Extracto

Los pacientes con reordenamientos del gen ALK menudo respuestas dramáticas se manifiestan a crizotinib, un inhibidor de ALK. La identificación precisa de los pacientes con cáncer no microcítico de pulmón de células ALK-positivo (CPNM) es esencial para la aplicación clínica de la terapia ALK-dirigida. Sin embargo, la evaluación de
EML4-ALK
reordenamiento en el CPNM sigue siendo un reto en la práctica la patología de rutina. El objetivo de este estudio fue comparar la precisión diagnóstica de FISH, inmunohistoquímica (IHC), y en tiempo real RT-PCR cuantitativa (qPCR) metodologías para la detección de
EML4-ALK
reordenamiento en el CPNM y para valorar la inmunohistoquímica como una herramienta de selección previa. En este estudio, un total de 473 muestras de NSCLC en parafina procedentes de resecciones quirúrgicas y biopsias fueron analizados por IHC con anticuerpos ALK.
ALK
reordenamiento fue confirmado por FISH y QPCR. expresión de la proteína ALK se detectó en veinte pacientes (20/473, 4,2%). De los 20 casos de ALK-positivo por IHC, 15 casos fueron confirmados como
ALK
reordenamiento por FISH, y 5 casos no eran interpretables. Además, se evaluaron 13 de los 20 tejidos IHC-positivos por qPCR en el añadido en el pescado, y se encontró que 9 casos fueron positivos y 2 casos fueron equívocos, mientras que 2 casos fueron negativos a pesar de que fueron positivas tanto por IHC y FISH. El estado de ALK fue concordante en 5 de los 8 casos que eran interpretables por los tres métodos. Además, ninguno de los 110 casos de IHC-negativas con histología de adenocarcinoma mostró
ALK
reordenamientos por los peces. Histológicamente, casi todos los casos
ALK
-rearranged fueron adenocarcinoma, excepto que era un caso de carcinoma sarcomatoide. Un patrón de células en anillo de sello sólido o patrón cribiforme mucinoso se presentó al menos focalmente en todos los tumores ALK-positivo. En conclusión, nuestros hallazgos sugieren que
ALK
reordenamiento se asoció con la expresión de proteína ALK. La IHC ensayo convencional es una herramienta valiosa para la preselección de los pacientes con
ALK
reordenamiento en la práctica clínica y una combinación de FISH y QPCR se requiere para la confirmación adicional

Visto:. Zhang YG , Jin ML, L Li, Zhao HY, Zeng X, Jiang L, et al. (2013) Evaluación de
ALK
Reordenamiento en chino de células no pequeñas cáncer de pulmón mediante FISH, inmunohistoquímica y la Real-Time PCR cuantitativa RT- en tejidos embebidos en parafina. PLoS ONE 8 (5): e64821. doi: 10.1371 /journal.pone.0064821

Editor: Pan-Chyr Yang, el Hospital de la Universidad Nacional de Taiwán, Taiwán

Recibido: 23 Noviembre 2012; Aceptado: 18 de abril de 2013; Publicado: 31 de mayo de 2013

Derechos de Autor © 2013 Zhang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (NO.81050015). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

el cáncer de pulmón sigue siendo la causa principal de muerte relacionada con el cáncer en todo el mundo [1], [2], a pesar de las mejoras en los métodos de detección y tratamientos. Entre el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), que representa aproximadamente el 85% de todos los cánceres de pulmón, adenocarcinoma es el tipo más común de cáncer de pulmón en hombres y mujeres [2]. Actualmente, los esfuerzos se dedican al desarrollo de moléculas contra objetivos específicos para determinados tipos de tumores. Con la mejora continua en nuestra comprensión de las bases moleculares del cáncer de pulmón, se están evaluando o se desarrolla una serie de terapias dirigidas para el NSCLC. Estas terapias incluyen inhibidores de la angiogénesis e inhibidores de transducción de señalización, tales como el receptor del factor de crecimiento epitelial (EGFR) terapias -targeted [3]. Por lo tanto, la identificación de los oncogenes clave para el cáncer de pulmón es un paso muy importante hacia el desarrollo de agentes de metas moleculares novedosas.

Recientemente, la activación del linfoma anaplásico de quinasa (ALK) de genes en el cáncer de pulmón mediante la fusión de asociada a los microtúbulos equinodermo proteínas términos comparables4 (EML4) u otros socios de genes (por ejemplo,
TFG
y
KIF5B
) ha informado [4], [5], [6]. El gen ALK se caracterizó inicialmente como un compañero de fusión del oncogén NPM-ALK en linfoma anaplásico de células grandes [7], y ahora es reconocido como el componente activo en múltiples proteínas de fusión en una variedad de tipos de cáncer [8]. ALK es un receptor transmembrana con actividad de tirosina quinasa que pertenece a la superfamilia de receptores del factor de crecimiento de insulina, que está codificada en el cromosoma 2 (2p23). Los diversos socios de fusión de ALK median dimerización independiente de ligando de ALK, lo que resulta en la actividad quinasa constitutiva, y por lo tanto transmite señales anti-apoptóticas y la proliferación celular a través de KRAS y las vías PI3K [8]. En NSCLC, la activación aberrante de ALK contribuye a la carcinogénesis de pulmón después de haber sido condensado con un número de otros socios de genes, más frecuentemente asociada a microtúbulos equinodermos proteína 4 (
EML4
). EML4 gen se localiza en el cromosoma 2 (2p21) y está orientado en sentido inverso con
ALK
.
EML4-ALK
fusión podría ocurrir después de una escisión del cromosoma en un sitio variable y la inversión de los cromosomas, dando lugar a diferentes isoformas de fusión [9].
EML4-ALK
fusión se produce de una manera mutuamente exclusiva con
EGFR
o
KRAS mutaciones
y casi exclusivamente en el adenocarcinoma. La presencia de
EML4-ALK
es más probable en pacientes con ciertas características demográficas, como el estado de no haber fumado nunca o menor edad [10]. La mayoría de los estudios han descubierto esta anormalidad genética a un ritmo de 2-5% en la población general de pacientes con NSCLC [11], [12], [13], [14].

En los ensayos clínicos previos, crizotinib, un inhibidor de la quinasa de doble ALK /MET, ha demostrado ser dramáticamente eficaz en pacientes con CPNM albergar reordenamientos del gen ALK [15]. Crizotinib fue aprobado recientemente por la FDA de Estados Unidos para el tratamiento de avanzada
ALK-positivo
NSCLC identificado por hibridación in situ fluorescente (FISH) [16]. Para garantizar la identificación de pacientes con más probabilidades de beneficiarse de crizotinib, es vital para desarrollar métodos de diagnóstico robusto y fácil de detectar reordenamiento del gen ALK para el cribado de pacientes para el tratamiento con crizotinib. Aunque ALK FISH se ha convertido en el estándar de oro para la detección de
ALK
reordenamiento en el CPNM, puede ser técnicamente difícil y costoso. Por lo tanto, otras modalidades de diagnóstico aún no se han explorado, incluyendo inmunohistoquímica (IHC) y la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR). RT-PCR es una técnica altamente sensible para la detección y cuantificación de ARN para
EML4-ALK
. También es capaz de escribir el
EML4-ALK
variante mediante secuenciación del producto de PCR. Sin embargo, debido a esta metodología puede no identificar nuevos reordenamientos de no caracterizado previamente
EML4-ALK
variantes o parejas de fusión desconocido y su proceso pueden estar contaminados con facilidad, su sensibilidad y especificidad aún no se han validado. IHC tiene la ventaja de ser ampliamente disponible, relativamente fácil de realizar y conserva la información morfológica, lo que permite la evaluación de confianza de genes aberrantes en las células tumorales. Por esta razón, ALK IHC parece adecuado para una proyección a gran escala de los pacientes con
ALK-positivo
NSCLC.

El principal desafío para el uso de ALK IHC es a menudo la expresión de bajo nivel de ALK proteínas de fusión en
ALK
-rearranged NSCLC [16], lo que hace necesario el desarrollo de métodos basados ​​en IHC más sensibles. Varios anticuerpos ALK se han reportado en estudios recientes que demuestran que IHC tiene alta concordancia con FISH ALK, incluyendo el anticuerpo monoclonal ALK1 de DAKO [17], el anticuerpo monoclonal 5A4 de Novocastra [18], y D5F3 anticuerpo monoclonal desarrollado por Cell Signaling Technology [19] . Sin embargo, se requieren estudios a gran escala para validar más concordancia entre IHC y FISH, y el desarrollo y evaluación de nuevos anticuerpos con alta especificidad y sensibilidad para proteínas de fusión ALK sería muy bienvenido.

En este estudio, se examinado el reordenamiento del gen ALK mediante inmunohistoquímica en muestras clínicas de NSCLC, y se correlacionaron los resultados con los obtenidos por FISH y QPCR. Además, se investigó las características clínico-patológicas de NSCLC con reordenamientos del gen ALK. El presente estudio tuvo como objetivo identificar la información útil para predecir el reordenamiento del gen ALK y determinar un procedimiento de diagnóstico que pueden realizarse en la práctica habitual.

Materiales y Métodos

Pacientes y muestras

este estudio se realizó con la aprobación del Comité de Ética del hospital clínico de Beijing Chao-Yang, de la Universidad médica de capital. Todos los pacientes procuraron su consentimiento escrito. tejidos incluidos en parafina de archivos fijado en formol se obtuvieron de 473 pacientes que habían sido sometidos a un tratamiento de cáncer de pulmón primario entre 2006 y 2011 en el Hospital Chao-Yang de la Universidad Médica de Beijing Capital en China. Los casos se seleccionaron al azar entre los pacientes con diagnóstico de NSCLC mediante el examen histológico de las muestras obtenidas por resección quirúrgica y la biopsia. Ninguno de los pacientes habían recibido quimioterapia antes de la cirugía y la biopsia. Para todos los casos, se revisó la edad al momento del diagnóstico, el sexo, los antecedentes de tabaquismo, y la localización del tumor primario, que se obtuvieron de los registros médicos. De acuerdo con the7th manual de estadificación TNM edición de cáncer de pulmón publicado por la AJCC en 2010, se revisaron todos los casos y por etapas. Todos los cortes histológicos disponible de cada caso se evaluaron de nuevo, y el tipo histológico y el grado de diferenciación se confirmaron de acuerdo con los criterios de la Clasificación Mundial de la Salud Organización de los tumores de pulmón y el ERS /ATS /IASLC clasificación multidisciplinar de adenocarcinoma de pulmón [20]. Para cada caso, el bloque de tejido representativa que contiene las células tumorales más viables fue seleccionado por dos patólogos. La etapa de la enfermedad fue postoperatoria estadio patológico. Las enfermedades de la etapa IV incluyen los casos que recibieron las biopsias de pulmón abierto o cirugía toracoscópica asistida por video para el diagnóstico. Los datos clínico-patológicos se resumen en la Tabla 1.

Detección inmunohistoquímica con ALK

En cada caso, un representante fijado en formol e incluido en parafina (FFPE) bloque de tejido se eligió y se seccionó en espesor 4-m para inmunotinción. En pocas palabras, después de la desparafinación y rehidratación, los portaobjetos se calentaron durante la recuperación de antígenos en la olla a presión durante 3 minutos a 100 ° C en 0,01 mol /L de tampón Tris-EDTA (pH 9,0). actividad de la peroxidasa endógena fue bloqueada por incubación de las diapositivas de peróxido de hidrógeno al 3% en metanol absoluto durante 15 minutos, y la unión no específica fue bloqueada con suero de cabra al 10% durante 15 minutos. Un anticuerpo monoclonal de conejo para ALK (Clone SP8; Thermo Fisher Scientific, Fremont CA, EE.UU.) se utilizó como anticuerpo primario a una dilución de 1:100. Después de la incubación durante la noche con el anticuerpo ALK a 4 ° C, los portaobjetos se incubaron con un anticuerpo anti-conejo, el rábano picante marcada con peroxidasa polímero anticuerpo secundario de la DAKO Envision + ™ System (Dako Corporation). La inmunorreactividad se visualizó con 3,3'-diaminobencidina (Dako Corporation, Carpinteria, CA). Por último, las secciones se contratiñeron con hematoxilina y se montaron. secciones de control positivos de los casos de LACG ALK-positivo conocido se incluyeron en cada lote de tinción. tejido del ganglio linfático normal se utilizó como control negativo. Para el control en blanco, todas las etapas de incubación fueron idénticas excepto que el suero de conejo IgG no inmune se utilizó en lugar del anticuerpo primario (ALK).

Hemos determinado los criterios de puntuación en una evaluación preliminar usando un microscopio de múltiples cabezas con el fin de llegar a un consenso. tinción resultados fueron interpretados por dos de los autores de forma independiente, sin conocimiento previo de los parámetros clínico. casos discordantes fueron revisados ​​y acordados antes de que los datos fueron analizados estadísticamente. Para cada muestra, se analizaron al menos cinco campos (x400) y más de 500 células. Para las manchas de ALK, solamente inequívoca tinción citoplásmica se consideró como reacción positiva. El número de células immunopositive se estimó de forma semicuantitativa: no hay células positivas (-); & Lt; 50% de las células tumorales tinción positiva (+); 50% -75% de las células tumorales tinción positiva (++); & Gt;. 75% de las células tumorales tinción positiva (+++) La intensidad de la tinción se clasificó en una escala de 0 a 3+ (0, negativo; 1+, débil; 2+, moderada; 3+, intenso), de manera similar a los protocolos descritos anteriormente [17], [18].

la hibridación in situ con fluorescencia (FISH)

FISH se realizó en, embebidos en parafina (FFPE) los tejidos tumorales fijados en formalina utilizando el Vysis LSI ALK color dual, Separar Reordenamiento de la sonda (Abbott Molecular, Abbott Park, Illinois, EE.UU.). La sonda conjunto ruptura aparte ALK incluye dos sondas de ADN marcadas con Spectrum Spectrum naranja y verde, respectivamente, que se hibridan a la banda 2p23 en lados opuestos que flanquean el punto de interrupción del gen ALK. El ensayo se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, las secciones de 4 micras de espesor a partir de bloques de tejido FFPE fueron desparafinados y deshidratados, a continuación, las secciones fueron tratadas con el reactivo Vysis pretratamiento (Abbott Molecular) y se hizo reaccionar con una solución de proteasa (Abbott Molecular). La mezcla de sondas de ruptura aparte ALK se aplicó a todo el tejido, y fueron co-desnaturalizado a 73 ° C durante 3 minutos. Los portaobjetos se hibridan durante la noche en una cámara húmeda a 37 ° C. Después del lavado, los núcleos se contratiñeron con 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Las secciones se analizaron bajo un microscopio de fluorescencia equipado con un filtro de paso triple (DAPI /verde /naranja). Un análisis repetidos de algunas muestras se llevó a cabo debido a pobres señales de hibridación y /o la mala morfología de los tejidos. Los portaobjetos de control positivo y negativo se incluyeron en cada ejecución de la prueba FISH.

FISH Interpretación

De acuerdo con las especificaciones del fabricante, se evaluaron las diapositivas pescado sin conocimiento de los resultados de IHC para ALK. Los dos técnicos analizaron cada diapositiva FISH, la exploración de la sección de tejido entero y anotando 50 núcleos representativos, que fueron claramente identificados, y contenían señales inequívocas. Los núcleos que contienen señales de un solo color no debe ser enumerado. Los resultados de cada técnico no se combinaron hasta la finalización del estudio para minimizar cualquier sesgo en la puntuación. La célula fue considerada como positiva, cuando un núcleo tenido al menos un conjunto de señales rotas aparte, o tuvo una sola señal roja (señal verde suprimido) además de las señales fusionadas y /o rotos a pedazos. La distancia entre dos señales rojas y verdes separada se calcula utilizando los dos momentos de mayor tamaño de la señal. Las muestras se consideraron positivas si más de 25 de cada 50 células tumorales fueron positivas, y negativo si menos de 5 células tumorales fueron positivas. La muestra con 5-25 células tumorales positivas se consideró equívoca, y después fue evaluado por un segundo técnico. se añadieron juntos Las primera y segunda lecturas de recuento de células y se calculó un porcentaje de 100 células. Si el porcentaje promedio de las células positivas fue del 15% o más, la muestra se consideró positiva. De lo contrario, se consideró negativa para
ALK
reordenamiento.

Real-time RT-PCR cuantitativa (qPCR)

ARN total fue extraído de las secciones de tejido FFPE recién cortadas utilizando el kit RNeasy (Qiagen). En pocas palabras, el área del tumor fue identificado mediante la tinción y el tejido hematoxilina-eosina de esta zona en secciones no teñidas fue raspada para la extracción de RNA. Después de desparafinación y lisis pasos, el RNA total se purificó con una columna de centrifugación RNeasy MinElute. El ADN genómico se eliminó con DNasa libre de RNasa I (Qiagen). Antes de la amplificación del ARN, la integridad y pureza del ARN se estimaron por electroforesis en gel desnaturalizante de agarosa y medición de A260 /A280.

en tiempo real la amplificación por PCR se realizó usando el kit de detección de gen de fusión AmoyDx ™ EML4-ALK (Amoy Diagnóstico , Xiamen, china) según las recomendaciones del fabricante. Brevemente, 0,1-5 g de ARN total se transcribió de forma inversa a cDNA utilizando M-MLV Reverse Transcriptase (Invitrogen). Seis microlitros de ADNc se utilizaron como plantilla para una reacción de 25-l para la detección en tiempo real PCR de los transcritos de fusión EML4-ALK utilizando el EML4-ALK Reacción Maestro Mezclas y un ciclador ABI 7500 (Applied Biosystems). El kit de detección del gen de fusión EML4-ALK usa novedosa, cebadores de propiedad para amplificar específicamente la secuencia del gen diana que participan nueve conocidas variantes de la transcripción de fusión EML4-ALK, incluyendo E13; A20, E6a /b; A20, E20, A20, E15, A20, E14 ; A20, E18, A20, E2, A20, E17, A20. La cantidad de ADNc diana se midió después de cada ciclo en la fase de captura de datos utilizando una sonda fluorescente novela. Se verificó la calidad del cDNA sintetizado durante la misma ejecución por la amplificación del gen de referencia (β-actina,
ACTB
). El gen de fusión ALK-EML4 y
ACTB
ensayos fueron etiquetados con FAM. Un control positivo y negativo se incluyó en cada tiempo real PCR plazo. Tal como se define por las instrucciones del fabricante, el ensayo de QPCR para gen de fusión EML4-ALK se consideró positiva, si la muestra de valor Ct & lt; 30. Para las muestras negativas, en tiempo real RT-PCR ensayo se repitió dos veces.

Análisis estadísticos

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el programa SPSS 13.0 para el programa de Windows (SPSS Inc., Chicago , ILLINOIS). Para el análisis de las correlaciones entre los
ALK
estado y las variables clínico-patológica, se utilizó el test χ2 o la prueba exacta de Fisher, en su caso. Los valores de probabilidad de & lt; 0,05 se consideraron significativos en los análisis

Resultados

Características Clinicopathogical de tumores

En el presente estudio, se analizaron un panel de 473 muestras de NSCLC,. que comprende 375 casos de tumores resecados quirúrgicamente, y 98 casos de biopsias. Ningún paciente recibió quimioterapia en el momento del diagnóstico. Como se resumen en la Tabla 1, los pacientes compuestas de 314 hombres (66,4%) y 159 (33,6%) mujeres, con una edad mediana de 59 años (de 21 a 84 años). Histológicamente, 341 (72,1%) fue el adenocarcinoma, 112 (23,7%) de carcinoma de células escamosas, y 20 (4,2%) de otros tipos. El estadio patológico fue I en 166 (35,1%), II, en 104 (22%), III en 105 (22,2%), y IV en 98 (20,7%) casos.

La proteína ALK expresión por IHC

Todos los casos ALK-positivos mostraron una difusa y patrón de tinción citoplasmática en las células tumorales, y no se observó inmunotinción en el epitelio normal de pulmón bronquial, neumocitos alveolares, macrófagos alveolares, tejido mesenquimatoso, y células inflamatorias en los tejidos pulmonares adyacentes (Figura 1). Veinte casos de un total de 473 fueron ALK-positivo, que representa el 4,2% de todos los casos estudiados por IHC, que incluía puntuación de 3 visto en 14 casos con una tinción citoplasmática intensa granular (Figura 1-A), la puntuación de 2 en 5 casos con una tinción citoplasmática moderada (Figura 1-C), la puntuación de 1 en 1 caso con una tinción débil frente al citoplasma (Figura 1-e) y la puntuación de 0 en 453 casos (Figura 1-G). No se observó tinción significativa heterogeneidad intratumoral, aunque las células en anillo de sello tendían a mostrar tinción más débil que las otras células, tal vez porque la proteína ALK citoplasmática fue disminuida por un gran volumen de material de moco. No hubo correlación aparente entre el reordenamiento del gen ALK por FISH y la intensidad de la inmunotinción

A, C, E, G:. Immunostainings ALK (aumento original × 200). A y C: intensa y moderada coloraciones citoplásmicas (puntuación = 3 y 2 respectivamente), E: débiles coloraciones citoplásmicas (puntuación = 1) y G: ninguna tinción (puntuación 0). B, D, F y H. análisis FISH para
ALK
utilizando una sonda de ruptura aparte ALK de dos colores. B, D y F sigals peces muestran en los tumores ALK-reorganizado, y la proporción de células con señales positivas ALK fue del 49% (49/100), 38% (38/100), 56% (28/50), respectivamente . Reorganizado
ALK gratis (B, D y F) se indica mediante la división de las señales de color rojo y verde o roja sola signals.H muestra sigals pescado en un tumor no reordenado. la proporción de células con las señales de ALK positivos fue 3% (3/100). La no reordenado
ALK gratis (H) muestra la fusión o señales rojas y verdes adyacentes.

ALK Reordenamiento evaluada por Fish &
reordenamiento de ALK se evaluó mediante FISH en 110 casos de IHC-negativos con histología adenocacinoma y 20 casos de IHC-positivos. Entre los 20 casos IHC-positivos, 15 casos fueron confirmados como
ALK
reordenamiento por FISH ALK, 5 casos no eran interpretables, debido a los artefactos técnicos, tales como la pérdida de señal que posiblemente resultantes de fijación o pérdida de tumor apropiado tejido. Ninguno de los casos 110 IHC-negativos mostró
ALK
reordenamiento por FISH. Imágenes representativas de ALK FISH se muestran en la Figura 1-B, D, F, H. Había dos patrones
ALK positivos
de reordenamiento. Uno de ellos era el patrón de ruptura aparte (BA) con una o dos señales rojas y verdes separadas, y otro se aisló patrón de señal roja y sin señal verde correspondiente. Los casos FISH ALK-negativos mostraron dos señales de fusión o muy cerca de las señales rojas y verdes.

Correlación entre ALK IHC y FISH

En el presente estudio, 130 casos fueron analizados por tanto IHC y FISH. La concordancia entre IHC y FISH se muestra en la Tabla 2. Sin tener en cuenta 5 casos por FISH no eran interpretables, la sensibilidad y la especificidad de IHC en los 125 casos, en comparación con el pescado, fueron del 100% y 100%, respectivamente. Por lo tanto, este estudio demostró que hubo una alta concordancia en la evaluación de los
ALK
reordenamiento entre IHC y FISH.

EML4-ALK gen de fusión por QPCR

después se prueba 13 casos IHC-positivos por QPCR. Los genes de fusión EML4-ALK se detectaron en 9 de cada 13 casos. Incluyeron
EML4-ALK
variante 1, 2, 3 con el exón 13 del
EML4
, el exón 20 del
EML4
, y el exón 6a /b de
EML4
fusionado con el exón 20 del
ALK
, respectivamente. Hubo 2 casos en los que los genes de fusión EML4-ALK no fueron detectados por QPCR, pero
se detectaron reordenamientos ALK fotos: por FISH. Además, el resultado positivo de
EML4-ALK
en 2 casos no pudo repetirse en el análisis repetidos. Es de destacar que, en un caso, ALK FISH era poco informativo para
ALK
reordenamiento, pero el caso fue reportado por QPCR positivo. Esto probablemente podría ser debido a la escasez de las células tumorales. En esta muestra, se contaron un total de 30 núcleos de las células tumorales representativa, y sólo dos células tumorales fueron positivas.

Características clínico-patológicas de los pacientes ALK-positivo

Un total de 473 resecado y NSCLC biopsia se examinaron muestras. expresión de la proteína ALK se evaluó en todos los casos por IHC.
EML4-ALK
translocaciones y /o
ALK
reordenamientos se confirmaron posteriormente en todos los casos ALK-immunopositive por FISH y /o QPCR. La relación entre el
ALK
reordenamiento y características clínico se resume en la Tabla 3.
ALK
se detectó reordenamiento en 20 de 473 casos de NSCLC. De los 20 casos de ALK-positivo, 19 (95%) eran adenocarcinomas, y 1 fue el carcinoma sarcomatoide que tenía una célula husillo significativa y el componente de células gigantes. Histomorfológico, como se muestra en la Tabla 4, el
ALK
-rearranged adenocarcinomas de pulmón con frecuencia mostró patrón de células en anillo de sello sólido. Un patrón de células en anillo de sello sólido o patrón cribiforme mucinoso se presentó al menos focalmente en todos los tumores ALK-positivo (Figura 2). Como se muestra en la Tabla 3, los pacientes ALK-positivos mostraron diferencias estadísticamente significativas en la edad (p = 0,003) y el estadio patológico (p = 0,024), en comparación con los pacientes negativos al ALK. Los pacientes con adenocarcinoma de pulmón ALK-positivo eran más jóvenes al momento del diagnóstico y tuvo una etapa superior, con mayor frecuencia en la etapa IV. Ninguna relación apreciable entre lo demuestra el reordenamiento de ALK y, o bien la historia del género o fumar paciente.

Ellos mostraron patrón sólido de células en anillo de sello (A), una estructura cribiforme (BD), y el moco extracelular abundante (C).


Discusión

a pesar de que el gen de fusión EML4-ALK es una anomalía genética menor en NSCLC [21], [22], la incidencia de cáncer de pulmón está aumentando en muchos países, el número absoluto de pacientes con cáncer de pulmón que albergaban el gen de fusión ALK-EML4 no es trivial. Crizotinib, un inhibidor de tirosina quinasa dual MET /ALK se ha demostrado ser eficaz para el tratamiento de pacientes con NSCLC ALK-positivo. Sobre la base de su eficacia y seguridad, crizotinib fue aprobado recientemente por la FDA de Estados Unidos para el tratamiento de pacientes con CPNM ALK-positivo avanzado. Sin embargo, la incidencia de
ALK
reordenamiento es relativamente baja, que varía de 2 a 5%. Incluso cuando una población enriquecida de los pacientes con CPNM se seleccionan sobre la base de sus características clínicas de pronóstico, tales como una menor edad, el estado de no fumadores, y la histología de adenocarcinoma, es difícil identificar los subgrupos de tumores ALK-positivos. Por lo tanto, la selección eficaz para los pacientes con
ALK
-rearranged NSCLC es un tema crucial en la práctica clínica.

La prueba FISH ALK separables ha servido como la prueba dignostic compañero para establecer la positividad en ALK ensayos clínicos de crizotinib [15]. En teoría, ALK FISH es capaz de detectar cualquier reordenamiento que implica
ALK
, independientemente de las parejas de fusión o el
EML4-ALK
variantes, en FFPE tejido que representa el método más común para el procesamiento y la conservación de muestras tumorales. Sin embargo, desde el punto de vista tecnológico y económico, FISH para la detección a gran escala de rutina de
ALK
reordenamiento en el CPNM sigue siendo un reto. Es urgente desarrollar y validar métodos más rentables para la detección de esta aberración genética. enfoques actuales de diagnóstico para la detección de
ALK
reordenamiento incluyen inmunohistoquímica (IHC), FISH y reacción en cadena de la polimerasa (PCR) métodos basados. Sin embargo, los detalles suficientes para efectuar una comparación adecuada con FISH actualidad se carece.

IHC es un método rápido y asequible preferido por los patólogos para el diagnóstico de rutina. Se puede realizar con éxito en una variedad de muestras de histología y citología. Aunque la técnica de inmunohistoquímica no detecta directamente el gen de fusión ALK sí mismo, basado en la observación de que ALK no es detectable en todos los tejidos normales distintos del cerebro [23], ALK-inmunoreactividad se asocia con la expresión regulada por incremento del gen, debido a la alteración de la actividad del promotor que es muy característico de un
ALK
inversión. Estudios anteriores han demostrado que algunos anticuerpos disponibles en el mercado tienen ALK relativamente menor sensibilidad en la detección de ALK por IHC, posiblemente debido a una débil actividad transcripcional de la región del promotor potenciador de
EML4
que impulsa la expresión de EML4-ALK. El anticuerpo D5F3 (Cell Signalling Technology) es uno de los anticuerpos más prometedores para la detección de
ALK
reordenamiento en NSCLC [19]. Sin embargo, siguen siendo necesarios más estudios para validar concordancia entre IHC y FISH en series con mayor número de muestras

En el presente estudio, se realizó inmunohistoquímica utilizando el anticuerpo monoclonal (clon SP8; Thermo Fisher Scientific, Fremont CA, EE.UU.)., uno de uso común, bien probado anticuerpo ALK a la misma dilución tal como se utiliza en LACG, haciendo su uso más práctico desde una perspectiva de laboratorio de diagnóstico. Este anticuerpo reconoce una proteína humana p80, identificado como un híbrido de gen ALK y el gen de la nucleofosmina (NPM) que resulta de la t (2; 5) (p23; q35) translocación encuentra en 30-50% de los linfomas de células grandes CD30 +. También reconoce la proteína ALK de longitud completa. Nuestro método de IHC se basa en un método estándar para la IHC práctica patología de rutina. Prolongamos el tiempo de recuperación de antígeno anticuerpo y se incubaron durante la noche en 4 ° C para mejorar la sensibilidad y la especificidad. La tasa de ALK-positivo en nuestros casos de NSCLC (20/473, 4,2%) fue comparable a la tasa de transcripción de fusión ALK-EML4 reportado en los estudios anteriores (2-5%). Todos los casos de NSCLC ALK-positivo por IHC mostraron reordenamiento del gen ALK por FISH y /o QPCR. Por otro lado, entre los 473 casos de NSCLC, se seleccionaron al azar 110 casos de IHC-neagative con histología de adenocarcinoma de evaluar
ALK
reordenamiento por FISH, y se encontró que no hubo casos en los que
ALK
se detectó reordenamiento del gen. En contraste con un estudio anterior [6], la prueba de IHC con anticuerpos SP8 mostró una mayor especificidad y sensibilidad en nuestro estudio. La tinción ALK proporcionó una inmunorreactividad muy limpio, fácilmente interpretable sin molestar a la tinción de fondo en los casos positivos. Esta discrepancia probablemente se debió a la diferente procedimiento de IHC tales como la recuperación de antígenos y anticuerpos de incubación, o el resultado de las variaciones en el procesamiento de tejidos en diferentes laboratorios. Nuestros resultados se mantuvieron a ser confirmados en estudios de cohortes lager.

RT-PCR del ADNc ha sido una estrategia de cribado se aplica comúnmente para reordenamientos del gen ALK. Por secuenciación del producto de PCR, la específica EML4-ALK variantes expresado puede ser identificado. Sin embargo, nuevas parejas de fusión de ALK no serán detectados con tales técnicas. En estudios recientes, basada en la detección de RT-PCR
ALK
reordenación se ha visto limitada en gran medida al tejido fresco o congelado. En comparación con multiplexar RT-PCR, QPCR aparece un método perfectamente adecuado para la identificación directa de la variante de fusión y la detección de su nivel de expresión, a causa de su bajo costo y tiempo de respuesta rápido. basada en la detección de
ALK
reordenación de los tejidos FFPE RT-PCR requiere la optimización del diseño del ensayo y no se ha evaluado en estudios de cohortes grandes. En nuestro estudio, hemos realizado QPCR en tejidos FFPE de 13 casos de ALK-positivo por IHC. 2 casos fueron negativos para
EML4-ALK fotos: por QPCR, pero positivo para
ALK
disposición por FISH. Presumiblemente, hubo nuevas parejas de fusión ALK o novela
EML4-ALK
variante, mientras que nuestro diseño del ensayo involucró sólo nueve conocido
EML4-ALK
variantes. Esto se mantuvo a ser validado por la secuenciación de genes. En adicional, la degradación del ARN en los bloques de tejido FFPE también puede dar lugar a resultados falsos negativos. En nuestro estudio, todos los bloques de tejido FFPE probados fueron 7-45 meses de edad, cuando se llevó a cabo nuestro trabajo de detección. la calidad del ARN y la ausencia de contaminación con ADN genómico se verificaron mediante electroforesis en gel de formaldehído-agarosa. También se cuantificó el nivel de β-actina como control de la calidad del ARN endógeno. El control de la calidad requerida, incluyendo un control sin plantilla, conocido de control ALK-positivo y negativo, se llevó a cabo a lo largo de todo el procedimiento. Nuestros resultados demostraron QPCR en tejidos FFPE no era lo suficientemente eficiente como un método de detección única, pero seguían siendo útil para identificar la variante de fusión involucrado cuando el material congelado no está disponible.

Se realizó FISH, que se considera como la corriente