Extracto
La mayoría del genoma humano se transcribe y se genera ARN no codificante (ncRNAs) que no para codificar la información de proteínas. ARNs no codificantes largas (lncRNAs) están emergiendo como una nueva clase de ncRNAs, pero nuestro conocimiento sobre estos ncRNAs es limitada. Anteriormente, nuestro laboratorio ha identificado que una lncRNA 1, el cáncer urotelial asociado (UCA1), jugó un papel importante en el cáncer de vejiga. A pesar del reciente interés en UCA1 como marcador diagnóstico para el cáncer de vejiga, se sabe poco sobre su regulación transcripcional. Para dilucidar la regulación de la expresión génica UCA1, hemos caracterizado el promotor del gen UCA1 humano. Un fragmento de 2,0 kb de su región flanqueante 5 'se clonó en un vector indicador de luciferasa. La deleción y análisis de la mutación sugirieron que un sitio de unión Ets-2 era crítica para la actividad del promotor del gen UCA1. Un análisis más detallado de este sitio por desplazamiento de gel, la cromatina precipitación inmune (ChIP), y los experimentos de co-transfección demostró que el factor de transcripción Ets-2 unido directamente a la región promotora UCA1 y estimuló la actividad del promotor UCA1 en células de cáncer de vejiga. Teniendo en cuenta la función de anti-apoptosis de Ets-2, nuestros datos sugieren que Ets-2 regula proceso de apoptosis mediante la regulación de la expresión de UCA1, por otra parte UCA1 puede estar implicada en la activación de la vía de señalización de Akt por Ets-2 en células de cáncer de vejiga .
Visto: Wu W, S Zhang, Li X, Xue M, Cao S, W Chen (2013) Ets-2 regula la apoptosis de las células a través de la Akt, a través del Reglamento de cáncer urotelial asociada 1, una ARN largo no codificante, en células de cáncer de vejiga. PLoS ONE 8 (9): e73920. doi: 10.1371 /journal.pone.0073920
Editor: Rajvir Dahiya, UCSF /VA Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 6 Marzo, 2013; Aceptado: July 24, 2013; Publicado: 12 de septiembre 2013
Copyright: © 2013 Wu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por la beca de la Fundación de Ciencias Naturales de China (subvención Nº 81072104). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
genomas eucariotas no son las simples sustratos, bien de orden superior de la transcripción de genes que una vez que se creía. Ahora sabemos que transcriben un amplio espectro de moléculas de ARN, que van desde largas mRNAs codificación de la proteína a las transcripciones no codificantes cortos, que con frecuencia se solapan o son intercalados en cualquiera de las hebras [1]. ARN no codificantes largas (lncRNAs) están emergiendo como una nueva clase de ARN no codificantes que contienen más de 200 nucleótidos, pero nuestro conocimiento de estos lncRNAs es limitada. LncRNAs son las transcripciones que se asemejan a los ARNm codificantes de proteínas en que se taparon, se empalman y ARN poliadenilado polimerasa transcripciones II. Se diferencian de los mRNAs sólo en su falta de marcos de lectura abiertos codificantes de proteínas (ORF) [2].
A diferencia de la diversidad de especies de ARN, se han identificado sólo un pequeño número de lncRNAs tener obtenida experimentalmente funciones. Por otra parte, la desregulación de la lncRNA se ha demostrado en varios tipos de cáncer [3], [4], como MALAT-1 en cáncer de pulmón [5], HULC en el carcinoma hepatocelular [6], y HOTAIR en el cáncer de mama [7] , lo que indica que lncRNAs puede jugar un papel crítico en la tumorigénesis o la progresión del tumor.
Anteriormente, establecimos-211 BLS células BLZ-211 y que son un par de carcinoma de células transicionales de la vejiga (TCC) líneas de células clonadas por separado de la muestra del mismo paciente, pero con diferentes características biológicas [8], [9], [10]. A continuación, hemos informado de una nueva etiqueta de secuencia expresada (EST) (número de acceso Genbank DR159656) aislado de estas dos líneas celulares mediante el uso de la hibridación sustractiva de supresión (SSH) técnica [11]. En base a esta EST, hemos clonado y se identificaron un cáncer urotelial ncRNA llamado asociado 1 (UCA1) (número de acceso Genbank EU334869) [12]. UCA1 pertenece a la lncRNAs debido a la falta de una fuerte secuencia de consenso Kozak para la iniciación de la traducción en cualquiera de los codones ATG en múltiples ORFs pequeñas [12]. Muchos estudios sugieren que UCA1 puede actuar como un marcador molecular de cáncer de vejiga debido a su excelente especificidad y sensibilidad [13], [14]. Un estudio previo en nuestro laboratorio también da a entender que la expresión UCA1 elevada puede influir en el crecimiento de células de cáncer de vejiga y promover la invasión de las células de cáncer de vejiga [12], lo que sugiere que sería un nuevo gen diana terapéutica del cáncer de vejiga. A pesar de este interés, se sabe poco acerca de la
cis-elementos reguladores
directamente implicados en la modulación de la transcripción del gen UCA1 en el cáncer de vejiga. Además, el estudio de nuestro laboratorio mostró que hay tres variantes de empalme del gen UCA1 existente en las células de cáncer de vejiga [12], [15]. La elevada expresión de UCA1 en el cáncer de vejiga y la existencia de empalme variantes indican fuertemente que la regulación transcripcional del gen UCA1 está estrechamente controlada. El UCA1
cis
regulación puede dar forma a las redes complejas de expresión génica que en última instancia conducen a procesos biológicos, como la apoptosis de las células.
En este estudio, hemos identificado el promotor del gen humano UCA1 por primera vez y se investigó la regulación del promotor UCA1 por el factor de transcripción Ets-2. Ets-2 puede influir en la apoptosis de células de cáncer de vejiga mediante la regulación de la expresión de UCA1. También encontramos lncRNA UCA1 puede estar implicada en la activación de la vía Akt. Esta investigación proporcionará información sobre el mecanismo de regulación de la expresión UCA1 en estudios posteriores.
Materiales y Métodos
Promotor Predicción
Anteriormente, la longitud total del ADNc y su UCA1 sitio de inicio de transcripción (TSS) se identificaron utilizando la tecnología de SMART RACE [12]. En este estudio, se utilizó el programa Megablast (NCBI) para mapear el gen UCA1 y sus flanquean secuencias de la región y de ADN 5 'fueron descargados de GenBank (NC_000019.9). El TSS del gen UCA1 fue marcado como +1. Para predecir el promotor y los factores de transcripción putativo, se utilizaron los siguientes algún tipo de software en línea. El promotor y TSS predicen herramientas incluyen el programa de software de FPROM Softberry (http://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=fprom&group=programs&subgroup=promoter) y el programa de PromoterInspector Genomatix (http: //www.genomatix.de/online_help/help_gems/PromoterInspector_help.html) [16]. El programa MatInspector de Genomatix (http://www.genomatix.de/online_help/help_matinspector/matinspector_help.html) [17], [18] fue utilizado para la predicción del factor de transcripción.
Construcciones de plásmidos
Para generar el plásmido pGL3-UCA1-2000, un fragmento de ADN que contiene el
cis
región del gen UCA1 -1800-200 pb fue amplificado por PCR (ADN polimerasa PrimeSTAR® SA, Takara, Dalian ). El producto de PCR se escindió del gel de agarosa y se aisló utilizando el Kit de gel de agarosa de fragmentos de ADN de recuperación (Takara, Dalian). a continuación, se insertó el fragmento de ADN purificado en luciferasa que expresa vector pGL3-Basic (Promega, EE.UU.) a través de
Kpn I y
Nhe I
sitios. Otros fragmentos truncados se realizaron en la forma descrita anteriormente. Los conjuntos de cebadores utilizados para esta serie de productos se proporcionan en la Tabla 1. Los fragmentos de ADN amplificados se insertaron en el vector pGL3-basic a través de la misma endonucleasas de restricción sitios. Se secuenciaron todas las construcciones de ADN.
mutagénesis dirigida
mutación de sustitución de Ets-2 sitios de unión se ha generado por la mutagénesis dirigida al sitio basada en PCR (Byotime, China) . El vector pGL3-UCA1-1200 se utilizó como molde de ADN, y el sitio de unión al núcleo Ets-2 (GGGAAG) fue reemplazado a un
sitio de restricción Hind III
(AAGCTT) (Tabla 1). El vector mutante fue nombrado como pGL3-UCA1-1200-mut. Las mutaciones se confirmaron mediante digestión con enzimas de restricción y secuenciación.
Cultivo celular, transfección transitoria
carcinoma transicional de vejiga humano (TCC) líneas celulares BLZ-211 y BLS-211 se cultivaron en RPMI 1640 (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD, EE.UU.). líneas celulares BLZ-211 y BLS-211 fueron establecidos por nuestro laboratorio en 1994. El tejido de cáncer de vejiga estaba a partir de muestras quirúrgicas de un hombre de 55 años de edad con diagnóstico de carcinoma de células transicionales multifocal papilar (CTP) de grado II. Todo el procedimiento se administró unber la aprobación del comité de ética del Primer Hospital Afiliado de la Facultad de Medicina, Universidad de Xi'an Jiaotong [8]. Las células con más del 80% de confluencia se utilizaron para la transfección.
BLZ-211 células fueron transfectadas con FuGENE®HD reactivo de transfección (Roche, EE.UU.) en placas de 24 pocillos. Cada pocillo contenía 2 × 10
5 células, 0,5 g de pGL3-UCA1 serie vector, 0,02 g del vector de control interno pRL-TK (Promega, EE.UU.), 1 FuGENE®HD l y 500 l de RPMI 1640 medio sin suero o antibióticos. (Promega, EE.UU.) vectores pGL3-básica se transfectó como control. Para siRNA transfección, las células fueron transfectadas con siRNA X-tremeGENE reactivo de transfección (Roche, EE.UU.) en la placa de 6 pocillos. Tanto Ets-2 siRNA y revueltos siRNA de control son productos comerciales (Santa Cruz, USA).
Los ensayos de luciferasa
Antes del ensayo las células se lavaron con tampón fosfato salino (PBS) a las 48 horas después de la transfección y se lisaron en un tampón de lisis pasiva (Promega, EE.UU.). La actividad de luciferasa se midió con un luminómetro (Promega, EE.UU.) utilizando el kit de ensayo de indicador Dual-Luciferase (Promega, EE.UU.). El resultado se normalizó a la actividad de la luciferasa de Renilla. los datos reportados fueron representados como la media de tres experimentos independientes.
La movilidad electroforética cambio de ensayo (EMSA)
Nuclear proteínas se extrajeron de las células BLZ-211 utilizando el extracto de proteína nuclear kit (Byotime, China ). Entonces ensayo de cambio de movilidad electroforética se realizó de acuerdo a la EMSA Kit (Pierce, EE.UU.). A continuación, las sondas se preparan con base en el sitio de unión Ets-2 en el promotor del gen UCA1 y su secuencia complementaria correspondiente (5'-TGTCCTCTGGGAAGAAATGACC-3 ') llamado UCA1-WT-Ets acompañados con una versión mutante (5'-TGTCCTCTGTATAGAAATGACC-3' ), así, llamado UCA1-Mut-Ets. Una modificación 5'-biotina se incluyó en la sonda UCA1-peso-Ets. Para ensayos de competición, el exceso de 200 veces de sondas no marcadas y sondas mutantes no marcados se incubaron con la mezcla de reacción antes de añadir la sonda marcada.
Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) Ensayo
1 × 10
7 células fueron reticulado con 1% de formaldehído durante 10 min a 37 ° C. Luego, las células se lavaron con PBS frío, se recogieron por raspado y se resuspendieron en tampón de lisis celular que contiene inhibidores de la proteasa (Roche, EE.UU.). Después de incubación durante 10 min en hielo, se sometieron a ultrasonidos las células para generar alrededor de 200 a 1000 pb fragmentos de ADN, y se centrifugaron durante 10 min a 4 ° C. Los sobrenadantes se dividieron y se incubaron con anticuerpos anti-Ets-2 de anticuerpos (Santa Cruz, EE.UU.), o IgG (Boster, China) como control negativo a 4 ° C durante la noche con rotación, respectivamente. Los complejos inmunes se precipitaron con ADN de esperma de salmón /proteína G-agarosa (Millipore, EE.UU.) durante 2 horas a 4 ° C, a continuación, se recuperaron, se lavaron, se eluyeron con el tampón de ChIP elución y revertir reticulado por calentamiento a 65 ° C durante 4 h. El ADN se purificó a partir de la inmunoprecipitación con el anticuerpo o a partir de muestras de entrada y se analizaron por PCR, usando cebadores que flanquean Ets-2 sitio de unión en el promotor del gen UCA1 (Tabla 1). Chip ensayos se realizaron por duplicado.
Western Blot
Las células se sedimentaron y luego lisadas por tampón RIPA (Thermo Scientific, EE.UU.). Después de la resolución de SDS-PAGE y transferencia de membrana, las proteínas diana se probaron con anticuerpos contra humana Ets-2 (Santa Cruz, EE.UU.), Akt, pAkt (Cell Signaling, EE.UU.), Bax (Epitomics, EE.UU.) o GAPDH (Abmart, China ) seguido de incubación con anticuerpos de inmunoglobulina secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (Santa Cruz, EE.UU.). Por último, las bandas se visualizaron por quimioluminiscencia utilizando un kit de detección de quimioluminiscencia (Pierce, EE.UU.) y las bandas específicas se registraron en la película de rayos X.
Ensayo de apóptosis
Para cuantificar la apoptosis, las células se teñidas con anexina V y PI utilizando el kit de detección de Anexina V-FITC /PI apoptosis (Keygene Biotech, china) siguiendo las instrucciones del fabricante. La fluorescencia se detecta mediante microscopio de fluorescencia (Olympus, Japón) y citometría de flujo cian ADP 9 de color de Beckman Coulter (Beckman Coulter Brea, CA). La citometría de flujo experimentos se realizaron por triplicado y se repitieron tres veces.
Análisis estadístico
Los datos se presentan como la media ± desviación estándar (DE) de tres experimentos separados. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software SPSS 13.0. Las diferencias entre grupos se analizaron mediante el Estudiante
t-test
.
P
. & Lt; 0,05 se consideró como valor estadísticamente significativa
Resultados
Clonación y Análisis Bioinformatial de la región promotora UCA1
En el estudio anterior, el El sitio de inicio de transcripción (TSS) de UCA1 fue identificado por 5'-RACE [12]. Se utilizó el programa Megablast del NCBI para determinar la TSS, de UCA1 gen, que se encuentra en la posición de 15.939.757 chr19 (GRCh37 /hg19). Marcado de este sitio como 1, un total de secuencias de ADN de 3,0 kb de la región 5 'flanqueante regulación UCA1 (-2000 bp + 1000 pb) se obtuvo de GenBank, que se utilizó para el análisis bioinformatical. El resultado del programa FPROM sugirió que el SAT se encuentra en 135 pb, y una caja TATA en +105 pb. El análisis del programa de PromoterInspector indicó que la región promotora está entre -515 pb y 100 pb región. Teniendo en cuenta los anteriores resultados 5'-RACE y la predicción de resultados, se optó por las secuencias de -1800 pb a 200 pb para el seguimiento de la investigación. Para evaluar la actividad del promotor UCA1, construcciones indicadoras que contienen una serie de las secuencias flanqueante 5 '(pGL3-UCA1-2000, pGL3-UCA1-1200, pGL3-UCA1-900, pGL3-UCA1-600, pGL3-UCA1-350) se midieron por ensayo de luciferasa en células BLZ-211. Las construcciones pGL3-UCA1-2000, pGL3-UCA1-1200, pGL3-UCA1-900 y pGL3-UCA1-600 muestran diferente actividad promotora. El pGL3-UAC1-1200 cedió la actividad promotora más fuerte en estas construcciones. En particular, cuando se eliminó el fragmento de ADN entre -400 pb y -150 pb, la actividad del promotor fue casi abolió (Fig. 1A), lo que sugiere la existencia de un elemento regulador positivo crítico en esta región. Estos experimentos de deleción sugieren que la actividad del promotor UCA1 detectado en las células BLZ-211 es atribuible principalmente al elemento regulador positivo entre -400 pb y -150 pb de la región promotora. Había muchos factor de transcripción (TF) unión a los sitios de esta región predicha por el programa MatInspector bioinformática, incluyendo putativo Ets-2, C /EBP, SP-1, c-Myb,
et, al
. (Fig. 1B). A partir de estos factores de transcripción, se optó por Ets-2 como el TF potencial debido a su más alta puntuación de predicción.
Ensayo de la luciferasa (A). Cinco fragmentos de ADN truncadas de la región promotora UCA1 en vectores pGL3, un vector de control negativo, pGL3-basic, y el vector de control positivo, pGL3-control, se transfectaron en células BLZ-211. Las actividades de luciferasa se midieron a las 48 h después de la transfección. Los valores representan las medias ± SD de al menos tres experimentos independientes. *
P Hotel & lt; 0,05. (B) Factores de Transcripción de predicción mediante el uso de software de MatInspector. Los factores de transcripción con alta puntuación de predicción estaban presentes.
Ets-2-sitios de unión contribuyen a la activación del promotor
Para investigar si Ets-2 es crítico para la actividad promotora UCA1, reemplazamos los Ets-2 sitios a los
III sitios de endonucleasa de restricción Hind en pGL3-UCA1-1200-mut vinculante. En comparación con la actividad de informador de luciferasa de tipo silvestre pGL3-UCA1-1200, la pGL3-UCA1-1200-mut produjo un promotor de la actividad mucho más baja en BLZ-211 células (Fig. 2A), lo que demuestra que estos Ets-2 sitios de unión de hecho juegan un papel esencial en la regulación de la actividad del promotor UCA1. Para confirmar si el factor de transcripción Ets-2 puede unirse a esta región, el extracto nuclear de células BLZ-211 se preparó y se realizó EMSA. Los 22 oligonucleótidos pb desde -378 a -357 nt que contiene los Ets-2 sitios de unión se utilizó como sonda de tipo salvaje y la misma región con sitios de unión mutadas se usó como la sonda mutante (Fig. 2B). Como se muestra en la Fig. 2B, un prominente complejo ADN-proteína se formó con la sonda de tipo salvaje. La unión se compitieron fuera por un exceso de 200 veces de sonda de tipo silvestre sin marcar, pero no por un exceso de 200 veces de sonda mutante no marcado. Los resultados indicaron que esta región era responsable de la formación del complejo ADN-proteína. Para investigar más a fondo si Ets-2 puede unirse directamente al promotor proximal UCA1
in vivo
, chip se realizó utilizando anticuerpos contra Ets-2 para inmunoprecipitar la cromatina formaldehído-fijo a partir de células BLZ-211. Como se muestra en la Fig. 2C, destacados productos de PCR que contiene los Ets-2 se detectaron sitios de unión utilizando ADN derribado por el anticuerpo contra Ets-2, mientras que no se observó amplificación en el ADN inmunoprecipitado por IgG, lo que demuestra que Ets-2 puede unirse directamente al promotor UCA1 en BLZ-211 células.
(A) ensayo de la luciferasa. Los sitios de unión Ets-2 (GGGAAG) fueron sustituidos por
Hind III sitios
(AAGCTT) por mutagénesis dirigida al sitio (panel superior). actividades de luciferasa relativas de la de tipo salvaje (wt) y los vectores mutantes (mutantes) se midieron por ensayo de luciferasa. Los valores representan las medias ± SD de al menos tres experimentos independientes. *
P Hotel & lt; 0,05. (B)
In vitro
detección de Ets-2 del factor de transcripción de unión a la región promotora del gen UCA1 mediante ensayo EMSA. Se observó una banda predominante cuando la sonda Ets-2 marcado con biotina se incubó con el extracto nuclear (carril 2). Ets-2 La unión no puede ser inhibida por la sonda mutante (carril 3) mientras que se compitió con la sonda de frío no marcado (carril 4). (C)
In vivo
detección de Ets-2 del factor de transcripción de unión a la región promotora del promotor del gen UCA1 por chip de ensayo. cromatina de entrada (entrada), que representa las porciones de la cromatina sonicado antes de la inmunoprecipitación, se utilizó como control positivo. anticuerpo IgG se utilizó como control negtive de chip de ensayo.
Ets-2 es esencial para la regulación de la transcripción de UCA1
Para determinar si el factor de transcripción Ets-2 podría regular la expresión UCA1 , semi-cuantitativa de RT-PCR se realizó después de eliminar a Ets-2 por siRNA en células BLZ-211. Los resultados de PCR mostraron que la expresión UCA1 ARNm se redujo en alrededor de 50% después de la atenuación de la expresión Ets-2 (Fig. 3A). Además, como los resultados del ensayo de luciferasa muestran, cuando co-transfectadas el siRNA específico Ets-2 o revueltos control de siRNA con pGL3-UCA1-1200 en células BLZ-211, desmontables de Ets-2 causó la disminución de la actividad de promotor en comparación UCA1 con el grupo de control de siRNA revueltos (Fig. 3B). Estos resultados indicaron que Ets-2 puede regular la expresión de UCA1 al afectar a la actividad del promotor UCA1.
(A) Expresión de Ets-2 y UCA1 se midió mediante RT-PCR siguiente Ets-2 siRNA o revueltos siRNA tratamiento en las células BLZ-211. 18 S rRNA se utilizó como control interno. (B) Ensayo de la luciferasa. Ets-2 siRNA o revueltos siRNA control fue co-transfectadas con pGL3-UCA1-1200 en células BLZ-211. Los valores representan las medias ± SD de al menos tres experimentos independientes. *
P Hotel & lt; 0,05. NSC: control no siRNA
UCA1 pueden estar implicados en la apoptosis inducida por Ets-2 caída en BLZ-211 células
El papel de Ets-2 en el cáncer de vejiga. está claro, por tanto, se verificó la consecuencia funcional de Ets-2 desmontables en las células de cáncer de vejiga. Se observó un nivel de aumento de la apoptosis después de un tratamiento de 48 horas con Ets-2 siRNAs en células BLZ-211 a través de microscopio de fluorescencia. Los resultados de los ensayos de apoptosis de células mostró un aumento del nivel de apoptosis en las células BLZ-211 cuando las células se trataron con Ets-2 siRNA específico en comparación con el tratamiento de control revueltos siRNA (Fig. 4A). Para verificar si Ets-2 inducida por la expresión de genes UCA1 estuvo implicado en la apoptosis se estudió otra línea celular TCC vejiga, llamada BLS-211. BLS-211 es la falta de expresión UCA1 endógena y se deriva del mismo paciente como línea celular BLZ-211. Curiosamente, después de eliminar a la gen Ets-2, que no se observó apoptosis subsecuente en BLS-211 células (Fig. S1). Además, contamos con las células apoptóticas mediante citometría de flujo en ambas líneas celulares por separado. En consonancia con los resultados de microscopio de fluorescencia, la citometría de flujo Los resultados revelaron un aumento significativo de células pro-apoptosis (cuadrante superior derecho) después de Ets-2 caída en BLZ-211 células (12,49 ± 1,21%
vs.
6,40 ± 1,47%), mientras que no se observó aumento de la pro-apoptosis después de Ets-2 desmontables en las células BLS-211 (4,12 ± 0,28%
vs.
3.20 ± 2.50%) (Fig. 4B). Estos resultados sugieren que UCA1 puede estar implicado en la apoptosis celular inducida por la supresión de la Ets-2.
(A) La inducción de la apoptosis después de un tratamiento de 48 horas de Ets-2 siRNA o revueltos control de siRNAs en las células BLZ-211 se examinó utilizando un microscopio de fluorescencia. Las células fueron teñidas con anexina V (verde) y PI (rojo). La barra de escala de 25 micras. Las imágenes eran representativos de tres experimentos independientes. (B) La apoptosis se cuantificó por citometría de flujo (FCM). Los resultados FCM eran representativos de tres experimentos independientes. los procesos de proliferación celular y la apoptosis (cuadrante superior derecho) se incrementaron después de Ets-2 caída en BLZ-211 células (12,49 ± 1,21% vs. 6,40 ± 1,47%, *
P Hotel & lt; 0,05), mientras que ningún cambio significativo en BLS-211 células (4,12 ± 0,28% vs. 3,20 ± 2,50%,
P Hotel & gt; 0,05). NSC:. Control no siRNA
UCA1 podrán participar en la inactivación de Akt en la celda de la apoptosis inducida por Ets-2 El descenso de regulación
Para determinar si la supresión de Ets -2 inducir la apoptosis en células de cáncer de vejiga a través de Akt vía, una vía regulador de la apoptosis privotal, se determinó el nivel de expresión de la proteína de Akt total y Akt fosforilada (pAkt). Curiosamente, los resultados de transferencia Western mostraron que después de silenciar la Ets-2, la expresión pAkt posteriormente se disminuyó, mientras que la expresión de la proteína proapoptótica Bax se incrementó (Fig. 5, panel izquierdo). Nuestros resultados implicaban que Ets-2 knockdown activado para inducir la apoptosis en las células BLZ-211 a través de la inactivación de la vía de Akt y condujo a los cambios en las moléculas diana aguas abajo. Por lo tanto se asumió que la expresión de genes UCA1 puede estar asociada con la activación de Akt vía que está implicada en el proceso mediada por anti-apoptosis Ets-2 en células de cáncer de vejiga. Para hacer frente a este concepto, el próximo estudiamos el nivel de expresión de proteínas de la Akt, pAkt y Bax en las células BLS-211. Como se muestra, no fue una diferencia notable entre el grupo tratado con Ets-2 siRNA y revueltos siRNA grupo tratado (Fig. 5, panel derecho). Nuestros resultados sugieren que la regulación por disminución de Ets-2, un factor de transcripción del gen UCA1, puede inducir la apoptosis en las células BLZ-211 por la disminución de la expresión UCA1 y esto puede contribuir a la inactivación de la vía de Akt (Fig. 6).
Ets-2 y proteínas relacionadas con la apoptosis fueron detectados por Western blot. GAPDH se utilizó como control interno. NSC:.. No específicos de control de siRNA
La línea de UCA1 de Akt indica que la asociación entre UCA1 y Akt puede ser indirecta
Discusión
el cáncer de vejiga es una de las neoplasias más comunes en china, ubicándose como la primera neoplasia frecuente del tracto urinario. Hemos demostrado previamente que UCA1 puede promover el crecimiento celular y la invasión en el cáncer de vejiga [12]. UCA1 es un lncRNA, ya que tiene múltiples pequeña ORF aunque no hay fuertes secuencias de consenso Kozak se encontraron en cualquiera de los codones ATG [12], [13]. Varios lncRNAs han sido identificados que están vinculados a enfermedades humanas y tienen funciones específicas relacionadas con las enfermedades humanas [19]. Anteriormente, hemos demostrado el patrón de expresión espacial y temporal de UCA1. Sin embargo, la regulación transcripcional de la expresión génica UCA1 no se ha estudiado. Aquí, por primera vez, hemos caracterizado a la región promotora del gen UCA1 humana e informó su regulación por Ets-2 factor de transcripción.
A diferencia de los genes codificantes de proteínas convencionales, las secuencias, los sitios de inicio de la transcripción , las estructuras exón, y las longitudes de estos largos genes no codificantes son muy variables [20]. Sobre la base de su proximidad genómica de los genes codificantes de proteínas, lncRNAs se clasifican como superposición, cis-antisentido, bidireccional o intronic ncRNAs [21], [22] .Los mecanismos de expresión lncRNA son desconocidos, aunque hay mucha evidencia para sugerir que lncRNAs están regulados por mecanismos similares a los genes que codifican proteínas. En pocas palabras, en el estudio de Wang et al, encontraron una región núcleo promotor (a partir de los nucleótidos -132 a -48) del gen lncRNA HULC y que caracterizan un sitio entre los nucleótidos -67 y -53 de unión en la región núcleo promotor de CREB [ ,,,0],23]. En otro estudio realizado por Zhao et al, analizaron un fragmento de ADN genómico 5 kb aguas arriba del primer exón del gen lncRNA MEG3, caracterizan un sitio CRE implicado en la transcripción de genes MEG3 y también encontraron varias proteínas de la familia CREB se une directamente a la CRE sitio [24]. Además, muchos estudios sugieren que los mecanismos por los que la expresión ncRNA se altera en los cánceres son similares a las de los genes de codificación, incluyendo la proteína mecanismos epigenéticos [25], [26], [27], [28].
en nuestro estudio, hemos analizado la región promotora proximal del UCA1 que encuentra en -2000 nucleótidos aguas arriba del sitio de inicio de la transcripción del gen UCA1. Hemos demostrado por el ensayo de actividad de la luciferasa y el análisis de deleción que la región entre los nucleótidos -400 a -150 puede contribuir a la actividad básica del promotor. Y en esta región se predijo muchas factor de transcripción conocido a través de métodos de predicción bioinformática. Se demostró además por la EMSA y el análisis chip que los sitios de unión de Ets-2 entre los nucleótidos -385 y -380 jugaron un papel importante en la regulación de la actividad del promotor UCA1. En nuestro estudio hemos utilizado células BLS-211, que fueron dejado de expresar el gen UCA1 aunque expresaron el gen Ets-2. Cuando se trataron las células con Ets-2 siRNA, el promotor de la actividad UCA1 no fue completamente abolida. Ambas observaciones sugieren que la expresión UCA1 puede ser controlada por otros factores de transcripción también. Cabe destacar cuando se eliminó la región entre los nucleótidos -700 y -400, la actividad del promotor se redujo considerablemente. Se sugiere una presencia de algunos activadores de la transcripción en esta región. Para mayor claridad los estudios futuros deben centrarse en otros TFS de la región promotora del gen UCA1, que contribuyen a la actividad del gen UCA1.
Ets-2 se caracterizó inicialmente como un proto-oncogén. Con los años la familia del factor de transcripción Ets se convirtió en un elemento común en la génesis tumoral [29]. Hallazgos por Carbone
et al
sugirieron que la regulación negativa de Ets-2 en células de cáncer de próstata se asocia con niveles reducidos de la proteína anti-apoptótica Bcl-x (L), factores reguladores del crecimiento de ciclina D1 y c-myc . Este estudio reveló el papel específico de Ets-2 para promover el crecimiento y la supervivencia de las células de cáncer de próstata [30]. En otro estudio, se demostró que la expresión transitoria de Ets-2 a proteger las células de la apoptosis mediante el aumento de la actividad del promotor de Bcl-XL y por consiguiente la mejora de sus niveles de mRNA y expresión de proteínas en líneas celulares de mesotelioma [31]. Anteriormente, Hanke
et al
encontró que la relación de Ets 2-mRNA de activador de plasminógeno uroquinasa (uPA) mRNA en la orina podría ser un marcador potencial para el cáncer de vejiga [32]. Aunque no hay datos admitidos que Ets-2 participa en el desarrollo del cáncer de vejiga, el papel exacto y mecanismos de Ets TFS en el cáncer de vejiga son en su mayoría desconocidos.
En nuestro estudio, hemos demostrado una inhibición de la expresión inducida por UCA1 Ets-2 silenciamiento génico. consecuencia funcional de Ets-2 silenciamiento de genes condujo a la apoptosis en las células BLZ-211. Se demostró además que Akt estuvo involucrado en este proceso. La serina-treonina quinasa Akt (también conocida como proteína quinasa B) es un nodo de convergencia central en una red de señalización ampliamente influyente. Akt regula las funciones celulares esenciales tales como la migración, proliferación, diferenciación, apoptosis, y el metabolismo de [33]. Además, la activación de la vía de Akt juega un papel fundamental en la inhibición de la apoptosis inducida por una serie de estímulos, incluyendo la retirada del factor de crecimiento, el desprendimiento de la matriz extracelular, la irradiación UV, la discordancia del ciclo celular y la activación de FAS señalización [34], [35] , [36]. Para probar si Ets-2 regula a través de Akt UCA1, se utilizó otra línea celular de cáncer de vejiga BLS-211, que carece de la expresión génica UCA1 y se deriva del mismo paciente como BLZ-211. Lo más interesante, a raíz de la expresión atenuada de Ets-2 en células BLS-211 que no observó la baja regulación de pAkt y el aumento de la apoptosis celular. Estos resultados mostraron que UCA1 puede estar implicada en la activación de la vía pAkt por Ets-2 (Fig. 6). Estos resultados fueron consistentes con nuestro estudio anterior mostró que pAkt es el regulado en la caída BLZ-211 células estables UCA1 [37]. LncRNAs han demostrado que el puerto actividades biológicas. Hasta donde se sabe, el amplio repertorio funcional de lncRNAs incluye papeles en la dinámica de los cromosomas de alto orden, biología de los telómeros y la organización estructural subcelular [22], [38]. Además de nuestro estudio, otros estudios también sugieren que lncRNA puede estar implicada en la regulación de la vía de señalización, como vía Wnt, Ras vía [39], [40]. Sin embargo, el mecanismo que la forma en Ets-2 regula la vía de Akt aún no está claro y si la señalización Akt proteínas interactúan directamente con UCA1, hay que demostrar aún más.
En resumen, nos fijamos en los elementos reguladores que participan directamente en la transcripción de genes UCA1 y encontró que la actividad del promotor de UCA1 se debe principalmente al sitio de unión Ets-2 dentro de la región promotora proximal. Hemos demostrado que el factor de transcripción Ets-2 puede unirse directamente a este sitio y es esencial para el control transcripcional de expresión UCA1. Además, nuestros resultados revelaron que UCA1 puede estar implicada en la regulación de la vía de Akt por Ets-2. Por lo tanto, concluimos que Ets-2 regula la expresión de UCA1, por otra parte lncRNA UCA1 puede estar implicada en la activación de la vía de señalización de Akt por Ets-2. Nuestros hallazgos abogan por una mayor investigación en este campo. Esta es una novela de campo con cada vez mayor importancia, en continuo. Se trata de una creciente importancia e interés para explorar la función y regulación de estos lncRNAs.
Apoyo a la Información
Figura S1.