuesta a la dosis y curso del tiempo (datos no mostrados) de PGE
2 generación en las mismas condiciones de estimulación [24]. Como PGE
2 se ha descrito para jugar un papel en la angiogénesis y la producción de VEGF se determinó si PGE
2 se regula la producción de VEGF por las células Caco-2 durante la estimulación con medio hipertónico. Inhibición de PGE
2 por tratamiento con la cPLA
2 (ATK) (Figura 1B) o la COX-2 (NS-398) inhibidores (Figura 1C) aumentó la producción de VEGF. Este fenómeno fue revertido por la adición de PGE
2 al medio de cultivo celular (Figura 1D) que indica un papel específico para PGE
2.
células Caco-2 (A) se estimularon con 10 -100 mM de NaCl durante 24 h antes del análisis la producción de VEGF. la producción de VEGF se determinó por ELISA en sobrenadantes de células Caco-2 estimuladas con el estrés hipertónica (NaCl 100 mM) durante 24 h después del tratamiento previo con inhibidores de la cPLA
2, ATK (B); COX-2, NS-398 (C) o PGE
2 (D). células HCT116 se estimularon con 100 mM de NaCl durante 24 h tras el pretratamiento con inhibidores de la cPLA
2, ATK (E); COX-2, NS-398 (F). +, *
p & lt; 0,05
, a las células no estimuladas o células estimuladas, respectivamente. **
p & lt; 0,05
, en comparación con las células tratadas con NS-398. las barras del gráfico muestran las medias ± SEM de las muestras por triplicado.
Para verificar si la inhibición de la producción de VEGF por las células Caco-2 estimulada con el estrés hipertónica fue una consecuencia de PGE
2 acción y no una consecuencia de la acción nonespecific de medicamentos farmacológicos utilizados en los experimentos, se realizó el mismo experimento en HCT116, una línea celular de cáncer de colon que no expresa COX-2 y no produce niveles detectables de PGE
2 bajo estrés hipertónica. No se observó ningún cambio en la producción de VEGF, excluyendo la posibilidad de interferencia de los inhibidores farmacológicos (Figuras 1E y F). Estos resultados mostraron que PGE
2 producido por las células Caco-2 activado por el estrés hipertónica tiene una acción inhibidora sobre la producción autocrina VEGF.
EP
2 receptor desempeña un papel en la regulación de la producción de VEGF a través de PGE
2 en células Caco-2 estimulada con el estrés hipertónica
Para determinar cuál es el mecanismo de acción de PGE
2 en la regulación de la producción de VEGF en el estrés hipertónica, células Caco-2 se activaron con hipertónica medio durante 24 horas y se trató con AH6809, un antagonista del receptor EP. Verificamos la inhibición de la señalización del receptor EP causó un aumento de la producción de VEGF (Figura 2A). A continuación, para identificar qué receptor específico está involucrado en este fenómeno Caco-2 se estimularon con medio hipertónico y se trató con ATK y receptores EP agonistas. El la cPLA
2 inhibidor (ATK) elimina la interferencia de PGE
2 producida por las células de cáncer de colon y receptores EP fueron activados por agonistas única forma exógena añadido. De acuerdo con ello, la figura 2B muestra que el tratamiento con ATK aumenta la producción de VEGF y cuando PGE
2 o 16,16-dimetil PGE
2, un agonista de receptor EP pan, se añadieron al medio de este efecto se invirtió, reforzando que EP la activación del receptor tiene un efecto inhibidor sobre la producción de VEGF. Aumento de la producción de VEGF mediante la inhibición de PGE endógena
2 también fue revertida por butaprost, un agonista del receptor EP2 específico (Figura 2B). Activación con EP1, 17-fenil-trino-PGE
2, o EP3, sulprostona, agonistas no tuvo efecto sobre el aumento de la producción de VEGF. Dado que la expresión de EP4 parece estar ausente en células Caco-2 [26], nuestros resultados indican que endógena de PGE
2 modula la producción de VEGF inducida por el estrés hipertónica través de la activación de EP2.
(A) Caco-2 las células fueron estimuladas por el estrés hipertónica (NaCl 100 mM) durante 24 h después de la pre-tratamiento con EP y DP antagonista de los receptores, AH 6809 (A); con el inhibidor de la cPLA
2, ATK (10 mM); PGE
2; receptores EP agonista, 16,16-dimetil prostaglandina E
2; EP1 y EP3 agonista de receptores, 17-fenil trinor prostaglandina E
2; EP2 receptor agonista, butaprost y agonista de los receptores EP3, sulprostona (B); o con un inhibidor de PKA, H-89. PGE
2 y sus análogos se utilizaron a 0,1 M. la producción de VEGF se determinó por ELISA en sobrenadantes de células Caco-2. +, *
p & lt; 0,05
, en comparación con las células no estimuladas o células estimuladas, respectivamente. **
p & lt; 0,05
, en comparación con las células tratadas con ATK. las barras del gráfico muestran las medias ± SEM de las muestras por triplicado.
EP2 es un receptor de tipo rodopsina acoplado a Gs y media aumenta en el campo [27]. Por lo tanto hemos probado si la PKA jugó un papel en PGE
2 efectos mediados a través EP2 durante el estrés hipertónica. La inhibición de la PKA por H-89 aumentó la producción de VEGF por las células Caco-2 expuestas a medio hipertónico (Figura 2C). Reforzar el potencial vía inhibitoria que implica PGE
2-EP2-AMPc-PKA.
Papel de la endocrina PGE
2 en CoCl
2 inducida por la producción de VEGF
También comprobado si PGE
2 tenían un papel en la regulación de la producción de VEGF en condiciones simulatory estándar. Para activar la vía del factor inducido por hipoxia (HIF) y simular la hipoxia, las células Caco-2 se activaron con CoCl
2. Después de 24 horas de estimulación con CoCl
2, Caco-2 presentó marcada producción de PGE
2 (Figura 3A) y el aumento de expresión de la COX-2 (Figura 3B). Otros experimentos se realizaron después de additon de 1 mM de CoCl
2 para el medio después de 24 horas de activación. Por otra parte, CoCl
2 estimulada por PGE
2 generación es dependiente de COX-2, ya que estaba completamente inhibida por NS-398 (Figura 3C).
Caco-2 células fueron estimuladas con 0.1- 1 mM de CoCl
2 durante 24 h antes de PGE
2 y la producción de VEGF (A y D, respectivamente) y el análisis de COX-2 expresión de la proteína (B). PGE
2 y VEGF producción por células Caco-2 estimulada con 1 mM de CoCl
2 durante 24 h tras el pretratamiento con el inhibidor de la COX-2, NS-398 (C y E, respectivamente). la producción de VEGF por células Caco-2 estimulada con 0,1 a 1 mM de CoCl
2 durante 24 h (D). PGE
producción 2 y VEGF se determinó por ELISA en sobrenadantes de células Caco-2. la expresión de la COX-2 y GAPDH en sedimentos de células se analizó por transferencia Western. +, *
p & lt; 0,05
, en comparación con las células no estimuladas o células estimuladas, respectivamente. las barras del gráfico muestran las medias ± SEM de las muestras por triplicado.
Al igual que en la estimulación del estrés hipertónica, de células activadas-2 CoCl
también producido VEGF (Figura 3D). Sin embargo, autocrina PGE
2 parece tener un efecto contrario en esta condición ya que la producción de tratamiento NS-398 inhibe el VEGF (Figura 3E). Esos resultados indican que los PGE
2 tiene un papel autocrino estimulante sobre la producción de VEGF en CoCl
2 de activación.
Papel de las MAPK en la producción de VEGF por células Caco-2
Para determinar si la producción de VEGF se regula diferencialmente en las células Caco-2 más allá de la posible función autocrina de PGE
2, giramos a la identificación de las vías de MAPK involucrados. Puesto que hemos mostrado antes de un papel para ERK 1/2, JNK y p38 en PGE
2 generación [24] y para evitar el problema potencial que esto puede representar para interpretar los resultados, los experimentos se realizaron en presencia de 1 M de NS-398. La inhibición farmacológica de ERK 1/2 y p38 indicó un papel común en la activación ya sea por estrés hipertónica o CoCl
2 (Figuras 4A y B). papel de JNK fue más restringida, como SP 600125 producción de VEGF inhibió notablemente inducida por CoCl
2 de activación, mientras que no afectó la producción de VEGF inducida por el estrés hipertónica (Figuras 4A y B).
Los inhibidores de la JNK, SP600125 ; p38, SB202190; y MEK 1/2, U0126 se añadieron antes de la estimulación con el estrés hipertónica (NaCl 100 mM) (A) o CoCl mM 1
2 (B) durante 24 h. Caco-2 células fueron pretratadas con 1 M de NS-398 para evitar la producción de PGE endógena
2 en todas las muestras. la producción de VEGF se determinó por ELISA en sobrenadantes de células Caco-2. +, *
p & lt; 0,05
, en comparación con las células no estimuladas o células estimuladas, respectivamente. las barras del gráfico muestran las medias ± SEM de las muestras por triplicado.
Discusión
El papel de PGE
2 en el desarrollo del cáncer generalmente se describe como un factor autocrino capaz de modular muchos aspectos de la la biología de las células del cáncer, en particular los de origen epitelial [28], [29]. PGE
2 se ha demostrado que aumenta la proliferación, la capacidad metastásica y la producción de factores pro-angiogénicos [17], [30], [31]. Sin embargo, esos estudios generalmente carecen de información sobre los estímulos que impulsará la cascada del ácido araquidónico y en última instancia PGE
2 generación más allá de la expresión inducida de COX-2. Recientemente hemos demostrado que un medio hyperosmotic puede inducir la expresión de COX-2 y PGE
2 en la generación de células Caco-2 cáncer de colon [24]. Lo más importante, hiperosmolaridad puede desencadenar la etapa limitante en PGE
2 generación mediante la activación de la cPLA
2-α y la inducción de la liberación de ácido araquidónico libre. células epiteliales intestinales normales no mostraron producción de PGE
2 bajo el mismo estímulo hyperosmotic. Después de haber identificado un estímulo fisiológico relevante para las células del cáncer de colon, se investigó el efecto del medio hipertónico en la producción de los principales factores pro-angiogénicos, VEGF, y la influencia potencial autocrina de PGE
2.
Exposición de células Caco-2 a medio hipertónico dado lugar a una producción significativa de VEGF. Como se ha demostrado antes de que ocurriera esta producción de VEGF en paralelo con los PGE
2 generación. PGE
2 se describe como un potente inductor de VEGF sobre la base de experimentos en los que la COX-2 sobreexpresión aumentó la producción de VEGF por las líneas celulares de cáncer de colon y de mama. Además, esta producción de VEGF fue inhibida por los inhibidores selectivos de la COX-2. Por lo tanto, tratamos de investigar la influencia autocrina de PGE
2 en la generación de células Caco-2 estimuladas por medio hipertónico. Sorprendentemente, la inhibición de cualquiera de la cPLA
2 o COX-2, por ATK o NS-398, respectivamente, aumenta aún más la producción de VEGF. Este efecto podría atribuirse a la inhibición de PGE
2 generación como la restauración de PGE
2 niveles de adición exógena revirtieron la producción de VEGF a sus niveles originales de ATK tratados células Caco-2. células HCT116 también pueden ser activados por medio hipertónico para producir VEGF. Sin embargo, las células HCT116 no expresa la COX-2 ni producir PGE
2 se activa [31] a pesar de las células o no. Por lo tanto, la falta de efecto de ATK y NS-398 en HCT116 no incluye todos los posibles efectos puntuales objetivo de estos inhibidores [32].
PGE
2 actúa sobre un grupo de G-receptores acoplados a proteínas ( GPCRs). Hay cuatro GPCRs que responden a PGE
2 subtipos designados EP1, EP2, EP3 y EP4, que conducen a vía de señalización distinta y efecto biológico general [27]. Para determinar la dependencia de PGE
2 efectos autocrinos sobre la señalización de EP, se utilizó un antagonista no específico de los cuatro receptores EP, AH 6809. El tratamiento con AH 6809 imitado el efecto de la inhibición de la producción de VEGF por PGE
2, lo que indica que la PGE
2 señales a través de sus receptores de membrana plasmática de regular hacia abajo la producción de VEGF inducida por medio hipertónico. El subtipo particular implicado parece ser EP2 como agonista selectivo, butaprost, es capaz de sustituir completamente PGE
2. Por el contrario, ni los tratamientos EP1 EP3 ni agonistas presentan el efecto inhibidor sobre la producción de VEGF. EP2 parece par con el aumento de los niveles de cAMP y la posterior activación de PKA, como la inhibición de la PKA por H-89 reproduce los efectos de la inhibición de PGE
2 generación o acción. Es importante señalar que los experimentos se realizaron con PGE
2 y sus análogos en concentraciones que eran compatibles con los niveles producidos de forma endógena. Los efectos en la producción de VEGF por las células de cáncer de colon se han atribuido a la PGE
2 usando concentraciones de hasta 100 mM [13] lo que superan con creces la cantidad de PGE
2 realmente se necesita para activar sus receptores [27] o lo que es producido en la masa tumoral [33].
se ha demostrado la activación de EP2 AMPc-PKA-GSK-3 vía de señalización conduce a la disminución de la fosforilación de beta-catenina, permitiendo su translocación y activación de Tcf /Lef dependiente de la transcripción (para una revisión, véase [34]) de los genes implicados en el cáncer, tales como COX-2 y VEGF. Sin embargo, en nuestro modelo de estrés hipertónica, EP2 activación de la vía de señalización hace que la represión de la producción de VEGF. Para entender mejor la regulación de esta vía en la tensión hipertónica se investigó el papel de GSK-3in esta activación con el uso de SB216763, un competitivo GSK-3 α y β inhibidor (50 a 5000 nM, datos no presentados). El tratamiento aumentó la producción de VEGF, lo que indica que el efecto inhibidor de EP2 en la producción del factor angiogénico no depende de esta quinasa. Una posibilidad para el efecto distinto de la activación de EP2 en el estrés hipertónica es que esta regulación se produce a través de cAMP. Algunos estudios han demostrado cAMP puede inhibir la producción de citoquinas mediante la inhibición de las señales dependientes de Ras-por PKA, inactivando de señalización MEK /ERK o mediante el bloqueo de la fosforilación de p38 MAPK [35] - [37]. Como vía /p38 MAPK ERK está implicada en la producción de nuestro modelo de inducción de VEGF, tales hallazgos podrían ser indicativos del mecanismo por el cual la señalización EP2 está bloqueando la producción de VEGF en el estrés hipertónica.
Para determinar si el papel inhibidor de PGE
2 podrá ampliarse a otros estímulos, se utilizó CoCl
2 para inducir la estabilización de HIF-1α y mimetizar la respuesta a la hipoxia [13]. Como se muestra para la estimulación hipertónica, CoCl
2 inducida por PGE
2 generación era dependiente de COX-2. El PGE
Generación 2 también fue acompañado por la producción de VEGF. La inducción de la producción de VEGF por CoCl
2 se ha mostrado antes en fibroblastos humanos [38], línea de pulmón de células del cáncer [39], el epitelio retina [40], las líneas celulares de glioma [41], las líneas celulares de cáncer de próstata [42] y en astrocitos [43], sin embargo no hubo ningún intento de investigar la posible producción de PGE
2 o sus efectos autocrinos. La inhibición de la COX-2 inhibe la producción de VEGF inducida por CoCl
2, lo que indica un papel estimulante para la PGE
2 y que el efecto autocrino de PGE
2 es dependiente del tipo de estímulos utilizados.
medio hipertónico induce la activación de varias MAP quinasas que pueden estar implicados en la regulación de la expresión del VEGF [24]. Dado que estas MAP quinasas también están involucrados en la estimulación de la cPLA actividad y la producción de PGE
2
2-α, eliminamos el efecto inhibidor de PGE
2 antes de intentar analizar su papel en la producción de VEGF. Caco-2 células activadas por medio hipertónico en presencia de NS-398 muestran claramente una marcada dependencia de p38 y menos así sucesivamente ERK 1/2 para producir VEGF. la producción de VEGF CoCl
2 inducida por células Caco-2 mostró el perfil sensibilidad similar a la MAP inhibidores de la quinasa con la excepción de una reducción marcada por el inhibidor de JNK. Los papeles distintos para vía de JNK indican que la producción de las diferencias en medio hipertónico y CoCl
2 inducida por VEGF de ir más allá de la sensibilidad a la autocrinos efectos inhibitorios de PGE
2. Actualmente se encuentra bajo investigación si tales diferencias de señalización pueden ser responsables de los distintos efectos de PGE
2 de cada tipo de estímulos.
Una de las características en el modelo actual para la regulación de la angiogénesis en el tumor masa, en particular en el cáncer de colon, es la regulación de la función de las células endoteliales por las células cancerosas. De acuerdo con ello, el papel de PGE
2 en la angiogénesis se limita a una estimulación autocrina de la producción de factores pro-angiogénicos por la célula tumoral. Aunque interesante, este modelo no comprende los potenciales estímulos externos implicados en la COX-2 y la expresión de VEGF producción ni situaciones en las que la célula que expresa COX-2 y la producción de PGE
2 es distinto de la célula de cáncer. Por ejemplo, el crecimiento ectópico de HCT116 y HT29, células que no expresan COX-2 o producir PGE
2, es dependiente de la COX-2 expresión por endoteliales y células del estroma [44]. COX-2 expresión en modelos de ratón de la poliposis adenomatosa familiar,
Min
[33], [44] y Apc
Δ716 [45] Los ratones, se limita a estroma y células intersticiales. Las diferencias en dependencia de JNK y autocrina PGE
2 efecto inhibitorio sobre la producción de VEGF por la misma línea celular de cáncer de colon son una clara indicación de cómo el modelo también debe tener en cuenta que estas células son expuestas a diferentes estímulos microambientales.
Reconocimientos
los autores desean agradecer al Dr. Karen A. Bell por sus comentarios sobre el manuscrito.