Extracto
Antecedentes
El cáncer de ovario es el tumor maligno de ovario ginecológico más letal, y el subtipo de carcinoma de células claras de ovario (OCCA) demuestra una respuesta particularmente pobre al tratamiento estándar. Las mejoras en los resultados del cáncer de ovario, especialmente para OCCA, se podría esperar de una comprensión más clara de la patología molecular que podrían orientar las estrategias para el diagnóstico temprano y un tratamiento más eficaz.
Metodología /Principales conclusiones
Cell -SELEX tecnología se empleó para desarrollar nuevas sondas moleculares para marcadores de superficie de células cancerosas de ovario. Se obtuvieron un total de trece aptámeros con K
d's para las células de cáncer de ovario en el pico- al rango nanomolar. También se realizó una investigación preliminar de los objetivos de estos aptámeros y sus características de unión.
Conclusiones /Importancia
Hemos seleccionado una serie de aptámeros que se unen a diferentes tipos de cáncer de ovario, cuello uterino, pero no cáncer. Aunque la unión a otras líneas celulares de cáncer se observó, estos aptámeros podrían conducir a la identificación de biomarcadores que están relacionados con el cáncer
Visto:. Van Simaeys D, López-Colón D, K Sefah, Sutphen R, Jiménez E, Tan W (2010) Estudio del reconocimiento molecular de aptámeros seleccionados a través de cáncer de ovario Cell-SELEX. PLoS ONE 5 (11): e13770. doi: 10.1371 /journal.pone.0013770
Editor: Cameron Neylon, Universidad de Southampton, Reino Unido
Recibido: 3 Mayo 2010; Aceptado: 6 Octubre 2010; Publicado: 1 Noviembre 2010
© 2010 Van Simaeys et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores gracias Institutos nacionales de Salud (NIH) de apoyo (R01GM079359, R01 CA133086, CA106414-R01). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de ovario es el quinto cáncer más común en las mujeres [1], y tiene la tasa de mortalidad más alta de cualquier neoplasia ginecológica. Esta enfermedad se caracteriza por unos primeros síntomas, la presentación en una etapa avanzada en la mayoría de los casos, y las tasas de supervivencia pobres [2] - [8]. El pronóstico es especialmente malo para los pacientes con adenocarcinoma de células claras de ovario (OCCA), que es a menudo resistente a la quimioterapia estándar basada en platino [6] - [10].
El suero biomarcador más comúnmente utilizado para el diagnóstico clínico y pronóstico es antígeno de cáncer de ovario 125 (CA-125). El valor CA-125 se eleva en aproximadamente 90% de los casos la fase tardía de cáncer epitelial de ovario (etapas 3 y 4). Sin embargo, sólo se eleva en el 50-60% de las mujeres con enfermedad en estadio temprano y también es elevada en una serie de condiciones benignas [2], [5], [7], [11] - [13].
la utilización de los aptámeros tiene un gran potencial para la identificación de nuevos biomarcadores. Los aptámeros, que son sondas capaces de unirse específicamente a marcadores de superficie celular expresadas por las células tumorales dirigidas [14] - [21], son oligonucleótidos monocatenarios cortos de aproximadamente 100 nt. Ellos se seleccionan de grandes piscinas combinatorias de secuencias de Evolución Sistemática de Ligandos por Enriquecimiento Exponencial (SELEX) por su capacidad de unirse a los objetivos, que pueden ir desde pequeñas moléculas a proteínas o polisacáridos, así como las células tumorales [16] - [19 ], [21] - [23]. Los aptámeros tienen estructuras terciarias bien definidos que dictan la selectividad para sus objetivos.
La especificidad de la diana y la afinidad de los aptámeros son similares a las de los anticuerpos, pero con varias ventajas sobre los anticuerpos para su uso clínico. Los aptámeros se pueden sintetizar químicamente en un tiempo corto un coste relativamente bajo, lo que permite una mejor reproducibilidad de lote a lote y más fácil incorporación de modificaciones químicas. Desde aptámeros para las células se seleccionan sin conocimiento previo de las moléculas diana, aptámeros seleccionados se pueden utilizar para identificar nuevos marcadores de superficie sobre las células del cáncer [14], [16] - [18], [20], [24] - [27] .
En este trabajo, se seleccionó un total de 13 aptámeros de líneas celulares de cáncer de ovario dos modelos: la línea OCCA TOV-21G [28] (10) aptámeros y el ovario línea de adenocarcinoma seroso Caov-3 [29 ] (3 aptámeros). Los objetivos de la superficie celular de los aptámeros también se investigaron brevemente. También se realizó una investigación preliminar de los objetivos de los aptámeros 'y características de unión
Resultados y Discusión
Modelo de dos líneas celulares de cáncer de ovario fueron elegidos para la selección de aptámeros de cáncer de ovario:. la línea celular OCCA TOV -21G y la línea de adenocarcinoma seroso de ovario de células Caov-3. Con el fin de identificar aptámeros que se unen específicamente a las células de cáncer de ovario, la línea celular de cáncer cervical HeLa se utilizó para contra-selección. El procedimiento SELEX para TOV-21G se describe brevemente a continuación. Una descripción detallada se proporciona en la sección experimental.
Para iniciar el proceso de selección, 20 pmol de biblioteca no inmune se enriqueció mediante la unión a monocapas de células TOV-21G secuenciales. Secuencias que muestran la unión no específica a los marcadores de la superficie celular generales se eliminaron mediante incubación de la combinación enriquecida con células HeLa (rondas 2, 4, 5, 7, 8, 9, 12, 20, 21, 22). La piscina eluido para cada ronda de SELEX se amplificó mediante PCR, después de lo cual las piscinas ssDNA de interés se recuperaron y monitoreados para el enriquecimiento hacia TOV-21G por citometría de flujo. Como las piscinas seleccionados fueron enriquecidos con secuencias que reconocen y se unen a la línea de célula diana, un aumento en la señal de fluorescencia se observó (Figura 1a). Sin embargo, los intentos de contra-selección omiten en las rondas 13 y 19 dirigidas al enriquecimiento de secuencias de unión a células HeLa. Las secuencias de unión a las células HeLa se eliminaron con éxito por la selección contador en rondas posteriores, mientras que el enriquecimiento hacia la línea de célula diana se mantuvo (Figura 1b). Después de 22 rondas de SELEX, piscina enriquecida que unen específicamente a la línea celular OCCA modelo, pero marginalmente a las células HeLa, se obtuvo (Figura 2). Por lo tanto, la piscina se enriqueció con éxito para las secuencias de marcadores de superficie expresados por la línea celular OCCA modelo de unión, pero no por las células de cáncer de cuello uterino.
A) El enriquecimiento con células TOV-21G B) La unión marginal de la respectiva piscinas a células HeLa. Al hacer la selección mostrador, se eliminaron las secuencias de unión a células HeLa.
El control negativo en estos ensayos de unión era PE /biblioteca aleatoria marcado con Cy5. C) Las células se incubaron con concentraciones variables de aptámero marcado con PE-Cy5 por duplicado. La intensidad de fluorescencia procedente de la unión a cada concentración de fondo se resta de la intensidad media de fluorescencia del aptámero correspondiente
Tras la finalización del proceso de selección, tres piscinas se escogieron y se sometieron a secuenciación:. Final de la piscina (ronda 22), la piscina anterior (alrededor de 21) y una piscina que muestra el enriquecimiento mínimo (alrededor de 13). secuenciación de la piscina se utiliza para ayudar a identificar candidatos aptámero mediante la generación de grandes cantidades de secuencias. Este número de secuencias (en este caso un mínimo de 2.000 por grupo) es lo suficientemente grande como para permitir la identificación de los aptámeros que sólo tiene una pequeña representación en la piscina (es decir, menos de 1%). Como puede verse en la Tabla 1, los aptámeros seleccionados eran de hecho presente tan pronto como se observó un enriquecimiento mínimo. porcentaje de tamaño de AptTOV1 disminuyó a medida que el SELEX continuó, que es notable dada la elevada afinidad de este aptámero. Este comportamiento también se ha observado en otras selecciones [30]. Otros aptámeros muestran un aumento constante en porcentaje tamaño que el enriquecimiento aumentado. Los resultados de AptTOV6 se incluyen para demostrar que incluso las familias relativamente pequeñas pueden conducir a aptámeros.
Las secuencias fueron alineadas en familias de acuerdo con la homología de secuencia. El número de homólogos se comparó a través de las diferentes piscinas secuenciados para validar su enriquecimiento a través del procedimiento de selección a través de la informática básicas bio. Diez secuencias que muestran la mejor homología a lo largo de las piscinas se seleccionaron como candidatos aptámero, sintetizaron y se ensayaron para la unión a las líneas celulares de cáncer de ovario modelo. Todos los candidatos mostraron unión a TOV-21G, con afinidades de unión en el pico- a la gama de nano-molar (Tabla 2). Esto demuestra el potencial de la secuenciación de próxima generación en SELEX para convertirse en un poderoso método y reproducible para el desarrollo de aptámeros.
Como se muestra en la Tabla 2, los aptámeros aptTOV1 (K
d = 0,25 ± 0,08 nM) y aptTOV2 (0,90 ± 0,25 nM) se unen muy fuertemente a las células TOV-21G. Como se muestra en la Tabla 2, ambos aptámeros pueden distinguir TOV-21G a partir de células HeLa.
La unión de los aptámeros seleccionados se probó con diferentes líneas celulares de adenocarcinoma, así como otros tipos de líneas celulares de cáncer, como se muestra en Tabla 2. Cinco de los aptámeros seleccionados contra TOV-21G mostró unión a células CEM (leucemia linfoblástica aguda), mientras que ninguno de los aptámeros unidos a células Ramos (linfoma de Burkitt) o HL-60 (leucemia promielocítica aguda). Todos los aptámeros obtenidos se unen a adenocarcinoma colorrectal (HCT-116) y glioblastoma (A172). Los aptámeros obtenidos de TOV-21G no se unen a DLD-1 (Dukes C Tipo de adenocarcinoma colorrectal), mientras que los aptámeros procedentes de Caov-3 se unían a esta línea celular. Este comportamiento es similar al observado en el trabajo previo realizado en nuestro laboratorio.
Dado que ambas selecciones se llevaron a cabo a 4 ° C, los aptámeros seleccionados se probaron en condiciones fisiológicas. Los aptámeros se incubaron con la línea celular diana a 37 ° C y 4 ° C y se midió su unión. Todos los aptámeros mostraron una unión similar a 4 ° C y 37 ° C (por ejemplo, aptTOV1 en la Figura 2a), lo que sugiere que tienen potencial para los estudios in vivo.
Para investigar la naturaleza de la molécula diana de cada aptámero, unión de cada aptámero se ensayó después del tratamiento de las células diana con las proteasas tripsina o proteinasa K. Como puede verse en la Figura 3a, aptTOV1 muestra una clara pérdida de unión a TOV-21G después de tratamiento con proteasa. El mismo comportamiento se observó también con todos los demás aptámeros aptTOV. Curiosamente, para el segundo modelo de línea celular, Caov-3, DOV3 y DOV4 retuvo su unión después del tratamiento de la proteasa (Figura 3b), lo que sugiere que estos aptámeros no pueden ser vinculantes para las proteínas de membrana de la superficie celular, sino más bien a otro tipo de marcador de superficie celular (es decir, carbohidratos o lípidos). Ni DOV3 ni DOV4 se une a las células de leucemia ensayadas (Tabla 3).
A) No se observó unión de aptTOV1 a tripsinizaron células TOV-21G. B) La unión de DSV 3 y 4 a Caov-3 células no fue afectada por el tratamiento con proteasa. El resto de los aptámeros mostraron el mismo comportamiento que representó en a).
En conclusión, hemos seleccionado una serie de aptámeros con alta afinidad por las células de cáncer de ovario, incluyendo OCCA (TOV-21G) y adenocarcinoma seroso (Caov-3). Mediante la selección contador contra las células HeLa, se seleccionaron los aptámeros que pueden distinguir el cáncer de ovario de cáncer cervical. En particular, AptTOV 1 mostró una afinidad muy elevada hacia TOV-21G, con una K
d de 250 pM.
Dado el número limitado de biomarcadores para el cáncer de ovario actualmente disponibles, los aptámeros obtenidos a partir de estas selecciones tienen potencial para mejorar el diagnóstico y el tratamiento de esta enfermedad mortal. Debido a que los aptámeros también se unen quistes benignos (Tabla 3), los aptámeros no se pueden usar para identificar el cáncer de ovario
per se
. Sin embargo, ya que los apamers aptTOV no se unen a un cáncer de etiología similar (Caov3) y también para no HeLa, todavía tienen el potencial de proporcionar una visión más clara en la patología del cáncer de ovario. Se ha observado que existen diferencias significativas en el proteoma de cáncer de ovario seroso celular y claro [31]. Los objetivos de estos aptámeros son más propensos abajo regulado o silenciados en estos dos modelos celulares. Además, los aptámeros AptTOV muestran la unión de líneas celulares de cáncer de diferentes tipos de cáncer no relacionados entre sí (Tabla 3), y algunos aptámeros AptTOV también se unen las células CEM. Este resultado sugiere que los aptámeros obtenidos de este SELEX se pueden utilizar para perfilar la expresión de proteínas de la membrana de diferentes tipos de cáncer. Se espera que la identificación de los objetivos de los aptámeros seleccionados para arrojar luz sobre los mecanismos subyacentes implicados
.
El descubrimiento de dos aptámeros que eran insensibles a la digestión por proteasas es intrigante. Además, su unión a todas las células de adenocarcinoma probadas, pero no a cualquiera de las líneas celulares de leucemia, sugiere el potencial de aclarar aún más las diferencias moleculares subyacentes entre estos tipos de cáncer. La investigación adicional se justifica para identificar los objetivos de estos aptámeros y evaluar su rendimiento en muestras clínicas.
Materiales y Métodos
Instrumentación y reactivos
Todos los oligonucleótidos fueron sintetizados por fosforamidita química utilizando un sintetizador de ADN 3400 (Applied Biosystems) y se purificaron por HPLC de fase inversa (Varian Prostar). Todas las mezclas de PCR contenía KCl 50 mM, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), MgCl 2,0 mM
2, dNTPs (cada uno a 2,5 mM), 0,5 M de cada cebador, y Taq ADN de arranque en caliente de la polimerasa (5units /l ). PCR se realizó en un termociclador Biorad y todos los reactivos se adquirieron de Takara. Seguimiento de enriquecimiento de la piscina, la caracterización de los aptámeros seleccionados, y la identificación de los ensayos de proteínas diana se realizó por análisis de citometría de flujo utilizando un citómetro FACScan (BD Immunocytometry Systems). La tripsina y proteinasa K se adquirieron de Fisher Biotech. La formación de imágenes de las células se realizó con un microscopio confocal Olympus FV500-IX81 (Olympus America Inc., Melville, NY). Las secuencias de ADN se determinaron por el Laboratorio Genoma servicios de secuenciación de la Universidad de Florida con el uso de la secuencia 454 (Roche).
Cultivo de células y tampones
El Caov-3, HeLa, Hs832 líneas (C) T y TOV-21G células fueron obtenidas de la American Type Cell Cultura (ATCC). La líneas celulares de cáncer de ovario TOV-21G Caov-3 y donde mantuvieron en cultivo con MCBD 105: Medio 199 (01:01); la línea celular HeLa se cultivaron en medio RPMI-1640; y la línea celular (C) T Hs832 fue cultivada en la Dulbecco Modificado Medio Eagle (DMEM). Todos los medios de comunicación, donde suplementado con FBS al 10% y 100 UI /ml de penicilina-estreptomicina. Otras líneas celulares utilizadas para los ensayos de selectividad incluyen CEM (leucemia de células T), Ramos (linfoma de Burkitt), HCT-116, DLD-1, HT-29 (adenocarcinoma colorrectal), NCI_H23 (células no pequeñas cáncer de pulmón) y A172 (glioblastoma ), todas las cuales se cultivaron de acuerdo a las especificaciones de la ATCC. Todas las líneas celulares donde se incuba a 37 ° C en un 5% de CO
2 atmósfera.
Durante la selección, las células fueron lavadas antes y después de la incubación con tampón de lavado (BM), que contiene 4,5 g /l de glucosa y mM MgCl 5
2 en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco con cloruro de calcio y cloruro de magnesio (Sigma). El tampón de unión (BB) que se utiliza para la selección se preparó añadiendo tRNA de levadura (0,1 mg /ml) (Sigma) y BSA (1 mg /mL) (Fisher) para el tampón de lavado para reducir la unión de fondo.
SELEX biblioteca y cebadores
La biblioteca purificado por HPLC contenía un segmento de secuencia aleatoria de 40 nucleótidos (nt), flanqueada por 20-nt sitios de hibridación de cebadores:
(5'-AGT CAG ATC GAC GCA GCA (N)
40 TGG ACA CGG TGG CTT AGT-3 ') y (5'-ACT ACC AAC GAG CGA CCA CT (N)
40 AGA GTT CAG GAG AGG CAG GT-3'). Los cebadores directos fueron marcadas con 5'-FITC y los cebadores inversos fueron marcadas con 5'-biotina.
in vitro de células-SELEX
En este estudio, TOV-21G se utilizó como orientar la línea celular HeLa y se utilizó para la contra-selección. Para la primera ronda, las células se incubaron con 20 pmol de biblioteca ssDNA naïve disuelto en BB. Para las rondas posteriores, 50 pmol de combinación enriquecida se utilizaron para la incubación, también se disuelve en BB. Antes de la incubación, la combinación de ADNss se desnaturalizó por calentamiento a 95 ° C durante 5 min y se enfrió rápidamente en hielo durante 5 min, permitiendo que cada secuencia para formar la estructura secundaria más estable.
Las células se lavaron dos veces ( 2 min) con WB y se incubaron con el conjunto de ADN en hielo en un agitador orbital durante 30 min. En las rondas de selección posteriores, se lavaron las células con un aumento de rigurosidad para eliminar las secuencias de unión (débilmente un mayor número de lavados y el aumento de tiempo de lavado, hasta 5 min). Las secuencias unidas se eluyeron en 500 l BB por calentamiento a 95 ° C durante 15 min, se enfriaron en hielo durante 5 min y se centrifugaron a 14.000 rpm durante 2 min.
El sobrenadante que contiene las secuencias de ADN se incubó con una línea celular negativa para llevar a cabo una resta de las secuencias generales, como se describe anteriormente. Las secuencias restantes fueron amplificados por PCR usando el FITC y cebadores marcados con biotina. Las amplificaciones se llevaron a cabo a 95 ° C durante 30 s, 60 ° C durante 30 s, y 72 ° C durante 30 s, seguido de extensión final de 3 minutos a 72 ° C. El sentido seleccionado ssDNA se separó de la ssDNA antisentido biotinilado por perlas de sefarosa recubiertas de estreptavidina (Amersham Bioscience). El ssDNA se eluyó de las perlas de sefarosa mediante la fusión en una solución de NaOH 0,2 M.
El enriquecimiento de secuencias específicas se ensayó usando citometría de flujo como se explica a continuación. Cuando el nivel de enriquecimiento alcanzó una meseta, piscinas de interés se sometieron a secuenciación. La selección de aptámeros para la línea celular Caov3 se realizó utilizando el mismo protocolo, sin embargo, un paso tripsinización 1 minuto se utilizó para suspender las células antes de añadir las piscinas. datos suplementarios S1 y S2 contienen los datos clustal de las alineaciones de cada selección (grupo final)
estudios de Afinidad:. El análisis por citofluorométrico para la determinación de la afinidad de unión
Para determinar las afinidades de unión de los aptámeros, las células diana (5 × 10
5) se incubaron con varias concentraciones de aptámeros marcados 5'-biotina en hielo durante 20 min en 100 l de BB. Las células fueron lavadas dos veces con 500 l de BB, y se suspendieron en 100 l de BB que contiene estreptavidina-PE-Cy5.5. Las células fueron lavadas dos veces con 500 l de WB, y se suspendieron en 200 l de BB para el análisis de citometría de flujo, utilizando una secuencia aleatoria marcada 5'-biotina como el control negativo. Todos los experimentos de ensayos de unión se repitieron al menos 2 veces. La intensidad de unión específica se calculó mediante la resta de la intensidad de fluorescencia media de la unión de la intensidad de fluorescencia media de los aptámeros de fondo. La constante de equilibrio de disociación (K
d) del ligando fluorescente se obtuvo mediante el ajuste de un gráfico de la intensidad de unión específica frente a (Y) la concentración de aptámero (X) a la ecuación Y = B
maxX /(K
d + X) utilizando SigmaPlot. (Jandel, San Rafael, CA). S3 datos suplementarios contiene los datos de flujo para todos los experimentos presentados en este artículo.
La selectividad y especificidad
Para determinar la especificidad celular de los aptámeros seleccionados, incluyendo líneas celulares HeLa, K562, H23, H69 , A172, HL-60. HT-29, Ramos y CEM se utilizaron en ensayos de unión por citometría de flujo como se describe anteriormente.
Efecto de la temperatura sobre aptámero de unión
El proceso de selección de aptámeros y todos los ensayos de unión se realizaron en hielo. Se ha observado que algunos de los aptámeros seleccionados a temperaturas más bajas puede no se unen bien a 37 ° C [26], lo que lleva a un bajo rendimiento en condiciones fisiológicas. Con el fin de verificar la estabilidad de unión, aptámeros se incubaron con el objetivo a 37 ° C, y la intensidad de fluorescencia se determinó por citometría de flujo. Los aptámeros se incubaron en hielo se utilizaron como control positivo.
digestión de la proteasa ensayo
Las células diana (5 × 10
5) se separaron usando una solución de disociación celular no enzimática. Después de la resuspensión, las células se lavaron con 3 ml de PBS y después se incubaron con 1 ml de 0,05% de tripsina /EDTA 0,53 mM en HBSS o 0,1 mg /ml de proteinasa K en PBS a 37 ° C durante 1, 5, 15, 30 y 60 minutos. Pura FBS se añadió para calmar las proteinasas. Después de lavar con 2 ml de BB, se utilizaron las células tratadas durante los ensayos de unión como se describe anteriormente.
información de apoyo
de datos S1.
Bando de la piscina TOV última
doi:. 10.1371 /journal.pone.0013770.s001 gratis (1.13 MB TXT)
S2 de datos.
Bando de la piscina Caov3 última
doi:. 10.1371 /journal.pone.0013770.s002 gratis (0.20 MB TXT)
S3 de datos.
Este archivo contiene los datos de flujo de las cifras presentadas en este artículo
doi:. 10.1371 /journal.pone.0013770.s003 gratis (ZIP 3,69 MB)
S4 de datos.
leyenda a la cantidad de ventajas. Esta cifra fue nuestro guía para determinar la cantidad de ventajas para la tabla 3.
doi: 10.1371 /journal.pone.0013770.s004 gratis (0.04 MB PDF) guía
Reconocimientos
agradecemos a los Dres. Parag Parekh y Tahir Bayrac para los muchos debates científicos útiles que contribuyeron a este trabajo, el Sr. George Ansoaunoor para la ayuda técnica. También agradecemos al Dr. Kathryn Williams por su revisión crítica del manuscrito. Agradecemos a la secuenciación del ADN básico, ICBR, de la Universidad de Florida.