Extracto
El factor nuclear (NF) -κB señalización es necesaria para el desarrollo de adenocarcinoma de pulmón en ratones, y los dos de su subunidades
Rel
a y
se informó de manera independiente sobre B Rel ser altamente expresado en el cáncer humano de pulmón no microcítico (CPNM). Para examinar exhaustivamente la expresión de NF-kB en el CPNM, se analizaron secciones seriadas de las muestras de tumor primario de 77 pacientes bien documentados (36 adenocarcinomas, 40 carcinomas de células escamosas y 3 carcinomas de células grandes) para la inmunorreactividad de
Rel
A,
Rel sobre B, P50, P52 y /P100. áreas tumorales y el estroma intratumoral se discrimina en base a la proliferación de inmunorreactividad antígeno nuclear de células y la infiltración inflamatoria se evaluó en áreas del estroma intratumoral. NF-kB inmunoreactividad se cuantificó la intensidad, la extensión y la localización nuclear y se le sometió a la proliferación celular tumoral, infiltración inflamatoria, y los datos clínicos-patológicos. Hemos encontrado que la expresión de las diferentes subunidades de NF-kB no era concordante, que justifica nuestro enfoque integral. En general,
Rel
A,
Rel sobre B, y P50 se expresaron en niveles más altos en comparación con P52 /P100. Sin embargo,
Rel
A y P50 se expresa predominantemente en el estroma intratumoral, pero
Rel Francia B en las células tumorales. Es importante destacar que el área del tumor
Rel
Una expresión se correlacionó con la intensidad de la infiltración inflamatoria, mientras que
Rel expresión del hotel B fue identificado en la proliferación de células tumorales. Mediante regresión logística múltiple, se identificó que el tumor
Rel expresión del hotel B fue un predictor independiente de metástasis en los ganglios linfáticos, y P50 tumor fue un predictor independiente de TNM6 estadio IIB o superior, mientras que el tumor
Rel
una era un predictor independiente de la infiltración inflamatoria. Llegamos a la conclusión de que los estudios patológicos de expresión de NF-kappa B en el cáncer deben incluir varios componentes de la vía. Utilizando este enfoque, hemos identificado asociaciones intrigantes entre distintas subunidades NF-kB y las características clínicas y patológicas de NSCLC
Visto:. Giopanou I, Lilis I, V Papaleonidopoulos, Marazioti A, Spella M, Vreka M, et Alabama. (2015) Evaluación Integral de patrones de expresión del factor nuclear-κΒ de células no pequeñas de cáncer de pulmón. PLoS ONE 10 (7): e0132527. doi: 10.1371 /journal.pone.0132527
Editor: P. Srikumar Chellappan, H. Lee Moffitt Centro de Cáncer & amp; Research Institute, Estados Unidos |
Recibido: March 3, 2015; Aceptado: 15 de Junio de 2015; Publicado: 6 Julio 2015
Derechos de Autor © 2015 Giopanou et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel y su archivo de información de apoyo
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por un Consejo Europeo de Investigación 2010 a partir del Investigador Independiente Grant (número de concesión#260524 al SMT; http://erc.europa.eu/KRAS mutación interacciones huésped-inmunidad maligno pleural-derrame). La fuente de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es uno de los cánceres más comunes en humanos y la principal causa de muerte en todo el mundo el cáncer [1]. El cáncer de pulmón se compone de dos tipos histológicos principales, carcinoma de pulmón de células pequeñas y carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), representando esta última más del 80% de los nuevos casos [2]. NSCLC representa un grupo diverso de histológicamente los tumores que se subclasifican en adenocarcinomas, carcinomas de células escamosas, y carcinomas de células grandes, que representan el 40, 30, y 10% de los nuevos casos de NSCLC, respectivamente [2]. El adenocarcinoma es el subtipo predominante con NSCLC creciente incidencia [3].
El factor nuclear de mamíferos (NF) -κB vía se compone principalmente de
Rel
A, C
Rel
,
Rel sobre B, NF-κB1 (P105 /P50), y NF-κB2 (P100 /P52) [4]. Estas proteínas ubicuas forman homo- o heterodímeros que residen en el citoplasma en una forma inactiva, unido a proteínas inhibidoras conocidas como inhibidores de NF-kappa B (ΙκΒ). Tras la estimulación, I? B se someten a la fosforilación de múltiples quinasas I? B (IKK; a, β, γ, ε, y otros), así como la ubiquitinación y la degradación proteolítica por el proteasoma y otras proteasas, para liberar activos subunidades NF-kB para la translocación nuclear y la activación de la transcripción de genes objetivo [5, 6]. Hay dos vías principales de NF-kB activación, el (o alternativas) canónica (o clásica) y no canónico, que son mediadas por
Rel
A /P50 o c-
Rel
/P50 y
Rel Francia B /dímeros P52, respectivamente [4-7]. Más recientemente, se dieron a conocer los mecanismos adicionales de la activación de NF-kappa B, incluyendo, pero no limitado al procesamiento inducible de P100 a P52 regulada por homodímeros IKK, aumentando aún más la complejidad del sistema [8]. la activación de NF-kB Canonical y /o alternativa se produce después de la estimulación celular por citoquinas, bacterias o virus, endotoxinas, estrés oxidativo, la irradiación, etc., y puede conducir a la diferenciación celular, la proliferación, la inhibición de la apoptosis, y /o la señalización inflamatoria [9] .
activación de NF-kappa B se ha identificado en varios cánceres humanos, incluyendo, pero no limitado a, linfoma, tumores colorrectales, de esófago y de carcinoma de cabeza y cuello, tumores de mama, carcinoma hepatocelular y cáncer de próstata [10 a 16] . Sin embargo, los estudios se han centrado casi exclusivamente en la vía canónica NF-kB, mientras que el papel de la alternativa de señalización NF-kB en la promoción y progresión del tumor sigue siendo oscura [17-19]. En NSCLC humano, aumentando nuclear
Rel
una inmunorreactividad se ha descrito con enfermedad progresiva [20]. Canónica de señalización NF-kB también se ha encontrado que es de suma importancia para la formación de tumores de pulmón en modelos de ratón de NSCLC inducidas por oncogénico
KRAS
G12D
y /o pérdida de los supresores de tumores
Trp53
y
GPRC5A
, la exposición al humo del cigarrillo, y el agente carcinógeno del tabaco uretano [21-25]. Sin embargo, otros estudios sugieren que la inducida por el microambiente tumoral constitutivo o la activación de NF-kB en el CPNM es más complejo y se basa en más de una vía [26-28].
Aquí nos dispusimos a probar esto usando análisis completos expresión de múltiples subunidad NF-kB de 77 pacientes bien documentados con NSCLC. Con este fin, hemos desarrollado un sistema de puntuación semicuantitativo subunidad NF-kB que tiene en cuenta tanto los niveles de expresión, así como la localización nuclear. Se identificaron consistentemente distintos patrones de expresión de la subunidad NF-kB en las células tumorales frente a estroma intratumoral y encontramos relaciones interesantes entre estos patrones y características clínico-patológicas de NSCLC humano. Por último, se recapitulan algunos de estos hallazgos en dos modelos diferentes de ratón de NSCLC, lo que indica que los patrones de activación de NF-kB divergentes son verdaderamente en juego en el CPNM y pueden tener diferentes funciones.
Materiales y Métodos
los pacientes
setenta y siete, muestras de tejido de archivos fijado en formol e incluidos en parafina de diagnóstico de los pacientes con CPNM que fueron sometidos a resección quirúrgica con intención curativa entre 2001 y 2008 en el hospital de la Universidad de Patras se inscribieron en el estudio de forma retrospectiva. Algunos de estos pacientes también habían sido estudiado en un informe previo de nuestra institución [28]. Los pacientes, todos de raza caucásica, 69 hombres y 8 mujeres con edades comprendidas entre 46 y 84 años, fueron cuidadosamente seleccionados en base a la disponibilidad de datos completos clínicos y patológicos extraídos de los informes de patología primaria y los archivos de los pacientes, incluyendo la edad, sexo, tipo histológico, grado y el estadio patológico detallada. Los pacientes seleccionados incluyeron 34 pacientes con adenocarcinomas de pulmón, 40 con carcinomas de células escamosas, y tres con carcinomas de células grandes. Todos los pacientes se clasifican de acuerdo a la sexta edición de la clasificación TNM para el NSCLC, vigente en el momento de su diagnóstico [29]. protocolo observacional del estudio se realizó de acuerdo con la Declaración de Helsinki, fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital de la Universidad de Patras, Grecia, y todos los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito.
Ratones
Experimentos fueron aprobadas a priori por la Administración Veterinaria de Grecia occidental (Protocolo Número: 276134/14873/2) y se llevaron a cabo de acuerdo con la Directiva 2010/63 /UE (http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do ? uri = DO: L: 2010: 276: 0033: 0079: ES: PDF). Para la tumorigénesis de pulmón KRAS impulsada mutante,
C57BL /6
ratones heterocigotos para el loxP-STOP-loxP.
KRAS
G12D se utilizaron transgén, que expresan mutantes del gen KRAS en cualquier célula somática tras la recombinación mediada por CRE (en lo sucesivo,
Lsk
ratones; Laboratorios Jackson, Bar Harbor, MN) [22]. Para la inducción de tumores de pulmón,
Lsk
ratones recibieron recombinante vectores de adenovirus que codifica la recombinasa CRE (Ad
Cre
; Baylor College of Medicine, Celular y Terapia Génica del Centro de Desarrollo Laboratorio de Vectores, Houston, TX) por vía intratraqueal (5x10
8 unidades formadoras de placas en 50 l de solución salina tamponada con fosfato) y se sacrificaron después de cuatro meses [30]. Para la tumorigénesis de pulmón inducido por productos químicos,
FVB
ratones (Jackson Laboratories, Bar Harbor, MN) recibió el uretano carcinógenos del tabaco por vía intraperitoneal (1 g /kg en 100 l de solución salina tamponada con fosfato) y se sacrificaron después de 6 meses [21 , 31]. pulmones de ratones se desangraron por 20 ml de solución salina infusión intracardiaca, se inflan con un 10% de formalina tamponada neutra utilizando 20 cm de H
2O presión, se fijaron en formalina% tamponada neutra, y fueron incluidos en parafina.
La inmunohistoquímica
bloques de tejidos humanos y de ratón se cortaron en secciones de 4 micras de espesor, que se deparaffinised posteriormente por el gradiente de etanol, rehidratada, y se hierve en una solución de recuperación de antígeno epítopo inducida por calor (citrato de sodio 0,1 M, pH = 6,0 ). La actividad peroxidasa endógena se inhibió utilizando 3% de H
2O
2 y la unión del anticuerpo-proteína no específica fue impedido el uso de un 3% de suero bovino-solución salina tamponada con Tris que contiene albúmina. Los siguientes anticuerpos primarios y las diluciones se utilizaron durante la noche a 4 ° C: anti-P50 (sc-114 policlonal de conejo IgG; 1/150; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti P100 /P52 (ab31409 policlonal de conejo IgG; 1 /150; Abcam, Cambridge, Reino Unido), anti-
Rel
A (monoclonal sc-8008 IgG de ratón; 1/200; Santa Cruz), anti-
Rel sobre B (sc-226 IgG policlonal de conejo; 1/400; Santa Cruz), y la proliferación de células anti-antígeno nuclear (PCNA; ab2426 policlonal de conejo IgG; 1/2000; Abcam). La detección de anticuerpos primarios se realizó utilizando un polímero conjugado con peroxidasa de rábano picante según las instrucciones del fabricante (EnVision; Dako, Glostrup, Dinamarca) y diaminobencidina como sustrato cromogénico. Las secciones fueron contrastadas con hematoxilina de Harris, deshidratado, y luego montadas. Para los controles de isotipo, se omitió el anticuerpo primario. tejido de las amígdalas normal se empleó como control positivo. Todos los anticuerpos fueron validados para inmunohistoquímica utilizando diluciones seriadas a partir de centésimas (excepto de PCNA donde diluciones comenzaron a 1/1000) y diferentes concentraciones de albúmina de suero bovino en solución salina tamponada con Tris siguiente o la modificación de las instrucciones del fabricante con el fin de maximizar la señal de relación de fondo. Inmunoreactividad fue marcado por tres cegado a los investigadores de casos (I.G., H. P., y G.T.S.) incluyendo uno patólogo certificado por el consejo Helénica (H. P.) y se buscó el consenso en los casos ambiguos por la co-observación. PCNA inmunoreactividad se define como el porcentaje de células positivas en las zonas tumorales, y se utilizó para discriminar estos (alto porcentaje de células inmunorreactivas) de las zonas de estroma intra-tumorales (bajo porcentaje de células inmunorreactivas). Las secciones fueron contadas a alta potencia (X400) y 5-8 campos al azar fueron evaluados para las células tumorales y de las zonas de estroma intratumoral, respectivamente. Mil núcleos de las células se contaron, respectivamente, y se registró el número de células que muestran tinción nuclear positiva. NF-κΒ subunidad inmunoreactividad se obtuvo como sigue: la intensidad (0: negativo; 1: débil; 2: moderado; y 3: fuerte), la extensión (0: & lt; 10% de células positivas; 1: 10-35% de células positivas; 2: 35-70% de células positivas; y 3: & gt; 70% de células positivas) y de distribución (0: negativo; 1: citoplasmática solo; 2: citoplásmicos y nucleares, y 3: nucleares solamente) de inmunoreactividad se puntuaron por separado para cada subunidad NF-κΒ para la muestra global, así como por separado para las células tumorales y el estroma intratumoral de cada tumor, y se combinaron en la subunidad específica general, tumor, y las puntuaciones del estroma usando la fórmula: NF-κΒ El marcador subunidad = (intensidad medida +) * distribución. puntuaciones de la subunidad NF-κΒ se clasifican además en baja (0-4), intermedia (5-6), y alta (7-18). infiltrados inflamatorios se determinaron semi-cuantitativamente utilizando muestras teñidas PCNA y de control de isotipo y se definió como bajo (& lt; 5%), moderada (5-20%) y alta (& gt; 20%) en función del porcentaje de leucocitos en áreas del estroma intratumoral. Este último se identificaron por la morfología y la falta de inmunorreactividad de PCNA. Las imágenes fueron tomadas usando un microscopio Axio en posición vertical Lab.A1 conectado a una cámara 5s AxioCam ERc (Zeiss, Jena, Alemania). Por inmunofluorescencia, las secciones de tejido se incubaron simultáneamente con anti-PCNA (ya sea ab2426 IgG policlonal de conejo; dilución 1/100; Abcam para collocalization con
Rel
A o sc-56 IgG de ratón monoclonal; dilución 1/100; de Santa Cruz de collocalization con
Rel Francia B) y, o bien anti-
Rel
a (monoclonal de ratón sc-8008 IgG; dilución 1/100; Santa Cruz) o anti-
Rel
B (sc-226 policlonal de conejo IgG; 1/100 de dilución; Santa Cruz) anticuerpos como anteriormente, seguido de la contratinción nuclear con Hoechst 33258 (Molecular Probes, Eugene, OR). La detección de anticuerpos primarios se realizó utilizando conjugado-Alexa568 burro anti-conejo (A10042; 1/500 de dilución; Invitrogen, Carlsbad, CA) y de burro anti-ratón conjugado con Alexa488 (A21202; 1/500 de dilución; Invitrogen, Carlsbad, CA) anticuerpos secundarios. Para los controles de isotipo, cualquiera o ambos anticuerpos primarios se omitieron. Inmunoreactividad fue capturado en un microscopio invertido Zeiss Axio Observer.D1 conectado a una cámara AxioCam MRC 5 (Zeiss, Jena, Alemania) y fue co-Fiji registrado utilizando software gratuito de imágenes académica (http://fiji.sc/Fiji).
Estadísticas
Los valores de probabilidad (
P
) inferior a 0,05 se consideraron significativos. puntajes humanos subunidad NF-κΒ no se distribuyen normalmente, según las pruebas realizadas por la prueba de Kolmogorov-Smirnov (
P Hotel & lt; 0,05), y se muestran en los gráficos de barras como mediana con cajas que indican rango intercuartil y bigotes que indica 95% percentiles. Emparejados numéricos subunidad puntuaciones de NF-κΒ de los mismos tumores se compararon mediante pruebas de Friedman, seguido de post-test de Dunn. Categóricas puntuaciones de la subunidad NF-κΒ se compararon mediante χ
2 pruebas seguidas por la prueba exacta de Fisher. Las correlaciones entre numéricos subunidad puntuaciones de NF-κΒ y datos clínico patológico se realizaron utilizando pruebas de Spearman, con lo que el mínimo total de la significación estadística (
P
& lt; 0,05) se ajustó con el número total de las correlaciones examinadas (n = 153) por el método de Bonferroni para
P
& lt; 0,05 /153 = 0,000327. Las comparaciones de las puntuaciones numéricas de la subunidad NF-κΒ por el grado de infiltración inflamatoria y categorías clínico patológico se realizaron utilizando el signo de Wilcoxon rango pruebas o pruebas de Kruskal-Wallis seguido por el post-test de Dunn, de dos o múltiples grupos de comparación, respectivamente. Para determinar si las puntuaciones numéricas de la subunidad NF-κΒ predicen de forma independiente las variables clínico-patológica, este último se dicotomizaron por su mediana y análisis de regresión logística binaria se llevaron a cabo utilizando el método Waldman hacia atrás. Para ello, las puntuaciones de la subunidad NF-κΒ se utilizaron como entrada (variables independientes) y las variables clínico-patológicas y anota infiltración inflamatoria como la salida (variables dependientes). Ratón NF-κΒ subunidad puntuaciones en etapas progresivas de la carcinogénesis se presentan como media ± desviación estándar y se compararon mediante ANOVA de dos vías seguido de Bonferroni post-test. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando Prism v5.0.0 (GraphPad, San Diego, CA) y el paquete estadístico para el V20 Ciencias Sociales (IBM SPSS Statistics, Chicago, IL, EE.UU.).
Resultados
NF-κΒ patrones de expresión de la subunidad en NSCLC
las características clínicas y patológicas de los pacientes del estudio se resumen en la Tabla 1. los resultados del estudio primas se anexan a este artículo como el cuadro S1. Primero examinamos la expresión de la subunidad NF-κΒ en las zonas pulmonares normales adyacentes a nuestras muestras de tumor resecado quirúrgicamente. En bronquial y epitelio alveolar,
Rel
A, P50 y P100 /P52 exhibieron inmunoreactividad citoplasmática bajo o moderado, mientras que
Rel Francia B muestra mayores niveles de expresión. En bronquiales y alveolares hiperplasias yuxtaóseo tumoral, inmunoreactividad para todas las subunidades NF-kB mostró un patrón de expresión más fuerte, con
Rel sobre B que muestra la localización tanto citoplasmática y nuclear. En los tumores, todas las subunidades NF-kB fueron altamente expresado en relación a las áreas normales y hiperplásicas, con
Rel Francia B y asegurar la más alta y que muestra el mayor grado de localización nuclear. Sin embargo,
Rel
A,
Rel sobre B, y inmunorreactividad P50 fue más fuerte en comparación con P100 /P52 (Fig 1A y 1B). Cuando las puntuaciones de la subunidad NF-kB se subdividieron en baja (0-4), intermedia (5-6) o alta (7-18), hay una relación evidente entre las diferentes subunidades (Figura 1C). No se observaron diferencias estadísticamente significativas entre los diferentes subtipos histológicos de NSCLC. Sin embargo, se observaron diferencias estadísticamente significativas en la NF-kB los niveles de expresión de la subunidad dentro de cada tumor: áreas tumorales muestran diferentes patrones de expresión en comparación con áreas intratumorales estroma (Figura 1A, paneles de representación en marco rojo). Estos resultados sugieren que múltiples subunidades NF-κΒ se sobreexpresa progresivamente en NSCLC, mostraron que no todas las subunidades NF-κΒ se expresan igualmente, e identificaron una discordancia en la expresión de múltiples subunidades de NF-κΒ entre tumor y áreas del estroma intratumorales, garantizando una mayor investigación .
(A) imágenes representativas. Imágenes en marcos rojos muestran de forma representativa expresión diferencial subunidad NF-kB en el tumor y el estroma áreas intratumorales. (B) puntuación global de NF-kB los niveles de expresión de la subunidad. Los datos presentados como mediana con cajas que indican rango intercuartil y bigotes que indican los percentiles 95%. ns, * y ***: P & gt; 0,05, P & lt; 0,05 y P & lt; 0,001 para las comparaciones indicadas por el test de Friedman, seguido de post-test de Dunn. (C) las matrices de co-expresión de categóricos NF-kB los niveles de expresión de la subunidad. Para ello, el NF-kB puntuaciones de (B) se clasificaron en bajo (0-4), intermedia (5-6), y alta (7-18). ns: p & gt; 0.05 por χ
2 pruebas seguidas por la prueba exacta de Fisher.
Expresión diferencial de NF-κΒ en compartimentos de tumores del estroma y de NSCLC
Para estudiar esto con más detalle , todas las muestras fueron teñidas con PCNA, que identifica claramente áreas tumorales (alta abundancia de PCNA + células) desde el compartimiento estroma intratumoral (muy baja abundancia de PCNA + células), y NF-kB de puntuación subunidad se repitió por separado para estas dos áreas en las secciones de serie de todos los pacientes (Fig 2A). Estos análisis revelaron que
Rel Francia B fue la subunidad expresó el más fuerte en áreas de células tumorales que presentan un patrón de expresión tanto nuclear y citoplasmática. Por otro lado, las subunidades restantes estudiados mostraron única expresión citoplasmática moderada en áreas tumorales (Fig 2A y 2B). Cuando compartimiento tumoral NF-kB puntuaciones de las subunidades se subdividieron en baja (0-4), intermedia (5-6) o alta (7-18) y se compararon dentro de cada tumor,
Rel Francia B y P50 mostraron significativa discordancia, con tumores con fuerte
Rel Francia B inmunoreactividad que presentan puntuaciones bajas P50 (figura 2C). Sorprendentemente, la evaluación exclusivamente del estroma intratumoral produjo resultados diferentes: aquí,
Rel
subunidades A y P50 se expresaron más predominantemente en los núcleos de las células del estroma. En marcado contraste,
Rel Francia B y P100 /P52 mostraron ser débil inmunorreactividad citoplásmica (Figura 2A y 2D). Cuando estroma NF-kB puntuaciones de las subunidades se subdividieron en baja (0-4), intermedia (5-6) o alta (7-18) y se compararon dentro de cada tumor,
Rel Francia B y P100 /P52 mostraron concordancia significativa, con 49/77 tumores se presentan las puntuaciones bajas de forma simultánea para las dos subunidades, que probablemente refleja los bajos niveles de expresión de ambas proteínas (figura 2E). Finalmente se analizaron las relaciones entre numéricos y categóricos de tumores del estroma y las puntuaciones para cada subunidad NF-kB, encontrando que sólo P100 /P52 expresión en el tumor y el estroma relacionados fueron concordantes y correlacionados (Figura 2F y 2G).
(A) imágenes representativas. (B, D) La puntuación de NF-kB en los niveles de expresión de la subunidad del tumor (B) y áreas del estroma (D). Los datos presentados como mediana con cajas que indican rango intercuartil y bigotes que indican los percentiles 95%. ns y ***: P & gt; 0,05 y P & lt; 0,001 para las comparaciones indicadas por el test de Friedman, seguido de post-test de Dunn. (C, E) Co-expresión matrices de categóricos NF-kB los niveles de expresión de la subunidad en tumor (C) y las zonas de estroma (E). Para ello, el NF-kB puntuaciones de (B) y (D) se clasificaron en bajo (0-4), intermedia (5-6), y alta (7-18). ns: p & gt; 0,05 y P: probabilidad valores de χ
2 pruebas seguidas por la prueba exacta de Fisher. (F) co-expresión matrices de tumor frente estroma expresión de la subunidad NF-kB. ns: p & gt; 0,05 y P: probabilidad valores de χ
2 pruebas seguidas por la prueba exacta de Fisher. (G) La correlación de las puntuaciones de tumores y de expresión /P52 P100 estroma. Que se muestran son los puntos de datos, línea de regresión lineal con intervalo de confianza del 95%, al cuadrado coeficiente de correlación de Spearman, y el valor de probabilidad.
Correlación de la expresión de la subunidad Rel con la proliferación celular y la infiltración inflamatoria
Desde NF-kB está implicado de manera mecánica en la proliferación y señalización inflamatoria de las células tumorales de pulmón en modelos de ratones [21-24], hemos tratado de determinar el grado de proliferación celular y la infiltración inflamatoria en nuestros 77 pacientes con NSCLC. Para ello, las secciones de serie se sometieron a inmunotinción PCNA como arriba, con tinción de hematoxilina simultánea de secciones de control de isotipo, y el porcentaje de células PCNA positivas en las zonas tumorales se evaluó como una medida de la tasa de proliferación celular. Además, se determinó el porcentaje de células inflamatorias PCNA-negativo tumor infiltrante en las zonas de estroma para cada paciente (Fig 3A). Estos análisis identificó que, aunque los niveles de expresión de
Rel
A en áreas tumorales eran bastante bajos, que se incrementaron en los tumores con altos niveles de infiltración inflamatoria (Figura 3B). Además, si bien el porcentaje de células PCNA positivas no fue diferente entre los diferentes subtipos histológicos (figura 3C), y no se asoció con la expresión de cualquier subunidad NF-kappa B (datos no mostrados), de doble inmunofluorescencia para
Rel
a o
Rel Francia B combinan con PCNA revelaron que las células en proliferación PCNA + expresan predominantemente
Rel Francia B en su núcleo (Fig 3D). Estos datos indican que el tumor
Rel
Una expresión se asocia con infiltración inflamatoria y tumoral que
Rel expresión del hotel B se relacionó con la proliferación celular dentro de cada tumor. Desde
Rel expresión del hotel B se ha encontrado para ser regulados tanto por el canónico, así como las vías alternativas de NF-kappa B, el próximo tratado de examinar una posible correlación entre
Rel
Una expresión en el tumor o compartimentos del estroma, y
Rel
B expresión en las células tumorales. Sin embargo, se encontró una correlación estadísticamente significativa cuando se evaluaron los datos, ya sea en una o paramétrica de una manera no paramétrica, lo que sugiere que el tumor
Rel
A y
Rel expresión del hotel B ocurren de forma independiente en el CPNM.
(A) imágenes representativas de las muestras con hematoxilina-manchada que muestran diferentes grados de infiltración inflamatoria de las áreas del estroma. (B) NF-kB expresión de la subunidad decenas de tumores con diferentes grados de infiltración inflamatoria. Los datos presentados como mediana con cajas que indican rango intercuartil y bigotes que indican los percentiles 95%. ns, **, y ***: P & gt; 0,05, P & lt; 0,01 y P & lt; 0,001 para las comparaciones indicadas por Kruskal-Wallis seguido de pruebas post-test de Dunn. (C) Imágenes representativas de las muestras del subtipo de NSCLC PCNA-manchado. (D) Nuclear co-localización de la inmunorreactividad de PCNA con
Rel
B (flechas), pero no con
Rel
A, se identificó utilizando la doble inmunotinción de muestras de 10 pacientes (imágenes representativas mostrados) .
Asociación de expresión de la subunidad NF-κΒ con características clínicas y patológicas de NSCLC
a continuación examinó si la expresión de la subunidad NF-kB en los compartimentos de tumores del estroma y se correlaciona con clínica y patológica características de nuestros pacientes con NSCLC. Para ello, se realizaron análisis de correlación, que reveló asociaciones significativas (datos no mostrados). puntuaciones de NF-kB se subdividen de acuerdo con las características clínicas y patológicas y subgrupos se compararon (Figura 4A). La puntuación estroma de P100 /P52 fue significativamente menor en tumores bien diferenciados, en comparación con los de baja o moderadamente diferenciados. Además, la expresión /P52 estromal P100 se disminuyó en pacientes con enfermedad N2, en comparación con los pacientes sin afectación linfática. No se identificaron otras diferencias significativas en cuanto a la expresión del estroma intratumoral de cualquier otra subunidad. Cuando la zona del tumor puntuaciones de NF-kB se examinaron esta manera,
Rel
A se encontró que se expresa en niveles más altos en los hombres en comparación con las mujeres, en pacientes mayores de 65 años en comparación con los más jóvenes, y en pacientes con escamosas carcinoma de células en comparación con adenocarcinoma. Es importante destacar que las puntuaciones P50 tumorales fueron elevados en los pacientes con enfermedad N2 y pTNM6 fase III en comparación con los pacientes sin afectación linfática y la enfermedad en estadio II, respectivamente. Por último, la expresión tumoral P100 /P52 fue estadísticamente significativamente mayor en los pacientes con estadio II de la enfermedad pTNM6 en comparación con los pacientes con enfermedad en estadio I. En un tercer nivel de las investigaciones, las características clínicas y patológicas de NSCLC se dicotomizaron por su mediana y se introdujeron como dependientes en los análisis de regresión logística binaria, utilizando las puntuaciones de NF-kappa B tumorales y estroma como las variables (independientes) de entrada (figura 4B). Estos análisis revelaron que el tumor
Rel
Un marcador era un predictor independiente de 65 años o más, de histología escamosa, y de la infiltración inflamatoria. Curiosamente, el tumor de estroma y
Rel expresión del hotel B fueron identificados como predictores positivos y negativos de la afectación ganglionar, respectivamente. Por último, se encontró que la puntuación P50 tumor para ser un predictor independiente de mal diferenciación y pTNM6 estadio IIB o superior. Por tanto distinto subunidad NF-kB (
Rel Francia B y P50, pero no
Rel
A) expresión se asocia con la enfermedad avanzada, y distintas subunidades NF-kB se relacionaron con las características definidas de NSCLC, validar nuestro enfoque integrado.
(A) NF-kappa B niveles de expresión subdivididos por parámetros clínicos y patológicos. Los datos presentados como mediana con cajas que indican rango intercuartil y bigotes que indican los percentiles 95%. ns, * y **: P & gt; 0,05, P & lt; 0,05 y P & lt; 0,0501 para las comparaciones indicadas por signos de Wilcoxon rango pruebas o pruebas de Kruskal-Wallis seguido por el post-test de Dunn, de dos o múltiples grupos de comparación, respectivamente. (B) Los resultados de los análisis de regresión logística binaria utilizando NF-kB expresión de la subunidad puntuaciones como la entrada (variables independientes) y los parámetros clínicos y patológicos en dicotomía como la salida (variables dependientes). RR, los cocientes de riesgos; CI, intervalos de confianza; P, los valores de probabilidad.
expresión de la subunidad NF-κΒ en modelos de ratón de NSCLC
Por último, buscamos para verificar si nuestros hallazgos también podrían recapitulan en dos modelos diferentes de ratón de NSCLC humano , es decir, el modelo de adenoma pulmonar inducida uretano y del mutante
KRAS
adenocarcinoma pulmonar inducida. Los análisis, realizados como para muestras humanas, identificadas que
Rel sobre B se sobreexpresa en las lesiones hiperplásicas de uretano inducida, pero no en los adenomas. Por otra parte,
Rel sobre B se sobreexpresa en tanto mutante
KRAS
inducida por lesiones hiperplásicas y adenocarcinomas (figura 5). Estos resultados fueron consistentes con los datos que muestran la sobreexpresión humanos focal de
Rel Francia B en las zonas tumorales de NSCLC humano (figura 2).
expresión de la subunidad NF-kB se evaluó por inmunohistoquímica en uretano inducida adenomas pulmonares de ratones (A y C) y mutante
KRAS
adenocarcinomas de pulmón inducida por (B y D). (A, B) Imágenes representativas. (C, D) de puntuación global de NF-kB los niveles de expresión de la subunidad de cuatro ratones por grupo. Los datos presentados como media ± DE. ** Y ***: P & lt; 0,01 y P & lt; 0,001 para la subunidad codificada por colores indicada en comparación con bronquial normal y epitelio alveolar por ANOVA de dos vías seguido de Bonferroni post-tests. comparaciones no significativas no están indicados.
Discusión
En el presente estudio, se caracterizó la expresión y la localización subcelular de varias subunidades NF-kB en NSCLC humanos y modelos experimentales de la enfermedad. Encontramos diferentes patrones de inmunorreactividad para cada una de las subunidades estudiadas, lo que justifica nuestro enfoque integrado. En concreto,
Rel Francia B fue altamente expresado en las células tumorales, mientras que
Rel
A y P50 en las células del estroma. Curiosamente, tumor
Rel
Una expresión se correlaciona con la infiltración inflamatoria y tumoral
Rel expresión del hotel B se collocalized con la proliferación de núcleos de células tumorales. Estos resultados fueron consistentes con los análisis de regresión logística binaria, que reveló que el tumor
Rel
Una expresión era un predictor independiente de infiltrados inflamatorios, mientras que el tumor
Rel Francia B inmunorreactividad predijo una enfermedad más avanzada con afectación ganglionar. Por último, este patrón de predominio
Rel expresión del hotel B de CPNM se recapitula en modelos de ratón de la enfermedad. En conjunto, nuestros resultados indican una activación multimodal de NF-kB en el CPNM y, posiblemente, sugieren funciones divergentes de
Rel
A y
Rel Francia B en la conducción de la inducción de la inflamación y paracrina de células autónomas o la promoción de la proliferación celular autocrino, respectivamente (figura 6).
NF-kB los niveles de expresión de la subunidad en células tumorales y el estroma de 77 pacientes con CPNM se indican con el tamaño de fuente relativo.