Extracto
La gemcitabina (Gem) ha limitado los beneficios clínicos en adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC). El presente estudio investigó las combinaciones de gemcitabina con agentes antiangiogénicos de diversos mecanismos para la PDAC, incluyendo bevacizumab (BEV), sunitinib (Sb) y EMAP II. La proliferación celular y la expresión de proteínas se analizaron por WST-1 de ensayo y transferencia Western. En experimentos in vivo se llevaron a cabo a través de xenoinjertos murinos. La inhibición de la proliferación in vitro de AsPC-1 células PDAC por gemcitabina (10 mM), bevacizumab (1 mg /ml), sunitinib (10 M) y EMAP (10 mM) fue 35, 22, 81 y 6 por ciento; combinación de gemcitabina con bevacizumab, sunitinib o EMAP no tenía efectos aditivos. En HUVEC endoteliales, gemcitabina, bevacizumab, sunitinib y EMAP causado inhibición 70, 41, 86 y 67 por ciento, mientras que la combinación de gemcitabina con bevacizumab, sunitinib o EMAP tenía efectos aditivos. En WI-38 fibroblastos, gemcitabina, bevacizumab, sunitinib y EMAP causado 79, 58, 80 y 29 por ciento de inhibición, con efectos aditivos en combinación también. Neto en la inhibición del crecimiento tumoral in vivo gemcitabina, bevacizumab, sunitinib y la monoterapia con EMAP fue de 43, 38, 94 y 46 por ciento; duales combinaciones de Gem + Bev, Gem + Su y Gem + EMAP llevaron a la inhibición 69, 99 y 64 por ciento. Las combinaciones de más de un agente antiangiogénico con gemcitabina fueron en general más eficaz, pero no superior a Gem + Su. resultados de proliferación intratumoral, la apoptosis y la densidad de los microvasos correlacionados con los datos de inhibición de crecimiento del tumor. La mediana de supervivencia de los animales se incrementó en gemcitabina (26 días), pero no por bevacizumab, sunitinib o monoterapia EMAP comparación con los controles (19 días). combinaciones de gemcitabina con bevacizumab, sunitinib o EMAP una supervivencia mayor a medida similar (36 o 37 días). Las combinaciones de gemcitabina con Bev + EMAP (43 días) o con Bev + su + EMAP (46 días) llevó a la prestación máxima supervivencia observada. Combinación de agentes antiangiogénicos mejora la respuesta de gemcitabina, con sunitinib inducir el efecto más fuerte. Estos hallazgos demuestran ventajas de la combinación de agentes de metas múltiples con el tratamiento con gemcitabina estándar para PDAC
Visto:. Awasthi N, Zhang C, W Ruan, MA Schwarz, Schwarz RE (2012) Evaluación de Poly-mecanicistas antiangiogénicos Combinaciones de mejorar la terapia citotóxica de respuesta en cáncer de páncreas. PLoS ONE 7 (6): e38477. doi: 10.1371 /journal.pone.0038477
Editor: Chryso Kanthou, Universidad de Sheffield, Reino Unido
Recibido: 28 Noviembre 2011; Aceptado: 9 Mayo 2012; Publicado: 18 Junio 2012
Derechos de Autor © 2012 Awasthi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
pancreático adenocarcinoma ductal (PDAC) es uno de los más. la mayoría de los cánceres humanos agresivos y sigue siendo la cuarta causa de muerte por cáncer en los Estados Unidos. La rápida progresión del tumor, el diagnóstico tardío, temprana y metástasis agresiva y una alta resistencia a la quimioterapia convencional conduce a excepcionalmente mal pronóstico con una tasa de supervivencia a 5 años inferior al 5% [1]. El tratamiento de la PDAC depende de la etapa del cáncer; la tasa global de resección es sólo del 10 al 15%, y la recurrencia postoperatoria es común [2], [3], [4]. Mucha atención se ha enfocado hacia las opciones de tratamiento sistémico para PDAC para su posible beneficio de la terapia definitiva o perioperatoria. La gemcitabina (Gem), un análogo de nucleósido desoxicitidina, es un agente citotóxico que causa la inhibición de la síntesis de ADN y la muerte celular. La Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) aprobó la gemcitabina para el tratamiento de avanzada PDAC en 1997. Sin embargo, la gemcitabina es clínicamente eficaz sólo en el 20-30% de los pacientes PDAC, que conduce a una mediana de supervivencia libre de progresión de 5,7 meses, en comparación con 4,4 meses en el grupo tratado con 5-fluorouracilo [5]. regímenes de quimioterapia combinada basada en gemcitabina no han podido demostrar ninguna ventaja de supervivencia significativa sobre la gemcitabina sola agente [6], [7]. Estos hechos demuestran claramente la necesidad urgente de nuevos y más eficaces estrategias terapéuticas para el PDAC.
La angiogénesis, un proceso por el cual los tumores adquieren suministro de sangre para su crecimiento continuo, es esencial para la progresión de tumores sólidos primarios y metastásicos incluyendo PDAC. La angiogénesis se inicia por la hipoxia, factores de crecimiento, citoquinas, y la activación de proto-oncogén y la desactivación de los mecanismos de gen supresor de tumores [8]. Orientación de la angiogénesis para reducir la progresión tumoral y la metástasis puede producir nuevo enfoque para la terapia de combinación. agentes antiangiogénicos tales como anti-factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF) agente bevacizumab (BEV), inhibidores de metaloproteinasa de la matriz (marimastat) e inhibidores de la ciclooxigenasa (celecoxib) se han estudiado en la terapia de combinación en modelos PDAC con beneficio de supervivencia limitado [9], [10 ], [11]. Erlotinib, el inhibidor del receptor del factor de crecimiento epidérmico, hasta la fecha ha sido el único agente mediador de un modesto beneficio en la supervivencia global en combinación con gemcitabina [12].
Muchos informes en la literatura sugieren que la señalización de VEGF juega un papel importante en la progresión de la PDAC [13], [14], [15], [16]. Por lo tanto el bevacizumab, un anticuerpo monoclonal humanizado recombinante contra VEGF, se evaluó en fase II y fase III de ensayos clínicos. Aunque la combinación de bevacizumab y gemcitabina mostró cierta promesa en un ensayo de fase II, no se observó una mejoría significativa en posteriores estudios de fase III [17]. Sunitinib (Sb) es un inhibidor de objetivos múltiples de la tirosina quinasa del receptor (RTK) con actividades antiangiogénicas y antitumorales [18], [19], [20]. Sunitinib inhibe las RTK expresadas por las células tumorales que están involucrados en la proliferación de células tumorales y la supervivencia incluyendo el receptor del factor de células madre (c-KIT), relacionada con Fms tirosina quinasa 3 (FLT3), la línea celular glial deriva del receptor del factor neurotrófico (RET) y estimulante de colonias de tipo factor de 1 receptor (CSF-1R) [18], [19]. Sunitinib también inhibe las RTK expresa en las células endoteliales y murales, tales como receptores de VEGF (tipo 1 y 2) y factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), los receptores α y β [20], [21]. En PDAC humano, los receptores de VEGF y los receptores de PDGF son sobre-expresó y se han correlacionado con mal pronóstico [22], [23], [24]. Sunitinib ha demostrado tener una eficacia antitumoral en PDAC experimental [25], [26], [27]. monocitos endotelial polipéptido activador II (EMAP) es una citoquina proinflamatoria con actividades antiangiogénicas y antiendoteliales. EMAP tiene potentes efectos sobre las células endoteliales (EC) como la inhibición de la proliferación, la migración y la vascularización, así como la inducción de la apoptosis [28], [29]. EMAP suprime el crecimiento del tumor primario y metastásico [28], [30], [31] que podría estar relacionada con su capacidad para unirse a receptores de VEGF y la integrina α5β1, dando lugar a una interferencia en VEGF fibronectina y señalización [32], [33] . EMAP Recientemente se ha demostrado que mejora la respuesta gemcitabina y docetaxel en PDAC experimental [34], [35], [36]. El presente estudio evaluó y comparó los beneficios del tratamiento de combinación de gemcitabina con tres agentes antiangiogénicos bevacizumab, sunitinib y EMAP para aplicaciones clínicas PDAC potencialmente mejoradas.
AsPC-1, los cultivos de células HUVEC y WI-38 se trataron con Gem (10 M), Bev (1 mg /ml), Su (10 M) y EMAP (10 mM), ya sea solo o en combinación durante 16 horas. lisado total de células de los grupos de tratamiento se sometió a SDS-PAGE e inmunotransferencia. La expresión de α-tubulina se analizó como control de carga interno. Los datos son representativos de dos experimentos independientes con resultados similares.
Materiales y Métodos
Materiales
La gemcitabina se adquirió de Eli Lilly (Indianapolis, IN). Bevacizumab fue adquirido de Genentech (South San Francisco, CA). Sunitinib fue adquirido de LC Laboratories, Inc. (Woburn, MA). EMAP humana recombinante se preparó como se describe anteriormente [37], mientras que el reactivo de proliferación celular WST-1 se adquirió de Roche Diagnostic Corporation (Indianapolis, IN).
Cell Cultura
El cáncer de páncreas humano línea de células AsPC-1, la línea celular de fibroblastos humanos células endoteliales de vena umbilical humana WI-38 y (HUVECs) fueron adquiridos de la American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). AsPC-1 y las células WI-38 se cultivaron en medio RPMI 1640 y DMEM, respectivamente (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS). HUVECs fueron cultivadas en medio EndoGRO-LS contiene endoteliales suplementos de crecimiento de células (Millipore Corp., Billerica, MA).
viabilidad celular Ensayo
In vitro la viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo de WST-1 . Cuatro mil células se sembraron en una placa de 96 pocillos y después de 16 horas el medio fue reemplazado con medio que contiene suero bajo. Las células fueron tratadas con la gemcitabina, bevacizumab, sunitinib y EMAP. La gama de concentraciones utilizadas para gemcitabina, sunitinib y EMAP (10 nM a 10 mM); y para bevacizumab (1 mg /ml a 1 mg /ml) fue comparable a concentraciones clínicamente alcanzables. Después de una incubación de 72 horas, se añadió 10 l reactivo WST-1 en cada pocillo, y se midió la absorbancia a 450 nm después de 2 horas usando un lector de microplacas.
ratones desnudos fueron inyectados por vía subcutánea con AsPC-1 de células (0,75 × 10
6) y se trató con Gem, Bev, Su y EMAP, ya sea solo o en combinación, durante 2 semanas. El crecimiento del tumor se midió 2 veces a la semana usando calibradores, y el crecimiento neto del tumor se calculó restando el volumen del tumor en el primer día de tratamiento desde que en el día final. Los datos son representativos de los valores medios de 6-8 ratones por grupo.
Los ratones desnudos fueron inyectados por vía subcutánea con células AsPC-1 (0,75 × 10
6) y se trató con Gema, Bev, Su y EMAP, ya sea solo o en combinación, durante 2 semanas. secciones de tejido tumoral (A) se immunostained con antígeno nuclear Ki67 y se fotografiaron con un microscopio fluorescente. células Ki67 positivas (B) fueron contados en cinco campos de alta potencia diferentes. Los datos se expresan como la media ± desviación estándar. • Símbolos y * representan diferencias significativas (P & lt; 0,05) en comparación con los controles y el grupo de la gema, respectivamente
Los ratones desnudos fueron inyectados por vía subcutánea con células AsPC-1 (0,75 × 10
6) y. tratado con Gem, Bev, Su y EMAP, ya sea solo o en combinación, durante 2 semanas. secciones de tejido tumoral (A) se tiñeron con el procedimiento TUNEL y se fotografiaron con un microscopio fluorescente. (B) las células apoptóticas TUNEL-positivas fueron contados en cinco campos de alta potencia diferentes. Los datos se expresan como la media ± desviación estándar. • Símbolos y * representan diferencias significativas (P & lt; 0,05) en comparación con los controles y el grupo de la gema, respectivamente
Los ratones desnudos fueron inyectados por vía subcutánea con células AsPC-1 (0,75 × 10
6) y. tratado con Gem, Bev, Su y EMAP, ya sea solo o en combinación, durante 2 semanas. secciones de tejido tumoral (A) se tiñeron con PECAM-1 anticuerpo y se fotografiaron con un microscopio fluorescente. (B) PECAM-1 positivo microvasos fueron contados en cinco campos de alta potencia diferentes. Los datos se expresan como la media ± desviación estándar. • Símbolos y * representan diferencias significativas (P & lt; 0,05). Comparado con los controles y el grupo de la gema, respectivamente
células (0,75 × 10
6) fueron inyectados por vía intraperitoneal en ratones SCID-1 AsPC, y después de 2 semanas seguido de tratamiento con Gem, Bev, Su y EMAP, ya sea solo o en combinación, para una duración de 2 semanas. La curva representa el tiempo de supervivencia de los animales desde el comienzo del tratamiento.
análisis de transferencia Western
A monocapa de células sub-confluentes se trató con gemcitabina (10 mM), bevacizumab (1 mg /ml), sunitinib (10 M) o EMAP (10 mM) y se incubaron 12 horas para HUVECs y 24 horas para AsPC-1 y las células WI-38. lisado celular total se preparó, concentración de proteína medido y cantidades iguales de proteína se separaron mediante SDS-PAGE y se transfirió a membranas de PVDF (Bio-Rad, Hercules, CA). Las membranas se bloquearon durante 1 hora en solución de bloqueo (leche 5% en TBS-T [solución salina tamponada con Tris que contiene Tween-20]) y se incubaron durante la noche a 4 ° C con los anticuerpos siguientes: poli escindido (ADP-ribosa) polimerasa- 1 (PARP-1), se escindió de la caspasa-3 (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) o α-tubulina (Sigma). Las membranas se incubaron entonces con los correspondientes anticuerpos secundarios conjugados con HRP (Pierce Biotechnologies, Santa Cruz, CA) durante 1 hora a temperatura ambiente. Específicas bandas se detectaron utilizando el reactivo de quimioluminiscencia mejorada (ECL, Perkin Elmer Life Sciences, Boston, MA) en la película de autorradiografía y se cuantificaron por densitometría.
implantación del tumor e in vivo Experimento crecimiento tumoral
Todo los procedimientos con animales y el cuidado se realizaron de acuerdo con las directrices y los protocolos aprobados de la Universidad de Texas Southwestern Medical Center (Dallas, TX) cuidado de animales institucional y el empleo Comisión (Protocolo Animal Número 2008 a 0348). ratones desnudos atímicos hembra (edad 4-8 semanas) se utilizaron en el modelo de xenoinjerto subcutáneo. cáncer de páncreas células AsPC-1 humano (0.75 × 10
6) fueron inyectadas subcutáneamente en cada ratón. Después de 14 días, cuando todos los ratones tenían tumores medibles, los ratones se agruparon al azar (n = 6 a 8 por grupo) y se trataron por vía intraperitoneal con PBS (control), gemcitabina (100 mg /kg, dos veces por semana), bevacizumab (10 g por ratón, dos veces por semana), sunitinib (40 mg /kg durante 1
ª semana, 20 mg /kg durante 2
ª semana, 5 veces a la semana) y EMAP (80 mg /kg, 5 veces a la semana) durante 2 semanas. El tamaño del tumor en todos los ratones se midió dos veces por semana por el calibrador. El volumen del tumor (V) se calculó utilizando la fórmula [V = ½ (L x (W)
2], donde se calculó L = longitud y W = ancho. crecimiento neto en el tamaño del tumor para cada animal restando el volumen del tumor en el primer día de tratamiento de que en el último día. Después de la finalización del tratamiento, todos los animales fueron sacrificados, los tumores se retiraron, se pesaron, se diseccionaron y se procesaron para el análisis histológico o inmunohistoquímico.
Histología y análisis inmunohistoquímico
muestras de tejido tumoral fijados en paraformaldehído al 4% y embebidas en parafina se utilizaron para análisis histológico e inmunohistoquímico. actividad proliferativa intratumoral se midió utilizando por Ki67 tinción antígeno nuclear según el protocolo del fabricante (Abcam, Cambridge, MA). en pocas palabras, parafina se cortaron secciones de tejido de tumores -embedded, deparaffinized, rehidratada y el antígeno recuperado. Las secciones de tejido se incubaron con tampón de bloqueo CAS seguido de incubación de 1 hora con el anticuerpo Ki67 (1:200 dilución). Las secciones de tejido fueron incubadas con Cy3 (1 :200 dilución) anticuerpo secundario (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) durante 40 minutos. Los portaobjetos se montaron utilizando solución de montaje que contiene 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (Invitrogen, Carlsbad, CA). La actividad proliferativa se evaluó mediante el cálculo de las células Ki67 positivas a partir de cinco campos de alta potencia diferentes (HPF) en una forma ciega. Para la detección de la densidad de microvasos (MVD), las secciones de tejido se incubaron con 1:100 dilución de PECAM-1 anticuerpo (CD-31) (BD Pharmingen, Bedford, MA) durante la noche a 4 ° C. Las secciones de tejido se incubaron con 1:200 dilución de Cy3 anticuerpo secundario durante 40 minutos. Los portaobjetos se montaron utilizando solución de montaje que contiene DAPI, y MVD se evaluó contando PECAM-1 vasos positivos dentro de un HPF microscópica en una forma ciega. apoptosis intratumoral se analizó por tinción secciones de tejido con "Kit de Detección de Apoptosis Apoptag" de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Millipore). La microscopía de fluorescencia se utilizó para detectar señales de fluorescencia utilizando el microscopio IX81 de Olympus y las imágenes fueron capturadas con una cámara digital Hamamatsu Orca (Hamamatsu Corporation, Bridgewater, NJ) con una unidad de hilado confocal ESD utilizando el software Slidebook (innovaciones de imagen inteligente, Philadelphia, PA).
Análisis de supervivencia de animales
estudios de supervivencia de animales se realizaron con 6 a 8 semanas de edad, los ratones SCID hembra [38]. AsPC-1 (0,75 × 10
6) se inyectaron las células por vía intraperitoneal en cada ratón y después de dos semanas los ratones se agruparon al azar (n = 6 a 8 por grupo) y se trataron por vía intraperitoneal con PBS (control), gemcitabina (100 mg /kg, dos veces por semana), bevacizumab (10 mg por ratón, dos veces por semana), sunitinib (40 mg /kg durante 1
ª semana, 20 mg /kg durante 2
ª semana, 5 veces a la semana) o EMAP ( 80 mg /kg, 5 veces a la semana) durante 2 semanas. Los animales fueron sacrificados al girar moribundo en función de criterios predefinidos, incluyendo la pérdida rápida de peso o ganancia (& gt; 15%), el tamaño del tumor, letargo, incapacidad para permanecer en posición vertical y la falta de fuerza. La supervivencia se evaluó a partir del primer día de tratamiento hasta la muerte.
Análisis estadístico
La significación estadística se analizó mediante la prueba t de Student de dos colas utilizando GraphPad Prisma 4 (GraphPad Software, San Diego , CA). En la celda datos in vitro de proliferación se expresan como media ± desviación estándar. Aditividad de las combinaciones de fármacos se determinó mediante el cálculo de un "índice de interacción" con el Chou TC, Talalay P [39] y Lee JJ [40] métodos. El análisis estadístico de los estudios in vivo se realizó por ANOVA para la comparación grupo múltiple y la prueba t de Student para la comparación grupo individual. estadísticas del estudio de supervivencia se evaluaron con Statview para Macintosh (SAS, Carey, Carolina del Norte) por las estadísticas de supervivencia no paramétricas y la prueba de rango logarítmico. 0,05 fueron considerados para representar las diferencias entre grupos estadísticamente significativas
Resultados
Efecto de la gemcitabina, bevacizumab, sunitinib y EMAP de Proliferación Celular
Análisis in vitro la proliferación celular; valores de p & lt. en ASPC-1 en las células de gemcitabina (10 mM), bevacizumab (1 mg /ml), sunitinib (10 M) y EMAP (10 M) mostró una inhibición 35, 22, 81 y 6 por ciento en la proliferación celular, respectivamente. Las combinaciones de gemcitabina con agentes antiangiogénicos individuales bevacizumab o EMAP no tenía efectos aditivos, mientras que la combinación de gemcitabina con sunitinib no podría superar los efectos de solo sunitinib agente. Las combinaciones de más de un agente antiangiogénico con gemcitabina no tenían aditivo en los efectos in vitro (Tabla 1). Aunque gemcitabina tenían diversos efectos sobre las otras líneas celulares PDAC BxPC-3, MIA PaCa-2 y Panc-1, los efectos de combinaciones de agentes antiangiogénicos tenido resultados similares a los observados con AsPC-1 (datos no presentados).
en HUVECs, gemcitabina (10 mM), bevacizumab (1 mg /ml), sunitinib (10 M) y EMAP (10 mM) de tratamiento causó una inhibición de 70, 41, 86 y 67 por ciento en la proliferación celular, respectivamente. Las combinaciones de gemcitabina con un solo agente bevacizumab, sunitinib o EMAP dieron como resultado efectos aditivos significativos sobre la inhibición de la proliferación. Sin embargo, la combinación de más de un agente antiangiogénico no tenía efecto aditivo. En las células WI-38, gemcitabina (10 mM), bevacizumab (1 mg /ml), sunitinib (10 M) y EMAP (10 M) causado inhibición 79, 58, 80 y 29 por ciento en la proliferación celular, respectivamente. La combinación de gemcitabina con bevacizumab, sunitinib o EMAP tenía efecto aditivo significativo y la combinación de más de un agentes antiangiogénicos a gemcitabina tenido efectos sin más aditivos (Tabla 1). Para las combinaciones de gemcitabina con diferentes agentes antiangiogénicos, el índice de interacción media fue de 1,03 (intervalo de 0,9 a la 1,34) para AsPC-1 células, 1,3 (rango 1,06 a la 2,59) para las HUVEC y 1,35 (rango 1,06-2,47) para las células WI-38. Los índices de interacción se obtuvieron a IC
25, IC
50, IC
75 e IC
90 niveles y no fueron significativamente diferentes de 1 que indica que en todas las combinaciones de fármacos los efectos combinados son aditivos.
Efectos de gemcitabina, bevacizumab, sunitinib y EMAP sobre la apoptosis proteínas relacionadas
examinado si la inhibición de la viabilidad celular por gemcitabina, bevacizumab, sunitinib y EMAP podría en parte estar correlacionada con la inducción de la apoptosis. Evaluación de la PARP-1 de escisión y la caspasa-3 escisión como marcadores de la inducción de la apoptosis reveló que en las células AsPC-1 tratamiento gemcitabina causó un aumento pequeño, bevacizumab y EMAP no causó ningún aumento, pero el tratamiento sunitinib condujo a un aumento significativo. La combinación de gemcitabina con sunitinib tenía efectos aditivos (Figura 1). En HUVECs, gemcitabina, bevacizumab y EMAP causaron un pequeño aumento y sunitinib causaron un fuerte aumento de la PARP-1 y la caspasa-3 de escisión. Las combinaciones de gemcitabina con agentes antiangiogénicos tuvieron efectos aditivos. En WI-38 células, gemcitabina y sunitinib tanto causó un aumento evidente; mientras bevacizumab y EMAP demostraron ningún efecto significativo en PARP-1 y la caspasa-3 de escisión. Las combinaciones de gemcitabina con bevacizumab, sunitinib y EMAP todos tenían efectos aditivos en PARP-1 troceados y la caspasa-3 expresión de la proteína (Figura 1).
Efectos de gemcitabina, bevacizumab, sunitinib y EMAP sobre el crecimiento tumoral local
los estudios de xenoinjertos subcutáneos PDAC murinos mostraron que la gemcitabina, bevacizumab, sunitinib y el tratamiento EMAP inhibieron el crecimiento local del tumor, con la monoterapia con sunitinib que tiene el efecto más fuerte. inhibición Net crecimiento del tumor después de un tratamiento de 2 semanas con gemcitabina, bevacizumab y sunitinib y EMAP fue 43, 38, 94 y 46 por ciento, respectivamente (Figura 2). La adición de bevacizumab en monoterapia, sunitinib y EMAP a la gemcitabina tenía efectos aditivos en la inhibición del crecimiento del tumor, como la gema + Bev, Gem + Su y Gem + EMAP dio lugar a la inhibición del crecimiento del tumor 69, 99 y 64 por ciento. Las combinaciones de más de un agente antiangiogénico con gemcitabina también fueron efectivos pero no significativamente mejor en este experimento de sunitinib solo (Figura 2, Figura S1). No se observaron signos evidentes de toxicidad relacionada con el fármaco en cualquier grupo de tratamiento en términos de habitus de los animales, los niveles de actividad y peso (Figura S2).
Efectos de gemcitabina, bevacizumab, sunitinib y EMAP en intratumoral proliferativa y apoptótica Actividad
el análisis de las células Ki67 positivas como marcador de la actividad proliferativa intratumoral reveló que la gemcitabina, bevacizumab, sunitinib y la monoterapia con EMAP causaron inhibición 34, 28, 82 y 22 por ciento en el índice de proliferación. Las combinaciones de gemcitabina con uno o más agentes antiangiogénicos eran eficaces, pero no mejoran la inhibición de la índice de proliferación intratumoral allá de los niveles alcanzados por sunitinib solo (Figura 3).
Evaluación de apoptosis intratumoral por TUNEL-tinción demostró pequeños aumentos en apoptosis por gemcitabina, bevacizumab y EMAP, y un aumento significativo de sunitinib solo. Las combinaciones de bevacizumab y sunitinib o EMAP con gemcitabina llevaron a mayores niveles de apoptosis en comparación con los agentes individuales. índices de apoptosis (TUNEL-células positivas /total de células por HPF) en los controles y en la gema, Bev, Su, EMAP, Gem + Bev, Gem + Su, grupos Gem + EMAP fueron 0,13 ± 0,03, 0,21 ± 0,06, 0,19 ± 0,03 , 0,47 ± 0,05, 0,18 ± 0,01, 0,26 ± 0,03, 0,53 ± 0,01 y 0,25 ± 0,02, respectivamente. Las combinaciones de más de un agente antiangiogénico con gemcitabina también aumentaron la apoptosis, pero no fueron significativamente más eficaz que el sunitinib solo (Figura 4).
Efectos de gemcitabina, bevacizumab, sunitinib y EMAP en intratumoral microvasos Densidad
PECAM-1 tinción de secciones de tejido tumoral para estudiar la vasculatura del tumor reveló que gemcitabina, bevacizumab, sunitinib y EMAP todo causó una reducción significativa en la densidad de microvasos en comparación con el control (Figura 5). Sunitinib solo indujo el máximo efecto en la disminución de MVD entre todos los agentes probados. Las combinaciones de gemcitabina con bevacizumab y EMAP mostraron efectos aditivos en la disminución de los recuentos de microvasos en comparación con los agentes individuales. Todas las combinaciones con sunitinib fueron muy eficaces, pero no superan los efectos solo de sunitinib. Se evaluaron todos los grupos para los recuentos de microvasos medios incluyendo, controles (25,5 ± 3,5), gemcitabina (14,2 ± 2,1), bevacizumab (11,8 ± 2,6), sunitinib (5,0 ± 2,3), EMAP (11,1 ± 2,5), Gema + Bev (7,8 ± 2), gema + Su (5.6 ± 1.1), gema + EMAP (7,9 ± 1,7), Bev + Su (2,9 ± 1), Bev + EMAP (8.2 ± 1.5), su + EMAP (5.2 ± 1.5), gema + Bev + Su (3,9 ± 1), Gem + Bev + EMAP (5,5 ± 1,5), gema + su + EMAP (3,3 ± 0,6), y Gem + Bev + su + EMAP (2,9 ± 1), respectivamente (Figura 5 ).
Efectos de gemcitabina, bevacizumab, sunitinib y EMAP en el animal de supervivencia
los estudios murinos xenoinjertos PDAC en ratones SCID-NOD dio lugar a una supervivencia media de 19 días en el grupo control. La supervivencia media (EM) aumentó ligeramente después de gemcitabina (26 días, p = 0,02), pero no hubo beneficio significativo en la supervivencia con el agente bevacizumab, sunitinib o EMAP en comparación con el control. El tratamiento de combinación de gemcitabina con un solo agente bevacizumab, sunitinib y EMAP todo mejoró significativamente la supervivencia de los animales en un grado similar, con una mediana de supervivencia en el grupo de la gema + Bev de 36 días (p = 0,003 frente a control, 0,006 vs Gem), después de la gema Su + 37 días (p = 0,003 frente a control, 0,01 frente a Gem) y después de la gema + EMAP 36 días (p = 0,002 frente a control, 0,001 frente a Gem). La combinación de gemcitabina con su + EMAP (EM = 36 días) no fue mejor que la combinación de gemcitabina con sunitinib agente único o EMAP. Combinación de gemcitabina con Bev + EMAP (ms = 43 días, p = 0,001 frente a control, 0,005 vs Gem) o con Bev + su + EMAP (46 días, p = 0,001 frente a control, frente a 0.003) demostraron la gema beneficio en la supervivencia máxima (Figura 6).
Discusión
el cáncer de páncreas tiene un mal pronóstico debido a un diagnóstico de la última etapa, la diseminación metastásica temprana y alta resistencia a la radiación y la quimioterapia. Aunque el tratamiento con gemcitabina como agente único ha producido algunos beneficios clínicos para el PDAC metastásico, el beneficio de supervivencia global sigue siendo limitado [1]. Dado que la angiogénesis es crítica para la progresión del PDAC primario y metastásico, el tratamiento antiangiogénico es una vía terapéutica sensata y todavía prometedora debido a su potencial para la interacción sinérgica con otros agentes antitumorales, baja toxicidad y efecto antitumoral mejorado [41], [42]. Varios factores de crecimiento tales como VEGF, factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), PDGF o similar a la insulina factor de crecimiento (IGF) están entre los activadores angiogénicos más importantes en la progresión del PDAC. Bevacizumab, el primer inhibidor de la angiogénesis aprobado por la FDA mostró cierta promesa en los estudios iniciales PDAC en combinación con gemcitabina, pero no pudo confirmar ningún beneficio significativo en la supervivencia en estudios posteriores [17]. Sunitinib, un inhibidor multidiana de angiogénico RTK VEGFR, PDGFR, c-KIT, FLT-3 y RET, es un agente interesante con respecto a su potencial de la terapia de combinación, en comparación con los inhibidores que han mostrado hasta ahora la actividad clínica bastante limitado-de espectro estrecho. Nuestros resultados muestran que 1 .: la combinación de agentes antiangiogénicos con gemcitabina generalmente produce mejores resultados que la monoterapia; 2 .: los efectos de sunitinib solo pueden ser bastante pronunciadas, por lo menos en los modelos probados; 3 .: múltiples combinaciones de agentes antiangiogénicos, además de gemcitabina tienden a obtener los mejores resultados; y 4 .: sunitinib y bevacizumab parece tener ninguna ventaja obvia combinación.
La progresión tumoral depende críticamente de una interacción compleja entre varios componentes que incluyen células tumorales, células inmunes, EC, matriz extracelular (ECM) y los fibroblastos del estroma. el tratamiento de tumores sólidos mediante la orientación de la CE y los compartimentos de fibroblastos dentro del microambiente del tumor ha mostrado algunos beneficios sustanciales [43], [44]. EMAP, una citoquina anti-angiogénico y antiendoteliales derivado del tumor, en nuestra experiencia mostró efectos antitumorales en varios tipos de tumores incluyendo PDAC [28], [30], [31], [34], [35], [45], [46] . El alcance del presente estudio fue evaluar la mejora de la respuesta de gemcitabina por la combinación de más de un agentes antiangiogénicos con toda una gama de diferentes mecanismos contra PDAC. Por ejemplo, hemos demostrado que la mejora EMAP gemcitabina más la combinación de bevacizumab efectos contra PDAC [34]. La adición de un agente de dirección multi-TKR como sunitinib apareció, por lo tanto sensible. Gemcitabina tenía respuesta inhibidora del crecimiento diferencial en las células PDAC in vitro. sensibilidad gemcitabina se observó en el orden de BxPC-3 & gt; MIA PaCa-2 & gt; Panc-1 & gt; como mínimo células sensibles ASPC-1, lo que indica BxPC-3 como más sensible y ASPC-1 (Figura S3). Tal vez esto es un enfoque bastante útil que permite la prueba de mecanismos adicionales para una combinación de beneficios in vivo en contraste con líneas PDAC que son gemcitabina y minúsculas. Entre los agentes antiangiogénicos, bevacizumab y EMAP solo no tuvo ningún efecto significativo en AsPC-1 proliferación, mientras que sunitinib fue muy eficaz. El efecto sunitinib era más fuerte que la gemcitabina equimolar, mientras que la adición de dos o más agentes antiangiogénicos no era más inhibidor de sunitinib solo. Como era de esperar, los tres agentes antiangiogénicos inhibieron significativamente CE y la proliferación de fibroblastos in vitro, con sunitinib solo ser de nuevo el más eficaz. En nuestros estudios, ya que sunitinib tenía máxima actividad in vitro hacia las células tumorales, ECs y fibroblastos, que apoya la hipótesis de que las actividades antitumorales in vivo de sunitinib pueden parcialmente dependerá de su impacto en las células tumorales, así como los componentes de la vasculatura del tumor y del estroma, como anteriormente informado [20],. Mendel et al. [20] mostró que el sunitinib IC
50 para VEGF y HUVECs inducidas por PGDF estaba en un intervalo nanomolar. Una actividad relativamente débil de sunitinib fue observada en el presente estudio; se supone que esto es debido a la utilización de medio de crecimiento completo para HUVECs, lo que podría hacer que las células más resistentes a la tirosina quinasa efectos inhibidores. Estos resultados apoyan la idea de que los beneficios se pueden derivar de combinaciones de agentes de metas de múltiples sobre los agentes con objetivos limitados solo, o además de ellos. Gemcitabina y sunitinib han demostrado inducir apoptosis en las células tumorales así como las células endoteliales [49], [50], [51], [52], mientras que bevacizumab y EMAP principalmente tener actividad proapoptótico hacia las células endoteliales [28], [53 ]. En el presente estudio, la evaluación de la inducción de la apoptosis por gemcitabina y agentes antiangiogénicos, solos o en combinación, se correlacionó con los resultados de proliferación de células que indican que la pérdida de la viabilidad celular por estos agentes puede ser en parte debido a la inducción de la apoptosis.
Los estudios in vivo demostraron que murinos xenoinjertos gemcitabina, bevacizumab, sunitinib y EMAP inhibió el crecimiento del tumor local como agente único. efectos antitumorales de bevacizumab y EMAP es más probable debido a su efecto sobre las CE y los fibroblastos en lugar de las células tumorales, y, en consecuencia, el impacto de estos agentes en monoterapia fue limitada.