Extracto
Las proteínas de superficie celular CD133, CD24 y CD44 son marcadores putativos para el cáncer poblaciones de células madre en el cáncer de colon, asociados con los tipos de cáncer agresivo y mal pronóstico. Es importante entender cómo estos marcadores pueden predecir los resultados del tratamiento, determinadas por factores tales como radioresistance. El alcance de este estudio fue evaluar la conexión entre EGFR, CD133, CD24, y CD44 (incluyendo isoformas) niveles de expresión y sensibilidad a la radiación, y además analizar la influencia de isoformas de Akt en los patrones de expresión de estos marcadores, para comprender mejor el subyacente mecanismos moleculares en la célula. Se utilizaron tres de cáncer de colon líneas celulares, HT-29, DLD-1, y HCT116, junto con DLD-1 isogénicas
AKT
knock-out líneas celulares. Las tres líneas celulares (HT-29, HCT116 y DLD-1) expresan diferentes cantidades de CD133, CD24 y CD44 y el diez por ciento de las células que expresan CD133 y CD44 (CD133
alta /CD44
alto) eran más resistentes a la radiación gamma que el diez por ciento con la expresión más baja (CD133
baja /CD44
bajo). La expresión AKT fue menor en la fracción de células con bajo CD133 /CD44. El agotamiento de AKT1 o AKT2 usando células knock out mostró por primera vez que la expresión de CD133 se asoció con AKT1 pero no AKT2, mientras que la expresión de CD44 fue influenciado por la presencia de cualquiera de AKT1 o AKT2. Hubo varios genes en la vía de la adhesión celular que tenían significativamente más alta expresión en el
AKT página 2 KO línea celular en comparación con el
AKT
1 KO línea celular; Sin embargo los genes importantes en el epitelio de la vía mesenquimal (
CDH1
,
VIM, TWIST1, Snai1, SNAI2, ZEB1, ZEB2, FN1, FOXC2
y
CDH2)
hizo no difieren. Nuestros resultados demuestran que CD133
alta /CD44
células de elevada expresión de cáncer de colon se asocian con AKT y el aumento de resistencia a la radiación, y que AKT diferentes isoformas tienen diferentes efectos sobre la expresión de marcadores de células madre de cáncer, que es una consideración importante cuando la orientación de AKT en un entorno clínico
Visto:. Sahlberg SH, Spiegelberg D, Glimelius B, Stenerlöw B, Nestor M (2014) Evaluación de cáncer de células Madre marcadores CD133, CD44, CD24: Asociación con isoformas y AKT Resistencia a la radiación en células de cáncer de colon. PLoS ONE 9 (4): e94621. doi: 10.1371 /journal.pone.0094621
Editor: Andrew Yeudall, Virginia Commonwealth University, Estados Unidos de América
Recibido: 15 Septiembre, 2013; Aceptado: March 19, 2014; Publicado: 23 Abril 2014
Derechos de Autor © 2014 Sahlberg et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo ha sido financiado por becas de la Sociedad sueca del cáncer, www.cancerfonden.se. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal es uno de los tumores malignos diagnosticados más comunes en el mundo. Varios estudios han identificado las subpoblaciones de células de cáncer colorrectal que son más resistentes a los tratamientos contra el cáncer tales como agentes quimioterapéuticos y la radiación [1], [2]. El éxito del tratamiento depende de la eliminación de estas subpoblaciones altamente resistentes, y no sólo la masa tumoral principal. Estas células se refieren a menudo como las células madre de cáncer o células iniciadoras del tumor, y varios marcadores de superficie celular se han demostrado que se expresa en estas poblaciones de células [3]. CD133, CD44 y CD24 son tres marcadores propuestos de células madre en el cáncer colorrectal, pero desalentadora la distribución difiere entre los pacientes y líneas de células tumorales [4]. Por lo tanto, es de gran interés para comprender su función y cómo los biomarcadores interactúan entre sí.
CD24 es una proteína de superficie celular, que está anclado en el lado externo de la membrana plasmática. Se cree que tiene un papel esencial en la diferenciación celular, y también se expresa en las células implicadas en el sistema inmune, tales como los linfocitos B, donde regula positivamente la proliferación de células T activadas. expresión CD24 se describe también en el sistema nervioso central [5]. La distribución en el cáncer colorrectal es objeto de controversia, aunque estudios previos han demostrado que entre el 50 y el 68% de los pacientes que sufren de cáncer colorrectal expresa CD24 a un alto grado [5], [6], y, además, que CD24 subpoblaciones positivos de células de cáncer de colon -lines poseen tallo propiedades de células [7]. En contraste, tumor de iniciar las células de cáncer de mama de cabeza y cuello y se han demostrado ser CD24 negativo [8], [9].
CD133 (también llamado Prominin-1) se cree que está asociado con tumorigenicidad y la progresión de la enfermedad. La regulación de CD133 en el cáncer colorrectal se correlaciona fuertemente con mal pronóstico y la metástasis hepática sincrónica [10], aunque se desconoce el papel exacto y la función de CD133.
CD44 tiene un papel en la facilitación de una célula a otra y célula-matriz interacciones a través de su afinidad para el ácido hialurónico y está implicado en la adhesión celular y el conjunto de factores de crecimiento en la superficie celular. CD44 está codificada por un solo gen, incluyendo 20 exones. La forma estándar (en adelante, CD44s) consiste en el exón 1-5 y 15-20. Los exones variables se identifican como V1-V10, respectivamente. La utilización diferencial de los 10 exones variantes genera múltiples variantes de CD44 (CD44v) con diferentes combinaciones de productos variante exón. Varias isoformas de CD44 surgen por la inserción de uno o más de los exones de variantes en la cadena principal común compartida por todas las formas de CD44. El papel de estas isoformas variantes no se entiende completamente, aunque algunos se cree que mediar un paso crítico en la metástasis del cáncer de colon [8], [11], [12]. CD44 se puede co-inmunoprecipitó con la familia de quinasas ErbB receptor tirosina tal como el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y también interactúa con HER2, HER3 y HER4 [8], [13]. El EGFR se cree que juega un papel importante en la regulación y el mantenimiento de las células madre del cáncer, principalmente a través de señalización corriente abajo a través de la fosfo-inositol 3 quinasa (PI3K) /Akt [14], [15].
AKT es una serina /treonina quinasa con tres isoformas diferentes, AKT1, AKT2 y Akt3, expresada a partir de tres genes separados y activada por muchos estímulos, tales como varios receptores de factores de crecimiento (por ejemplo EGFR), B y T receptores de las células. Tiene un papel central en muchas funciones celulares responsables de la proliferación, la supervivencia, el crecimiento, anti-apoptosis, la captación de glucosa, el metabolismo, la angiogénesis y radioresistance [16]. También se cree AKT estar involucrados en la transición epitelial a mesenquimal vía (EMT), que conduce a un aumento de la motilidad, la reducción de la adhesión intercelular, la progresión tumoral y la transformación maligna. La vía de EMT es, por tanto, implicados en la invasión de células de cáncer y la metástasis [17]. Los inductores de la EMT, como ligandos de receptores tirosina quinasa o factor de crecimiento transformante beta (TGF), Wnt y Notch, desencadena una cascada de señalización celular que conduce a la supresión de la adhesión celular proteína E-cadherina. El proceso consiste en la regulación de la transcripción que actúan represores directos como caracol, barra, caja forkhead C2 y ZEB1, Zeb2, así como Twist and E47 que reprimen indirectamente E-cadherina. Otros marcadores de EMT son N-cadherina, vimentina y fibronectina-1 que se expresa en las células mesenquimales [18]. EMT también se ha demostrado que participan en las células madre del cáncer donde las células de cáncer de colon con una alta expresión de CD133 /CD44 mostraron EMT tras el cultivo a largo plazo [18], [19].
AKT se ha propuesto que se co-expresan con CD133, proporcionar a la población celular que expresa CD133 con una mayor resistencia a agentes quimioterapéuticos, pero no se conocen los detalles sobre esta interacción [20], [21]. CD44 se cree que se correlaciona negativamente con AKT [22]. Sin embargo, varios estudios han demostrado que AKT es en vez fosforilada cuando la estimulación de CD44 con el ligando, causando un efecto de supervivencia de las células [23] - [25], y es probable que las isoformas de CD44 tienen un papel regulador ser capaz de tanto activar y reprimir la la activación de AKT. La radiación en sí también se ha demostrado que aumenta la expresión de AKT, CD133, y reducir la expresión de CD44 en células de cáncer de colon [26]. Sin embargo, hasta ahora no se ha estudiado la importancia de las diferentes isoformas de Akt en la expresión de CD44 CD133 o.
Recientemente hemos demostrado que tanto AKT1 y AKT2 son importantes en la respuesta a la radiación [27]. Llamar a la puerta de salida, ya sea
AKT
1 o
AKT página 2, o ambos a la vez, el aumento de la sensibilidad a la radiación y la tasa de reunirse con doble cadena de ADN se altera en
AKT
1 /2 KO línea celular. En el presente estudio, hemos investigado las diferencias en los patrones de expresión de CD133, CD24, CD44 y EGFR en cáncer de colon tres líneas celulares; HT-29, HCT116 y DLD-1. También hemos analizado la sensibilidad a la radiación de las células de cáncer de colon ordenados para CD133
alta /CD44
alto y CD133
baja /CD44
baja expresión, y siguió investigando la influencia de dos isoformas de Akt (AKT1 , AKT2) de CD133 y la expresión de CD44, CD44 incluyendo isoformas variantes de corte y empalme. Akt3 no se expresa en las líneas celulares estudiadas, y por lo tanto fue excluido. Por otra parte, hemos validado el efecto de AKT en la expresión génica en un análisis de transcriptómica a gran escala de múltiples vías.
Materiales y Métodos
Cell Cultura y
El por células de cáncer de colon líneas HT-29 y HCT116 fueron adquiridas de la American Tissue Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EE.UU.), los números de catálogo ATCC CCL-221 y ATCC CCL-247, respectivamente. DLD-1 X-MAN isogénicas líneas celulares se obtuvieron a partir Horizonte Descubrimiento Ltd con las diferentes isoformas de Akt genéticamente noqueado, número de catálogo HD-R00-001, HD-R00-002 y HD-R00-003. Las células se cultivaron en 75 cm
2 frascos de cultivo (superficie Nunclon, Roskilde, Dinamarca) en medio 5A de McCoy (Flow Irvine, UK) con suero bovino fetal al 10% (Sigma Aldrich, St. Louis, EE.UU.), 2 mM L-glutamina, 100 UI /ml de penicilina y 10 mg /ml de estreptomicina (Biochrom Kg, Berlin, Alemania). Las células se cultivaron en un incubador humidificado con 5% de CO
2 a 37 ° C y se tripsinizaron con tripsina-EDTA, 0,25% de tripsina, 0,02% de EDTA (Biochrom Kg, Berlin, Alemania).
Cell Ordenando con citometría de flujo
Para el flujo de análisis de citometría de las líneas celulares se recogieron utilizando solución no enzimática de disociación celular (Sigma Aldrich, St. Louis, EE.UU.) o 0,25% de tripsina, 0,02% de EDTA, (Biochrom Kg , Berlín, Alemania). Después de la resuspensión de las células en medios de cultivo celular, se contaron las células y se lavaron en PBS con 0,5% de BSA y se recogieron por centrifugación. Las células se incubaron durante 10 a 30 minutos con los anticuerpos marcados, véase la Tabla 1. Tras el anticuerpo etiquetado de las células se lavaron en PBS con 0,5% de BSA antes del análisis de citometría de flujo se llevó a cabo en un SORP BD LSRII (Becton Dickinson Biosciences, San José, EE.UU.). Muriendo y las células muertas se tiñeron con yoduro de propidio y se excluyeron del análisis. Duplicados y las células muertas también fueron excluidos por gating con el FSC y SSC. Para células de clasificación para el ensayo clonogénico se utilizaron la diva FACSVantage SE o Clasificador células FACSAriaIII (Becton Dickinson Biosciences, San Jose, EE.UU.).
Se fijaron
Análisis del ciclo celular
Las células con 70% de etanol, 30% de PBS y se mantuvo en -20 ° C durante al menos 24 horas. Las células se centrifugaron durante 10 minutos, 2000G en 4 ° C y se lavaron dos veces con PBS antes de la incubación con 5 g de propidio de yodo /0,1% NP-40 (Sigma Aldrich, St. Louis, EE.UU.) en PBS, junto con 5 g de RNasa (Sigma Aldrich , St. Louis, EE.UU.) durante 30 minutos a temperatura ambiente. El análisis se hizo con citometría de flujo (BD Biosciences LSRII).
Ensayo clonogénico
La asociación entre la expresión de CD133 y CD44 y sensibilidad a la radiación se evaluó mediante la clasificación y recogida de CD133
alta /CD44
CD44
bajos células que expresan altos y CD133
bajo /. El número de células después de la clasificación se determinó con un contador de células (contador de células TC 20 Automatizado, Ciencias de la vida BioRad, Hercules, CA, EE.UU.)), y una cierta cantidad de células se pre-chapada en 25 cm
2 frascos de cultivo de tejidos. Al día siguiente, las células fueron expuestas a la radiación aplicada externamente usando un
fuente de 137Cs (Mejor Theratronics Gammacell 40 Exactor, Springfield, EE.UU.). Después de un período de tiempo de incubación de 8-14 días se lavaron las células en PBS y se fijaron con 99,5% de etanol durante 5-10 min. Las colonias se tiñeron con Hematoxilina de Mayer (Histolab Products AB, Västra Frölunda, Suecia) durante 20-30 minutos y después enjuagar con agua. Las colonias con más de 50 células por colonia se contaron y la eficiencia en placas (PE = número de colonias en las células no tratadas /número de células sembradas) y la fracción de supervivencia (SF = número de colonias en las células tratadas /número de células sembradas × PE) se calcularon y se representaron.
análisis estadísticos
citometría de flujo análisis se evaluaron usando el software BD FACSDiva 7.0 (BD Biosciences). Los datos de ensayo clonogénico se procesó con Microsoft Office Excel 2007 (Microsoft, Redmond) y las gráficas se trazan y se analizaron con un modelo lineal en GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, San Diego, EE.UU.). Se utilizó un nivel de significación del 95%. Este análisis evaluó si las fracciones de supervivencia de las células clasificadas CD133 y CD44 radiadas fueron significativamente diferentes entre sí para cada dosis de radiación.
Western Blot
Las células se cultivaron en 3 cm placas de Petri durante al menos tres tiempos de duplicación lysation antes o tres cultivos celulares separadas de DLD-1 fueron ordenados por citometría de flujo (véase más arriba) y el volumen de tampón de lisis se ajustó al número de células recogidas en cada vial. Se prepararon lisados después del tratamiento por lavado de las células con hielo frío PBS seguido de la adición de 10 000 000 células /tampón de lisis ml que contiene 1% de Tween-20, Tris 20 mM (pH 8,0), 137 mMNaCl, 10% de glicerol, 2 mM EDTA, 1 mM ortovanadato de sodio activados (Sigma Aldrich, St. Louis, EE.UU.) y cóctel inhibidor de la proteasa (P8340, Sigma Aldrich, St. Louis, EE.UU.) e incubación en hielo durante 30 min. Los lisados se centrifugaron durante 10 min en 4 ° C. El sobrenadante se transfirió a tubos nuevos y el sedimento se desechó. La concentración de proteína del lisado se determinó por el ensayo de proteína BCA (Pierce). Igual cantidad de proteína se cargaron en un 3-8% de gel de SDS-PAGE de Tris-acetato (Life Technologies, Carlsbad, CA) y después transferido a una membrana de nitrocelulosa (Millipore) mediante inmunotransferencia de tipo húmedo. La membrana de nitrocelulosa se bloqueó durante 1 h en 5% de BSA, PBS y luego incubadas con el anticuerpo primario durante la noche a 4 ° C. Anticuerpo específico de CD133 /1 (W6B3C1) era de Miltenyi Biotech (Heidelberg, Alemania) y CD44 (103014) de Biolegend (San Diego, CA, EE.UU.). Los anticuerpos contra FoxO3a (2497), fosfo-FoxO (2599) y GSK-3beta (9315) y fosfo-GSK3B (9323) eran todos de Señalización Celular Tecnología (Beverly, MS, EE.UU.). AKT1 (sc55523 y AKT2 (sc5270) eran de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EE.UU.). El anticuerpo contra β-actina (A5441) fue de Sigma-Aldrich (St. Louis, EE.UU.). Después del lavado en PBS con 1% Tween-20, la membrana se incubó con rábano picante anticuerpo marcado con peroxidasa secundario (626520 y 656120) (Invitrogen, Camarillo, CA, EE.UU.) o (405405) (Biolegend, San Diego, CA, EE.UU.) durante 1 h a temperatura ambiente. bandas inmunorreactivas se visualizaron en una cámara CCD (HR SuperCCD, Fujifilm, Japón) después del tratamiento con la solución de electro-quimioluminiscente Immobilon (Millipore, Billerica, MA, EE.UU.) durante 5 min.
Análisis de microarrays de expresión
Dos pasajes separados de DLD-1 de los padres,
AKT
1 KO,
AKT página 2 KO y
AKT
1/2 células KO fueron cultivadas a 70% se extrajo confluencia y ARN (RNeasy mini-prep, Qiagen, Valencia, CA, EE.UU.) la concentración de ARN se midió con un espectrofotómetro ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, dE) y se evaluó la calidad del ARN usando el sistema de Bioanalyzer Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc, Palo Alto, CA). Se utilizaron 250 nanogramos de ARN total de cada muestra para generar amplificado biotinilado y ADNc de hebra sentido de la totalidad del genoma expresado de acuerdo con el GeneChip WT reactivo PLUS Manual de usuario del Kit (P /N 703174 Rev 1 Affymetrix Inc, Santa Clara, CA) . GeneChip HTA Arrays (GeneChip Human Transcriptome matriz de 2,0) se hibridaron durante 16 horas en un 45 ° C incubadora, hace girar a 60 rpm. De acuerdo con la Expresión GeneChip de lavado, las manchas y manuales de exploración (PN 702731 Rev. 3, Affymetrix Inc, Santa Clara, CA) a continuación, los arreglos fueron lavados y teñidos con el de fluidos 450 y finalmente la estación escaneados utilizando el escáner GeneChip 7G 3000.
microarrays de análisis de datos
método los datos en bruto se normalizó en la consola de Expresión de software gratuito proporcionado por Affymetrix (http://www.affymetrix.com) utilizando el robusto promedio de múltiples matrices (RMA) primero sugerida por Li Wong y en 2001 [28], [29]. El análisis posterior de los datos de expresión génica se llevó a cabo en el R libremente disponibles lenguaje de computación estadística (http://www.r-project.org) usando paquetes disponibles en el proyecto Bioconductor (www.bioconductor.org). Con el fin de buscar los genes expresados diferencialmente entre los padres y el
grupos AKT
KO a un bayesiana empírica moderado se aplicó entonces t-test, utilizando el paquete 'limma' [30]. Para abordar el problema con múltiples pruebas, los valores de p se ajustaron usando el método de Benjamini y Hochberg [31]. Los datos normalizados se evaluó utilizando los recursos DAVID bioinformáticas 6,7 a junto con Kyoto Enciclopedia de genes y genomas (KEGG) la base de datos vía (http://www.genome.jp/kegg/pathway.html) para clasificar y agrupar funcionalmente los genes relacionados epitelial de las vías de transición mesenquimales [32], [33].
Confirmación de
AKT
1 y
AKT página 2 ronda de PCR con
ARN total fue aislado de DLD-1 de los padres,
AKT
1 KO,
AKT página 2 KO y
AKT
1/2 células KO con RNeasy mini kit (Qiagen, Valencia , CA, EE.UU.). El ADNc se sintetizó a partir de 0,1 g de ARN total usando RevertAid H Minus Primera Strand cDNA Synthesis Kit con cebadores hexámeros al azar (Thermo Scientific, Waltham, MA, EE.UU.) y se realizó una PCR con Taq ADN Polymarese (Thermo Scientific, Waltham, MA, EE.UU.) con cebadores contra AKT1 (fwd: AGGCTCCCCTCAACAACTTC, rev: CTCCTCCTCCTCCTGCTTCT) o AKT2 (fwd: GGTGCCTCCTGCATGTCC, rev: CCTCTCGGTCTTCATCAGC)
la transfección con siRNA contra AKT1 en DLD-1 células parentales
Las células fueron. transfectadas con siAKT1 silenciador (Ambion por Life Technologies, Carlsbad, CA) con Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Carlsbad, CA) (sentido: 5 'GCGUGACCAUGAACGAUUtt y antisentido: 5'AACUCGUUCAUGGUCACGCGG). Las células transfectadas fueron incubadas en 37 ° C en un CO
2 incubadora durante 48 horas antes de analizar la expresión de CD133, CD44 y CD24 en citometría de flujo, véase más arriba.
Re-activación de AKT1 o en AKT2 DLD-1
AKT
1/2 Las células KO
DLD-1
AKT
1/2 células cultivadas KO a una confluencia de 30-50% en McCoys libre de antibióticos medio celular (Sigma Aldrich, St. Louis, EE.UU.) durante 24 horas antes de la transfección. Las células fueron transfectadas con plásmidos pcDNA3 MYR Akt1 y pcDNA3 MYR HA AKT2 amablemente proporcionados por William Sellers (Instituto Dana Farber, en Boston, MA, EE.UU.) a través de Addgene (Cambridge, MA). Lipofectamine 2000 y OptiMEM eran de Life Technologies (Carlsbad, CA). Las células transfectadas fueron incubadas en 37 ° C en un CO
2 incubadora durante 72 horas antes de analizar más a fondo el CD133, CD44 y CD24 expresión mediante citometría de flujo, véase más arriba.
Resultados
CD133, CD44, CD24 y expresión de EGFR en cáncer de colon líneas celulares
El CD133, CD44, CD24 y la expresión de EGFR en tres líneas celulares de cáncer de colon se analizaron con citometría de flujo, ver Figura 1A. Hubo una diferencia en la expresión de CD133, CD44, CD24 y EGFR entre las líneas celulares. CD44 se muestra como una población que va desde menor a mayor expresión en las tres líneas celulares. La detección de la expresión de CD24 era dependiente de anticuerpo anti-CD24. La más alta expresión de CD24 se observó en los 29-HT células con células positivas del 95% mediante el anticuerpo CD24 de MACS), véase la figura 1B. CD133 se expresa en la mayoría de la HCT116 y las células HT-29, mientras que sólo el 14% de las células DLD-1 fueron positivos para CD133. Las tres líneas de células expresan EGFR. Alrededor del 80% de HT-29 y HCT116 cuando sean positivos para el EGFR mientras que el 40% fueron positivos en DLD-1.
A) HT-29, HCT116 y DLD-1. Los patrones de expresión en las gráficas de puntos son de un citómetro de flujo representante experimento. La rejilla demuestra el margen entre la alta y la baja expresión de la proteína definida por controles de isotipo. B) La expresión de las células CD24 positivas en citometría de flujo depende de la del anticuerpo anti-CD24. La tabla muestra el porcentaje de células CD24 positivas utilizando tres anticuerpos CD24 diferentes.
Radiosensibilidad de CD133
alta /CD44
alto y CD133
baja /CD44
bajo Expresando las células
la asociación entre la expresión de CD133, CD44 y sensibilidad a la radiación se evaluó mediante la clasificación y recogida de CD133
CD44
altas y CD133
baja /CD44
células que expresan altos /bajos , seguido por la exposición a la radiación gamma se aplica externamente, y se analizaron adicionalmente con ensayos clonogénicos, véase la figura 2. Una mayor resistencia a la radiación en el CD133
alta CD44
alta población /en comparación con el CD133
bajo /CD44
población baja se observó para todas las líneas celulares. Estas diferencias fueron estadísticamente significativas en todas las dosis de radiación (2, 4 y 6 Gy) para células DLD-1, ver Figura 2C, a las 4 y 6 Gy para las células HCT116, y en 4 Gy para las células HT-29, véase la Figura 2A y B, con un valor de P & lt; 0,05 (ANOVA de una vía). No había ninguna o una pequeña diferencia en la expresión de CD24 en el CD133
alta /CD44
alto y CD133
baja /CD44
población de bajos, excepto en HCT116 donde había células CD24 menos positivos en el CD133
/CD44
baja fracción de bajo. El número de células EGFR positivos en las fracciones ordenados eran casi el doble en el CD133
alta /CD44
alto en comparación con el CD133
/CD44
baja fracción de baja en el TC-29 y DLD-1 mientras que en las células HCT116 sólo había una pequeña diferencia en la expresión de EGFR entre las fracciones. La sensibilidad a la radiación de células no clasificadas se muestra en la Figura S1
.
ensayo clonogénico de A), B) HCT116 HT-29 y C) células DLD-1. El 10 por ciento superior e inferior de las células que expresan CD133 y CD44 fueron ordenados por citometría de flujo (CD133
alta /CD44
alto o CD133
/CD44
baja baja), se analizó y la radiación de sensibilidad con clonogénico ensayos. Los controles de ambas fracciones se normalizaron y se pusieron a 100% de supervivencia. Las barras de error representan el error estándar de la media de al menos dos experimentos independientes con muestras triplicadas. Se observó una mayor resistencia a la radiación en el CD133
alta /CD44
alta población en comparación con el CD133
baja /CD44
población de bajos para todas las líneas celulares. Estas diferencias fueron estadísticamente significativas en todas las dosis de radiación (2, 4 y 6 Gy) para células DLD-1 (Figura 2C), a las 4 y 6 Gy para las células HCT116, y en 4 Gy para 29-HT células (Figura 2A y B ) con un valor de P & lt; 0,05 (ANOVA de una vía). El porcentaje de células positivas para EGFR, CD24 con el anticuerpo CD24 biociencia BD o con Miltenyi biotecnología /MACS se analizaron con citometría de flujo.
La expresión de AKT en CD133
positivo /CD44
positivo y CD133
/CDD44
Población negativo negativo en LDN-1 |
Las diferentes poblaciones de CD133
positivo /CD44
positivo, CD133
negativo /CD44
positivo y CD133
negativo /CD44
negativo en las células DLD-1 se ordenaron, se recogió y analizó más para la expresión de AKT con el western blot, véase la Figura 3A y B. la expresión de AKT total fue menor en el CD133
negativo /CD44
negativo de la población en comparación con la población positiva para CD44 y /o CD133. patrón similar se observó para AKT1 y AKT2, véase la Figura 3B.
A) las células DLD-1 fueron ordenados por citometría de flujo y con diferentes poblaciones CD44
/CD133
positivo negativo (Q1), CD44
positivo /CD133
positivo (Q2), CD44
negativeCD133
negativo (Q3), se recogieron. B) Las células clasificadas se analizaron adicionalmente con western blot para el total de AKT, AKT1 o AKT2 y betaactin expresión.
Influencia de Akt isoformas en la expresión de CD24, CD44 y CD133
Dado que la expresión de AKT era diferente en la ordenada CD133
positivo /CD44
positiveand CD133
negativo /CD44
poblaciones negativas, se evaluó la influencia de las isoformas de Akt utilizando la línea celular de cáncer de colon DLD-1 y el
AKT
1,
AKT página 2 y
AKT
1/2 líneas celulares isogénicas de eliminación directa, ver Figura 3AB, y la confirmación de knock-outs en la figura S2. La intensidad media de fluorescencia (MFI) de la expresión de CD44 se incrementó de 100% en los padres y el 150% en
AKT
1 KO y
AKT página 2 KO y 250% en
AKT
1/2 KO línea celular, ver Figura 4A y B. Además, la expresión de CD133 se redujo cuando AKT1 fue eliminado de salida como se ve en la
AKT
1 KO, así como en el
AKT
1/2 KO línea celular. Sin embargo, una sola ronda de
AKT página 2 como se ve en la
AKT página 2 KO línea celular no redujo el nivel de CD133, véase la Figura 4A. La expresión de CD24 fue completamente abolida en el
AKT
1/2 KO, pero aumentó en el único
AKT
1 o
AKT
2 KO líneas celulares ver Figura 4C. La influencia de isoformas de Akt en la expresión de CD24, CD133 y CD24 se verificaron adicionalmente con siRNA contra AKT1 y por la reintroducción de AKT1 o AKT2 en el DLD-1
AKT
medio KO línea celular, ver figuras S3 y S4. Además, se confirmó que no hubo diferencias en la distribución del ciclo celular entre las líneas celulares, véase la figura 4D.
A) En las células de los padres, aproximadamente el 10% de las células eran CD133 células positivas. Sin embargo, en el
AKT
1 y
AKT
1/2 knock-out, las células CD133 positivas fueron reducidos a 0,3 y 0,1%, respectivamente. Esto no se observó en el
AKT página 2 línea celular knock-out, donde el 33% de las células fueron positivas para CD133. B) La intensidad media de fluorescencia de CD44 normalizó a la de los padres línea celular DLD-1 aumentó en un 150% en
AKT
1 KO, 160% en
AKT página 2 KO y 300% en
AKT
1/2 KO línea celular. Las barras de error representan la desviación estándar (SD) a partir de al menos dos experimentos. C) El porcentaje de células positivas CD24 analizadas con dos anticuerpos CD24 diferentes de BD Biosciences y Miltenyi /MACS en citometría de flujo. Las desviaciones estándar son de experimentos repetidos. D) la distribución del ciclo celular en DLD-1 1/2 células parentales KO,
AKT
1 KO,
AKT página 2 KO y
AKT
.
Influencia de Akt isoformas en la expresión de CD44 variantes isoformas
la mayoría (98-100%), de DLD-1, HCT116 y células HT-29 fueron positivas para CD44, detectada con un anticuerpo que detecta todas las variantes de CD44. El patrón de expresión de CD44 isoformas variantes V3, V4 /5, v6, v7 y V7 /8 se investigaron aún más en el DLD-1 parental y
AKT
1/2 KO líneas celulares véase la Tabla 2. Sólo pequeña ~1-6 cantidades (%) de las células fueron positivas para las isoformas variantes de CD44 (la expresión en células individuales, en vivo), y sin cambios significativos en los niveles de expresión entre AKT deficientes y no deficientes DLD-1 líneas celulares. En el caso de CD44v7, que tenía un mayor nivel detectable, la expresión se redujo ligeramente en el
AKT
1/2 células KO en comparación con los padres.
Los análisis bioquímicos de DLD- 1
AKT
noquear a líneas celulares
Western blot evaluó adicionalmente la expresión de la proteína de CD133 y CD44, así como Fox0 y GSK3 y su influencia por isoformas de Akt. La expresión de CD44 fue hasta reguladas en el
AKT
1 KO,
AKT página 2 KO y
AKT
1/2 KO líneas celulares en comparación con los padres y el CD133 la expresión se redujo en
AKT
1 KO y
AKT
1/2 KO líneas celulares, pero no en el
AKT página 2 KO línea celular como se ve en el flujo El análisis de citometría. El
AKT
1, A
KT página 2 y
AKT
1/2 KO líneas celulares tenían una expresión reducida de Fox01 fosforilada y Fox03a, así como una expresión reducida en Fox03a total en el
AKT
1/2 KO línea celular. Sin embargo, no hubo diferencias en la expresión de fosforilados (S9) o total GSK3 entre el
AKT
KO líneas celulares, véase la Figura 5A.
Una expresión) de la proteína de CD44, CD133, fosfo-FOXO, FOX03a total fosfo-GSK3 y GSK3 total a partir de Western blot. B) La expresión de genes, sobre regulación (+), la regulación negativa (-) o no cambiar (Carolina del Norte), de CD44, CD24, CD133, Fox01, FOX03, FOX04, GSK3 y LYN en LDN-1
AKT
1 KO,
AKT página 2 KO o
AKT
1/2 células KO en comparación con DLD-1 células parentales.
Las diferencias en la expresión génica en los DLD-1 AKT Isoformas ronda líneas celulares
la expresión de genes se realizó para investigar más a fondo las diferencias entre el isogénica
AKT
isoforma knock-out líneas celulares ver Figura 5B. Los genes se consideraron significativamente hacia arriba o hacia abajo regulados con relaciones de ≥ 1,5 plegables y con p & lt; 0,05. El knock-out de la
AKT
1 y
AKT
2 isoformas se confirmó en las líneas de células DLD-1 y la expresión de genes de CD44 y CD133 confirmó los resultados de la citometría de flujo y el oeste El análisis de transferencia. CD44 fue hasta reguladas en el
AKT
1,
AKT página 2 y
AKT
1/2 KO líneas celulares en comparación con la línea celular parental y CD133 fue arriba regulado en el
AKT página 2 KO pero regulado en el
AKT
1 y
AKT
1/2 KO líneas celulares. La expresión de CD24 fue menor en el
AKT
1/2 KO línea celular en comparación con el embargo de los padres; no hubo diferencias en los
AKT
1 o
AKT
2 KO líneas celulares. FoxO1 estaba regulado en marcha en
AKT
1 KO y
AKT
1/2 KO línea celular, mientras que FOXO3 fue sólo hasta regulado en un solo
AKT
1 KO y
AKT
2 KO líneas celulares. No hubo diferencia en la expresión foxo4 entre las líneas celulares. LYN fue hasta reguladas sólo en el
AKT
1/2 KO sin embargo, no hubo diferencias en la expresión de GSK3 entre las líneas celulares, ver Figura 5B.
Evaluación de las diferencias en epitelial a mesenquimal transición, Notch, Wnt y Adhesión celular caminos entre
AKT página 2 KO y
AKT
1 KO líneas celulares
Un marcador para la transición epitelial a mesenquimal (EMT ) es la reducción de la adhesión celular. Hubo varios genes en la vía de la adhesión celular (
CLDN1, ITGB8, NEO1
y
PVRL3
) que tenía significativamente más alta expresión en el
AKT página 2 KO línea celular comparada a la
AKT
1 KO línea celular. Por otra parte, la inducción de la EMT implica receptores Notch y Wnt y tirosina quinasas.