Extracto
Introducción
El cáncer de páncreas es un cáncer agresivo y su pronóstico sigue siendo pobre. Por lo tanto, se requiere terapia eficaz adicional para aumentar y /o complementar la terapia actual. CD147, alta expresión en el cáncer de páncreas, está involucrado en el proceso metastásico y se considera un buen candidato para la terapia dirigida. imágenes CD147-specfic podría ser útil para la selección de los pacientes apropiados. Por lo tanto, se evaluó el potencial de un anticuerpo monoclonal anti-CD147 totalmente humano 059-053 como la tomografía por emisión de positrones nueva (PET) de la sonda de cáncer de páncreas.
Métodos
CD147 expresión fue evaluada en cuatro líneas celulares de cáncer de páncreas (MIA Paca-2, PANC-1, BxPC-3, y ASPC-1) y una línea celular de ratón A4 como un control negativo. La unión celular, ensayos de inhibición competitiva y de internalización se llevaron a cabo con
125I,
67Ga-, o
89Zr-etiquetado 059-053.
In vivo
biodistribución de
125I o
89Zr marcado con 059 a 053 se llevó a cabo en ratones portadores de tumores Paca-2 y A4 MIA. La PET con [
89Zr] 059-053 se llevó a cabo en modelos subcutáneos y ortotópico de ratón del tumor.
Resultados
Entre cuatro líneas celulares de cáncer de páncreas, MIA Paca-2 células mostró la mayor expresión de CD147, mientras que las células A4 no tenían expresión. La tinción inmunohistoquímica mostró que MIA Paca-2 xenoinjertos también altamente expresado CD147
in vivo
. Radiomarcado 059-053 une específicamente a MIA Paca-2 células con alta afinidad, pero no a A4. [
89Zr] 059-053 captación en MIA Paca-2 tumores aumentaron con el tiempo de la dosis inyectada 11,0 ± 1,3% por gramo (ID /g) en el día 1 hasta 16.9 ± 3.2% ID /g en el día 6, mientras que [ ,,,0],
125I] 059-053 absorción era relativamente bajo y disminuyó con el tiempo, lo que sugiere que fue interiorizado 059-053 en células tumorales
in vivo
y
125I se liberó de las células. PET con [
89Zr] 059-053 tumores subcutáneos y ortotópico claramente visualizados.
Conclusión
[
89Zr] 059-053 es una sonda PET prometedor para obtener imágenes de la expresión de CD147 en cáncer de páncreas y tiene el potencial para seleccionar a los pacientes apropiados con tumores que expresan CD147-que podrían beneficiarse de la terapia anti-CD147
Visto:. Sugyo a, AB Tsuji, Sudo H, K Nagatsu, Koizumi, M, y Ukai , et al. (2013) Evaluación de
89Zr humana marcada con anti-CD147 anticuerpo monoclonal como una tomografía sonda Tomografía por Emisión en un modelo de ratón de cáncer de páncreas. PLoS ONE 8 (4): e61230. doi: 10.1371 /journal.pone.0061230
Editor: C. Andrew Boswell, Genentech, Estados Unidos de América
Recibido: December 24, 2012; Aceptado: 7 Marzo 2013; Publicado: 5 Abril 2013
Derechos de Autor © 2013 Sugyo et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue financiado por el Instituto Nacional de Ciencias radiológicas de TS. La fuente de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de páncreas es un cáncer diagnosticado y la octava causa de muerte por cáncer en todo el mundo, lo que representa 278.684 nuevos casos estimados de cáncer y 266.669 estimados de muertes por cáncer [1] (GLOBOCAN 2008, http: //Globocan. iarc.fr/). pacientes con cáncer pancreático presentan síntomas menores en evaluación médica, y la naturaleza silenciosa de esta enfermedad que no es evidente hasta tarde en el proceso de la enfermedad contribuye a un pronóstico muy pobre. Sólo el 7% de los pacientes presentan tumores localizados, potencialmente curables al momento del diagnóstico y aproximadamente el 50% de los pacientes con cáncer de páncreas se diagnostican en estadios avanzados de la enfermedad [2]. La tasa de supervivencia global a 5 años entre los pacientes con cáncer de páncreas es del 6% en los Estados Unidos [2]. Por lo tanto, se requiere la terapia contra el cáncer eficaz adicional para aumentar y /o complementar las presentes estrategias de tratamiento, como la cirugía y la quimioterapia /radioterapia, especialmente para pacientes con cáncer metastásico.
CD147 (denominado EMMPRIN) es un 55- proteína transmembrana kDa de la superfamilia de inmunoglobulinas y está implicado en muchas funciones fisiológicas, tales como la espermatogénesis, la implantación del embrión, la activación de linfocitos, la formación de redes neuronales en las primeras etapas de inducción y de los transportadores de monocarboxilato [3]. CD147 se expresa en muchos tipos de tumores, incluyendo cáncer de páncreas [4]. CD147 induce la expresión de metaloproteinasas de la matriz (MMPs), tales como MMP-1, MMP-2, MMP-9, MT1-MMP, y factor de crecimiento endotelial vascular. La sobreexpresión de CD147 en células de cáncer de mama mediante la transfección de vectores de expresión dio lugar a un aumento del crecimiento tumoral y la metástasis [5]. Estos hallazgos sugieren que CD147 está implicado en la proliferación de invasión, metástasis, la angiogénesis y tumores, y por lo tanto es un buen candidato para la terapia del cáncer dirigida. El agotamiento de CD147 por la interferencia de ARN o anticuerpo específico reduce la proliferación, invasión, metástasis de tumores y formación de vasos sanguíneos, y por lo tanto los ensayos clínicos de la terapia CD147 orientada se han realizado [3], [6], [7]. Aunque la incidencia de la expresión de CD147 es alta (87%) en el cáncer de páncreas [4], algunos tumores no expresan CD147, y por lo tanto no son candidatos adecuados para la terapia de CD147-dirigida. Por tanto, es importante utilizar un método de exploración no invasiva para evaluar el estado de CD147 en un tumor individual en el momento de la planificación del tratamiento para seleccionar los pacientes adecuados para la terapia CD147-dirigida.
Recientemente, hemos aislado una novela totalmente monoclonal humano IgG
1 anticuerpo designado como 059 a 053 contra CD147 a partir de una biblioteca de anticuerpos humanos a gran escala construye utilizando un sistema de presentación de fagos de que incorpora un método de detección altamente eficiente denomina aislamiento de complejos antígeno-anticuerpo a través de disolvente orgánico, con la vida de cáncer de páncreas células [8]. Este anticuerpo induce la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) e inhibe la proliferación celular de células de cáncer de páncreas [8], [9]. En el presente estudio, se radiomarcado 059-053, y evaluamos el
in vitro
y
in vivo
propiedades como una sonda nueva tomografía por emisión de positrones (PET) para obtener imágenes de tumores que expresan CD147-en una modelo de cáncer de páncreas.
Materiales y Métodos
Las células
líneas celulares de cáncer pancreático humano (MIA Paca-2, PANC-1, BxPC-3, y AsPC-1) se obtuvieron de American Type Culture Collection (Manassas, VA, EE.UU.). células A4, establecidas a partir de células 3T3 de ratón transfectadas con un vector de expresión de HER2-humano [10], se utilizaron como control negativo. Las células se mantuvieron en medio RPMI 1640 (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.) suplementado con 5% de suero fetal bovino (Sigma) en un incubador humidificado mantenido a 37 ° C con 5% de CO
2.
subcutáneo y modelos de ratón ortotópico tumor
el animal protocolo experimental fue aprobado por el Comité de Cuidado y uso de animales del Instituto Nacional de Ciencias radiológicas, y todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices institucionales en relación con los animales cuidado y manejo. /C-nu /nu ratones macho BALB (5 semanas de edad, CLEA Japan, Tokio, Japón) se mantuvieron en condiciones libres de patógenos específicos. Para inducir un modelo de tumor subcutáneo, los ratones se inocularon por vía subcutánea con MIA Paca-2 (4 × 10
6) y A4 (1 × 10
6) células en los izquierdo y derecho muslos, respectivamente, bajo anestesia con isoflurano. Dado que las células A4 crecen más rápido que MIA Paca-2 células en ratones, el día de la inoculación de cada línea celular se ajustó para asegurar que los xenoinjertos tumorales fueron de igual tamaño en el momento de experimento (aproximadamente intervalo de 30 días entre las dos inoculaciones). Para inducir un modelo de tumor ortotópico, que se implanta quirúrgicamente un tumor en el páncreas xenoinjertado como se describe anteriormente [11]. En pocas palabras, un tumor subcutáneo se resecó asépticamente, se eliminaron los tejidos necróticos, y los tejidos tumorales viables restantes se picaron en trozos de aproximadamente 5 mm de diámetro en PBS (Sigma). Los ratones receptores se anestesiaron con isoflurano por inhalación, la piel y la pared abdominal se practicará una incisión por encima del páncreas, el páncreas se expone cuidadosamente, y una pieza de tumor se trasplantan en la cola del páncreas usando una sutura de seda 6-0 (Alfresa Pharma, Osaka, Japón). El páncreas fue devuelto a la cavidad peritoneal, y la piel y la pared abdominal se cierra con una sutura de seda 6-0.
CD147 expresión de la proteína análisis
transferencia de Western y tinción de inmunofluorescencia se llevaron a cabo como anteriormente se describe [12], [13]. Brevemente, para el Western Blot, el lisado celular se resolvieron mediante electroforesis en dodecil sulfato de gel de poliacrilamida de sodio, se transfirió a un fluoruro de polivinilideno (PVDF) membrana (Hybond-P, GE Healthcare, Little Chalfont, Reino Unido) y se hace reaccionar con un anti-CD147 monoclonal de conejo anticuerpo (EPR4053, Abcam, Cambridge, Reino Unido) durante 1 h a temperatura ambiente. El anticuerpo primario se hizo reaccionar con un anticuerpo anti-conejo unido a la peroxidasa de rábano picante (GE Healthcare) y la membrana se visualizó usando un kit ECL Plus (GE Healthcare). Después de las imágenes fueron capturadas usando un sistema de imagen LAS-3000 (Fujifilm, Tokyo, Japón), los anticuerpos en la membrana PVDF se eliminaron con tampón de extracción y se tiñeron la membrana con azul brillante de Coomassie (ATTO, Tokio, Japón) como control de carga. La intensidad de cada banda se cuantificó utilizando el software ImageJ (Instituto Nacional de Salud Mental, Bethesda, MD, EE.UU.). Para la tinción de inmunofluorescencia, las células se hicieron crecer en cubreobjetos de vidrio y se fijaron en metanol frío durante 5 min. La unión no específica del anticuerpo fue bloqueado mediante la aplicación de reactivo Block Ace (Dainippon Pharmaceutical, Osaka, Japón) con suero de cabra 10% para 30 min. Las células se incubaron con 059 a 053 como anticuerpo primario [8] durante la noche a 4 ° C. Un anticuerpo anti-humano secundario conjugado con Cy3 (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, EE.UU.) se aplicó durante 30 min a temperatura ambiente. Los núcleos se tiñeron con DAPI en medio de montaje. Las imágenes se obtuvieron con un tiempo de exposición de 500 ms para CD147 utilizando un microscopio de fluorescencia (Olympus, Tokio, Japón). La intensidad de la tinción CD147 en cada línea celular se cuantificó usando el software ImageJ. Para la tinción inmunohistoquímica, los ratones con tumores subcutáneos (MIA Paca-2 y A4) se sometieron a eutanasia y se retiraron los tumores y rápidamente congelados en compuesto óptimo de corte de temperatura (Sakura Finetek Japón, Tokyo, Japón). secciones secas (10 m de espesor) se fijaron con metanol frío y se sometieron a inmunotinción con anti-CD147 anticuerpo de cabra (AF972, R & amp; D Systems, Minneapolis, MN, EE.UU.). La unión no específica fue bloqueada por Block Ace regente con suero de cabra al 10%. Las muestras se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente con el anticuerpo primario. Un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa (tinción simple MAX-PO, Nichirei Biosciences, Tokio, Japón) se aplicó durante 30 min a temperatura ambiente y después se visualizó con un reactivo de tinción de diaminobencidina (solución simple a las manchas DAB, Nichirei Biosciences).
el radiomarcado del anticuerpo
en
67 Ga y
89Zr etiquetado, el anticuerpo monoclonal anti-CD147 humano 059-053 (IgG
1) [8] se conjugó con
p
-isothiocyanatobenzyl-deferoxamina B (DF; macrocíclicos, Dallas, TX, EE.UU.) en el DF para anticuerpo relación molar de 03:01, tal como se describe anteriormente [14]. La relación de conjugación del DF para anticuerpos se estimó en 1,0 a 1,3 desde
anticuerpo 67Ga-DF-conjugado con
relación 67Ga-DF determinado por cromatografía de exclusión por tamaños usando una columna PD10 (GE Healthcare) antes de la purificación. quelato no conjugado se eliminó usando una columna de centrifugación de Sephadex G-50 (GE Healthcare). Para el etiquetado
67 Ga, el anticuerpo conjugado DF (45 mg en 10 l de PBS) se incubó con 600 kBq de
67 Ga-cloruro de (70-80 MBq /ml, Nihon Medi-Física, Tokio, Japón) para 1 h a temperatura ambiente, y anticuerpos radiomarcados se purificaron en una columna de centrifugación de Sephadex G-50. El rendimiento radioquímico de
anticuerpo marcado con 67Ga era 45% a 63%, la pureza radioquímica fue mayor que 96%, y la actividad específica fue de 6 a 8 kBq /g determinado por cromatografía en columna PD10. Para
etiquetado 89Zr,
89Zr fue producido por un (p n,) la reacción de
89Y (New metales y productos químicos, Waltham Abbey, Reino Unido) en una vasija de cerámica de alúmina (Kyocera, Kioto, Japón) por irradiación vertical usando el NIRS AVF-930 ciclotrón y se purificó con una columna de hidroxamato por un aparato de recuperación /purificación automatizada como se describe anteriormente [15]. El anticuerpo DF-conjugado (100 mg en 20 l de PBS) se incubó con 2,8 a 5,2 MBq de
89Zr-oxalato (3.7 a 5.6 GBq /ml en 1 M oxalato, pH 7-8) durante 1 h a temperatura ambiente y anticuerpos radiomarcados se purificaron en una columna de centrifugación de Sephadex G-50. El rendimiento radioquímico de
anticuerpo marcado con 89Zr fue del 54% al 86%, la pureza radioquímica fue superior al 96%, y la actividad específica fue de 16 a 43 kBq /g determinado por cromatografía en capa fina utilizando 50 mM de ácido dietilentriaminopentaacético ( Sigma, pH 7) como fase móvil. etiquetado
125I se llevó a cabo con Na
125I (PerkinElmer, Waltham, MA, EE.UU.) y cloramina-T (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japón) como se describe anteriormente [12], lo que resulta en actividades específicas que van desde 119 a 669 Bq /g.
in vitro
ensayo
ensayos de unión celular, inhibición competitiva, y la internalización se llevaron a cabo como se describe anteriormente [16]. Brevemente, en un ensayo de unión de células, diluidas en serie las células MIA Paca-2 o A4 en PBS con 1% de BSA (Sigma) se incubaron con el anticuerpo radiomarcado en hielo durante 60 min. Después del lavado, se midió la radiactividad unida a las células. La inmunorreactividad de anticuerpos radiomarcados se estimó de acuerdo con el método de Lindmo
et al
. [17]. En un ensayo de inhibición competitiva, el anticuerpo radiomarcado se incuba con las células MIA Paca-2 en presencia de concentraciones variables de los anticuerpo no marcado en hielo durante 60 min. Después del lavado, se contó la radiactividad unida a las células. La constante de disociación se calcula mediante la aplicación de los datos a un modelo de unión de un sitio competitivo utilizando el software GraphPad Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA, EE.UU.). En un ensayo de internalización, MIA Paca-2 células se incubaron previamente en el medio de cultivo con
125I o
anticuerpo en hielo 67Ga marcado durante 60 minutos. Después del lavado, las células recogidas se cultivaron a 37 ° C o en hielo en medio fresco sin anticuerpos radiomarcados. En varios puntos de tiempo, el sobrenadante y las células se separaron por centrifugación. El ácido tricloroacético se añadió al sobrenadante en hielo y después se separa por centrifugación para determinar la fracción no unida a proteínas (sobrenadante) y la fracción unida a proteínas (pellet). Las células se lavaron con tampón ácido y luego se separaron por centrifugación para determinar tanto la fracción unida a la membrana (sobrenadante) y la fracción internalizado (pellet). Hemos llevado a cabo estos
in vitro
ensayos por duplicado.
biodistribución
Cuando los tumores subcutáneos alcanzaron un diámetro de aproximadamente 10 mm, los ratones fueron inyectados por vía intravenosa con la mezcla de
89Zr- y
anticuerpo marcado con 125I (37 kBq cada uno). La dosis total inyectada de proteína se ajustó a 20 g por ratón por la adición de anticuerpo no marcado. A 1, 2, 4, y 6 días después de la inyección de anticuerpo radiomarcado, cinco ratones en cada punto de tiempo se sometieron a eutanasia y se obtuvo sangre del corazón. Los tumores y los órganos principales se eliminaron y se pesaron, y los recuentos de radiactividad se midió usando un contador gamma (PerkinElmer). Los datos se expresaron como el porcentaje de dosis inyectada por gramo de tejido (% ID /g). Los datos se expresan como media ± desviación estándar. datos de absorción del tumor se analizaron por ANOVA con la prueba de comparación múltiple método de Student-Newman-Keuls.
PET /tomografía computarizada (TC)
Hemos llevado a cabo de imágenes en dos ratones con tumores subcutáneos (MIA Paca-2 y A4) con aproximadamente 10 mm de diámetro y un ratón que lleva un tumor ortotópico (MIA Paca-2 solo) 3 semanas después de la implantación. Los ratones fueron inyectados con aproximadamente 3,7 MBq de
anticuerpo marcado con 89Zr en la vena de la cola. La dosis de proteína inyectada se ajustó a 100 g por ratón por la adición de anticuerpo no marcado. adquisición de datos PET se realizó en 30 min, y 1, 2, 4 y 6 días después de la administración de 10 a 20 min usando un sistema de PET de pequeños animales (Inveon, Siemens Medical Solutions, Malvern, PA, EE.UU.) bajo anestesia con isoflurano. La temperatura corporal se mantuvo a 36 ° C a 37 ° C por una lámpara y una almohadilla térmica durante la exploración. Las imágenes fueron reconstruidas usando un máximo 3D
a posteriori gratis (18 iteraciones con 16 subconjuntos, ß = 0,2) sin corrección de atenuación. la captación del marcador se expresó como% ID /g. La región de interés se extrae manualmente sobre los tumores y la captación del marcador se cuantificó usando el software Pro ASI (Siemens Medical Solutions). Después de la exploración PET de un modelo de ratón ortotópico tumor, CT imágenes fueron adquiridas con una fuente de rayos X fijado en 90 kVp y 200 mu utilizando un sistema de TC de pequeños animales (R_mCT2, Rigaku, Tokio, Japón). Después de la impresión, realizamos experimentos de biodistribución para confirmar los resultados de PET.
Resultados
expresión de la proteína CD147 en las células de cáncer de páncreas y xenoinjertos
Se determinó la expresión de proteína CD147 en cuatro cáncer de páncreas humano líneas celulares (MIA Paca-2, PANC-1, BxPC-3, y ASPC-1) y la línea celular A4 ratón como control negativo, usando transferencia de Western y tinción de inmunofluorescencia. CD147 se expresa en las cuatro líneas celulares de cáncer pancreático humano, pero no en A4 (Figura 1A y B). MIA Paca-2 mostró la expresión más alta, seguida por AsPC-1, PANC-1, BxPC-3 y como se determina por análisis de transferencia Western (Figura 1A). MIA Paca-2 también mostró la expresión más alta, determinada por tinción de inmunofluorescencia, pero la expresión en AsPC-1, que fue segundo más alto en el Western Blot, fue menor que la de PANC-1 (Figura 1B). proteína CD147 fue localizada principalmente en la membrana plasmática de las células CD147-expresión (Figura 1B). expresión CD147 no fue detectado en las células A4 por transferencia Western o análisis de inmunofluorescencia. A continuación, se realizó CD147 tinción inmunohistoquímica de tumores subcutáneos MIA Paca-2 y A-4. En MIA Paca-2 tumores, las células cancerosas viables eran intensamente manchada, pero no células necróticas o estroma (panel superior Figura 1C). No se detectó expresión de la proteína en los tumores A4 (Figura 1C panel inferior).
(A) análisis de transferencia de Western de lisado celular total usando anti-CD147 anticuerpos (panel superior) y tinción con azul brillante de Coomassie de la misma membrana PVDF como control de carga (panel inferior). La relación de intensidad de la banda se muestra debajo de los paneles. (B) Localización subcelular de la proteína CD147 determinado por tinción de inmunofluorescencia con anti-CD147 anticuerpo (rojo) y la tinción de ácidos nucleicos DAPI (azul). La relación de la intensidad de CD147 se muestra a la derecha de los paneles. (C) CD147 expresión en MIA Paca-2 (superior) y A4 (inferiores), los tumores xenoinjertados determinó mediante tinción inmunohistoquímica de secciones congeladas (10 micras de espesor).
in vitro
caracterización de radiomarcado 059-053
etiqueta anticuerpo monoclonal anti-CD147 humano con 059-053
125I,
67Ga, o
89Zr y llevó a cabo un ensayo de unión celular. La unión de [
125I] 059-053, [
67 Ga] 059-053, y [
89Zr] 059-053 a 5 x 10
6 MIA Paca-2 células fue del 63%, 73 %, y 94%, respectivamente (Figura 2A). Sin embargo, la unión de [
125I] 5 × 10
6 A4 células de 059-053 fue de solo 1,3% (datos no mostrados). La fracción inmunorreactiva de [
125I] 059-053, [
67 Ga] 059-053, y [
89Zr] 059-053 en las células MIA Paca-2 se estimó en 0.80, 0.96, y 1.00 , respectivamente. El sitio de unión constante y de disociación en equilibrio de 059 a 053 se estimó en 15,3 nM y 5,4 × 10
4 sitios por célula MIA Paca-2, respectivamente, por ensayo de inhibición competitiva (Figura 2B). Examinamos el cambio temporal en la localización de la radiactividad y 059-053 [
125I] 059-053 en MIA Paca-2 células [
67Ga]. La fracción unida a la membrana celular disminuyó rápidamente, mientras que la fracción unida a proteínas en el medio de cultivo se incrementó rápidamente para ambos anticuerpos radiomarcados (Figura 2C y D). Aproximadamente el 10% de [
67 Ga] 059-053 a su máxima fue internalizada después de la incubación (Figura 2C). Cuando las células se incubaron en hielo, la fracción unida a la membrana no cambió durante al menos 3 h (datos no mostrados).
(A) ensayo de unión celular para [
89Zr] 059-053 (blanco triángulos), [
67 Ga] 059-053 (círculos blancos) y [
125I] 059-053 (círculos negros). (B) ensayo de inhibición competitiva para [
125I] 059-053 (círculos negros). ensayo de internalización para [
67 Ga] 059-053 (C) y [
125I] 059-053 (D). Los cambios en el% de la radiactividad total para cada fracción se representan frente a tiempo de incubación a 37 ° C (círculos negros, fracción interiorizado; círculos blancos, la fracción unida a la membrana; triángulos negros, la fracción unida a proteínas en el medio de cultivo; cruce las marcas, no unido a proteína fracción en el medio de cultivo). Estos ensayos se llevaron a cabo por duplicado. Los datos representan cada réplica en A y B y C significan en
En vivo Red de biodistribución radiomarcados 059-053
experimentos de biodistribución utilizando
89Zr- y
125 I-etiquetados 059-053 se realizaron en ratones desnudos que lleven las dos MIA Paca-2 y xenoinjertos de tumores A4 (n = 5 en cada punto de tiempo). [
89Zr] 059-053 captación en MIA Paca-2 tumores fue 11,0 ± 1,3% ID /g en el día 1, que aumentó con el tiempo alcanzando 16,9 ± 3,2% ID /g en el día 6 (Figura 3A). Por el contrario, la captación en los tumores A4 (no CD147-expresión) fue baja y la disminución con el tiempo (Figura 3A). MIA relación de adsorción de Paca-2-a-A4 de [
89Zr] 059-053 fue 1,7 ± 0,2 en el día 1 y aumentó con el tiempo (7,1 ± 0,5 en el día 6). La captación de [
89Zr] 059-053 en los órganos principales normales, incluyendo el páncreas fue baja y disminuye gradualmente con el tiempo, excepto para el hueso (Figura 3A). La relación de captación tumoral-a-páncreas de [
89Zr] 059-053 fue de 9,1 ± 1,5 en el día 1 en MIA Paca-2 tumores, y aumentó a 30,0 ± 6,7 en el día 6. MIA Paca-2 captación tumoral de [
125I] 059-053 fue 4,6 ± 0,5% ID /g en el día 1 y persistió hasta el día 2, (4,6 ± 1,6% ID /g), pero disminuyó después (Figura 3B). La captación en órganos principales normales de [
125I] 059-053 disminuyó gradualmente con el tiempo incluyendo el hueso (Figura 3B). [
89Zr] 059-053 captación en MIA Paca-2 tumores en todos los tiempos fue significativamente mayor en comparación con la de los tumores A4 y [
125I] 059-053 captación en los tumores Paca-2 y A4 MIA (
P Hotel & lt; 0,01)
Las muestras se recogieron y se ponderaron, y se midió la radiactividad en el día 1 (barras blancas), 2 (barras de puntos), 4 (barras grises) y 6 (negro. bares) después de la inyección intravenosa de 37 kBq cada uno de [
89Zr] 059-053 (A) y [
125I] 059-053 (B). Los datos se expresan como media ± desviación estándar (n = 5). *
P
. & Lt; 0,01 frente a [
89Zr] 059-053 captación tumoral en cada punto de tiempo analizados por ANOVA con la prueba de comparación múltiple método de Student-Newman-Keuls
imágenes de PET de ratones portadores de tumores con [
89Zr] 059-053
Para confirmar el resultado del estudio de biodistribución, se realizó la PET con [
89Zr] 059-053. las imágenes de PET en serie en dos modelos de tumores subcutáneos con tumores Paca-2 y A4 MIA se obtuvieron a 30 min, y los días 1, 2, 4, y 6 después de la inyección. En 30 min, la radiactividad en la piscina de sangre fue muy alta, mientras que en los tumores Paca-2 y A4 MIA fue baja, sin diferencia entre los dos (Figura 4A). Al día 1, la captación en MIA Paca-2 tumores (10,8% ID /g) se aumentó notablemente y más alto que en los tumores A4 (6,6% ID /g), y se redujo la actividad de fondo. El tumor MIA Paca-2 captación aumentó aún más de 12,2% ID /g en el día 2 a 17,5% ID /g en el día 6, mientras que la actividad de fondo siguió disminuyendo, lo que resulta en un aumento en el contraste de MIA Paca-2 tumores durante tiempo (Figura 4A). A4 captación tumoral disminuye gradualmente desde el 6,6% ID /g en el día 1 hasta el 4,1% ID /g en el día 6. Estos datos eran básicamente consistente con los resultados del estudio de biodistribución. imágenes PET /TC en el modelo de tumor ortotópico obtenido en el día 6 mostraron que el PET con [
89Zr] 059-053 podría visualizar el tumor implantado ortotópico situado en la cola del páncreas (Figura 4B). A partir de los datos de PET en el modelo ortotópico, captación tumoral de [
89Zr] 059-053 fue del 8,6% ID /g en el día 6. A partir de los datos de biodistribución después de PET, [
89Zr] 059-053 captación en el mismo ortotópico tumoral fue del 15,5% ID /g. Dado que el tamaño del tumor ortotópico fue de aproximadamente 5 mm de diámetro, el efecto de volumen parcial podría afectar a los datos cuantitativos de PET.
(A) las imágenes de PET en serie (máxima intensidad de proyección) de un ratón desnudo que lleva MIA PaCa- 2 (punta de flecha amarilla) y A4 (punta de flecha blanca) tumores xenoinjertados en 30 minutos, y los días 1, 2, 4 y 6 después de la inyección intravenosa de 3,7 MBq [
89Zr] 059-053. las imágenes de PET del mismo ratón se muestran en diferentes ajustes de escala. (B) coronal (superior) y transaxial (inferior) de imágenes PET /CT en el modelo de ratón ortotópico de cáncer de páncreas (cabeza de flecha amarilla, MIA Paca-2) en el día 6 después de la inyección.
Discusión
el cáncer de páncreas es una de las neoplasias humanas más letales, ocupando el quinto y cuarto lugar entre la muerte por cáncer en hombres y mujeres, respectivamente, en los países económicamente desarrollados [1]. Su pronóstico es muy pobre y la tasa de supervivencia a 5 años para los pacientes en los Estados Unidos con cáncer metastásico localizada y distante es del 22% y 2%, respectivamente [2]. Por lo tanto, se requiere la terapia contra el cáncer eficaz adicional, especialmente para pacientes con cáncer metastásico. CD147 se expresa altamente en el cáncer de páncreas [4] y está implicado en el proceso metastásico [3], y por lo tanto se considera un buen candidato para la terapia dirigida contra el cáncer [3]. de imagen no invasiva-CD147 específica podría ser útil para seleccionar los pacientes adecuados con más probabilidades de beneficiarse de la terapia anti-CD147. En el presente estudio, se evaluó la
in vitro
y
in vivo
propiedades de un nuevo anticuerpo monoclonal completamente humano que reconoce CD147 059-053, y marcado con un emisor de positrones
89Zr, para desarrollar una nueva sonda PET para detectar la expresión de CD147 en el cáncer de páncreas
.
en primer lugar, se evaluó la expresión de proteína CD147 de cuatro líneas celulares de cáncer pancreático (MIA Paca-2, PANC-1, BxPC-3, y AsPC-1) por el Western Blot y la tinción de inmunofluorescencia para seleccionar una línea celular de cáncer de páncreas adecuado para evaluar radiomarcado 059-053. La línea celular MIA Paca-2 mostró la más alta expresión según lo determinado por el Western Blot y análisis de la tinción de inmunofluorescencia. Además, confirmamos que MIA Paca-2 células formaron tumores subcutáneos y ortotópicos en ratones desnudos y la expresión de alto CD147 en estos tumores se determinó por tinción inmunohistoquímica. A4 células no mostraron expresión de la proteína CD147 ya sea
in vitro
o
in vivo
. Por lo tanto, se optó por células MIA Paca-2 como control positivo y las células A4 como control negativo para la siguiente evaluación.
A continuación, se radiomarcado con 059 a 053
125I,
67Ga, o
89Zr y evaluado sus propiedades
in vitro
. Cell ensayos de unión y de inhibición competitiva reveló que 059-053 específicamente unido a MIA Paca-2 células con alta afinidad, pero no a las células A4. La fracción inmunorreactiva de anticuerpos radiomarcados fue de más de 0,8, lo que indica que la pérdida de inmunorreactividad por procedimientos de radiomarcaje fue mínima. El ensayo de internalización mostró que las fracciones unidas a proteínas en el medio de cultivo se incrementó rápidamente después de la incubación a 37 ° C, y la fracción interiorizado fue baja. Esto sugiere que CD147 complejo-anticuerpo se separa fácilmente de la membrana plasmática en las condiciones /procedimientos de este experimento internalización. En el presente estudio, aunque hemos empleado
67Ga en nombre de
89Zr para el ensayo de internalización, este resultado se considera que es consistente con que el uso de anticuerpo marcado con 89Zr
porque el quelato (DF) es común entre dos metales radiactivos, estos metales radiactivos con complejo DF es conocida por ser estable
in vitro
y
in vivo
[18], [19], [20], [21], [22], y biodistribución se informó a ser similar entre
68Ga- y
anticuerpo marcado con 89Zr [20]. En contraste con el resultado de ensayo de internalización, la
in vivo
estudio demostró que la distribución de captación de [
89Zr] 059-053 en MIA Paca-2 tumores era muy alto y aumentó con el tiempo, lo que sugiere que la complejo CD147-anticuerpo se puede separar completamente de la membrana
in vivo
. Además, una diferencia en los patrones de captación tumoral entre [
89Zr] 059-053 y [
125I] 059-053 sugiere fuertemente que radiomarcado 059-053 fue interiorizado en las células después de la unión a CD147 en la superficie celular
in vivo. Tras el metabolismo dentro de las células,
actividad de 125I se elimina de las células, mientras que
89Zr actividad se mantendría en las células. En conjunto, la tripsinización de las células causado probablemente los resultados que observamos en el ensayo de internalización, aunque la duración de la tripsinización se hizo lo más corto posible para minimizar el daño a CD147 en la superficie celular por la tripsina. En el presente caso, el
in vivo
distribución no era plenamente recapitulado por los
in vitro
experimentos. Es de destacar que el
in vivo
estudio con xenoinjertos subcutáneos demostró que [
89Zr] 059-053 altamente acumulado en MIA Paca-2 tumores, pero no en los tumores de tamaño A4. Esto fue confirmado por formación de imágenes PET de serie, lo que indica que [
89Zr] 059-053 es una sonda de PET prometedora para la detección de tumores que expresan CD147-y en la selección de pacientes adecuados para la terapia anti-CD147. Los estudios de biodistribución han demostrado que la captación de [
89Zr] 059-053 en los órganos principales normales disminuyó con el tiempo, excepto para el hueso, lo que no es probable que sea la captación de anticuerpo real, pero hueso búsqueda
catabolitos 89Zr de la misma en cuanto a otros antígenos [21], [22], [23], [24]. Dado que nuestro anticuerpo anti-CD147 059-053 no se une a CD147 de ratón, nuestros resultados en el modelo murino no pueden predecir totalmente la distribución en pacientes humanos. CD147 expresión se informó a ser altos en la mayoría de los tejidos de cáncer, pero está limitada en tejidos normales [4]. La gammagrafía con
marcado con 131I anti-CD147 F (ab ')
2 en pacientes con carcinoma hepatocelular (HCC) ha mostrado menor captación en órganos normales que en los tejidos HCC [25]. Por lo tanto, nuestro anti-CD147 se espera anticuerpo 059-053 para mostrar baja acumulación en los órganos normales de los pacientes, aunque será necesario un mayor estudio clínico para evaluar con precisión la absorción normal del órgano.
modelos de tumores subcutáneos son herramientas poderosas para oncológico investigaciones, pero estos modelos no siempre pueden imitar los hallazgos clínicos.