Extracto
La terapia génica representa una estrategia atractiva para el tratamiento no invasivo de cáncer de próstata, donde las intervenciones clínicas actuales muestran una eficacia limitada. A continuación, se evalúa el uso del virus de insecto, baculovirus (BV), como un nuevo vector de terapia génica para el cáncer de próstata humano. Dado que los tumores de próstata representan un entorno heterogéneo, un enfoque terapéutico que logra la regresión a largo plazo debe ser capaz de apuntar a múltiples poblaciones de células transformadas. Además, la discriminación en la focalización de maligno en comparación con células no malignas tendría valor en la minimización de los efectos secundarios. Hemos empleado una serie de modelos de cáncer de próstata para analizar el potencial de BV para lograr estos objetivos.
In vitro
, ambas líneas celulares de próstata tradicionales, así como las células epiteliales o estromales primarios derivados de las biopsias de próstata de pacientes, en los cultivos de dos o tres dimensiones, se utilizaron. También se evaluó BV
in vivo Hoteles en modelos de xenoinjertos de cáncer de próstata murino. BV era capaz de transducir preferentemente líneas celulares de cáncer de próstata malignos invasivos en comparación con los cánceres de etapa temprana y muestras no malignas, una restricción que no era una función de importación nuclear. De mayor relevancia clínica, las células de cáncer de próstata derivados del paciente primarias también fueron transducidas eficientemente por BV, con tasas robustas observado en las células epiteliales del fenotipo basal, que expresaban transgenes codificados-BV más rápido que las células epiteliales de un fenotipo más diferenciado, luminal. se observó la capacidad máxima de la transducción en las células del estroma. BV fue capaz de penetrar a través de estructuras tridimensionales, incluyendo
in vitro
esferoides en y
in vivo
xenoinjertos ortotópico. vectores BV que contienen un transgén nitrorreductasa en un enfoque de terapia profármaco enzimáticos dirigidos a genes fueron capaces de matar eficazmente los objetivos malignas de próstata después de la administración del profármaco, CB1954. Por lo tanto, BV es capaz de transducir una gran proporción de los tipos de células de próstata dentro de un tumor de próstata 3-D heterogéneo, pueden facilitar la muerte celular usando un enfoque de profármaco, y se muestra prometedor como un vector para el tratamiento de cáncer de próstata.
Visto: Swift SL, Rivera GC, Dussupt V, RM Leadley, Hudson LC, MA de Ridder C, et al. (2013) Evaluación de baculovirus como vector para la terapia génica del cáncer de próstata humano. PLoS ONE 8 (6): e65557. doi: 10.1371 /journal.pone.0065557
Editor: Rui Medeiros, IPO, Inst Puerto Oncología, Portugal
Recibido: 1 de Febrero, 2013; Aceptado: April 26, 2013; Publicado: 6 Junio 2013
Derechos de Autor © 2013 Swift et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo se llevó a cabo en proyectos de colaboración financiados por la UE: Iniciativa de próstata para "cerdo" Terapia génica (5PM), Baculogenes (6PM) y Terapia génica: un enfoque integrado de "gigante" Neoplásicas Tratamiento (6PM), con el apoyo adicional de la investigación de cáncer de Yorkshire . Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
En el Reino Unido, más de 40.000 nuevos casos de cáncer de próstata son diagnosticados cada año y 11.000 pacientes mueren como consecuencia directa de esta enfermedad (Fuente: Oficina Nacional de Estadística). La glándula de la próstata humana es un entorno heterogéneo, compuesto principalmente de los tipos de células epiteliales y estromales. El compartimiento epitelial consiste en una bicapa de células: una capa basal continua de células no diferenciadas que están en contacto con la membrana basal, superpuesta con células luminales secretoras diferenciadas [1]. La capa epitelial basal representa el compartimento más proliferativa [2]. Aunque la mayor parte de la mayoría de los tumores de próstata comprende células de origen epitelial [3], múltiples tipos de células tienen la capacidad de contribuir a la malignidad, y deben ser erradicadas a fin de lograr un resultado clínico eficaz.
Típicamente, la etapa de de la enfermedad de la próstata y la capacidad de respuesta del tumor a los andrógenos son dos factores clave que las estrategias de tratamiento directos. Mientras que los tumores de próstata localizados pueden ser extirpados quirúrgicamente a través de la prostatectomía radical, esto a menudo se acompaña de efectos secundarios indeseables. Un enfoque alternativo, la terapia de ablación de andrógenos, elimina el suministro de andrógenos que muchos tumores de próstata dependen de para el crecimiento y la supervivencia; Sin embargo, la recurrencia de cáncer de próstata resistente a la castración más agresivo (CRPC) es un resultado común. Desde CRPC es en última instancia resistente a la radioterapia y la quimioterapia, nuevas estrategias son esenciales para proporcionar mejores resultados para los pacientes de cáncer de próstata. La terapia génica es una posible solución, y lo ideal sería ser posicionada para dirigirse tanto a los tumores de próstata primarios y secundarios tras la administración sistémica
.
Mientras que muchos vectores diferentes se han evaluado la seguridad y eficacia en los ensayos de terapia génica [4], la uso de no humanos, los virus no patógenos, tales como el baculovirus,
Autographa californica
nucleopoliedrovirus múltiple (
AC Hotel MNPV), es un área relativamente poco estudiada. BV es un virus de ADN bicatenario que infecta de forma natural anfitriones de insectos, y aunque BV puede transducir eficazmente células de mamíferos, la replicación productiva no es posible debido a la necesidad de maquinaria celular específica de insectos [5], [6]. Como vector de terapia génica, BV tiene varias ventajas inherentes. La mayor parte de la población humana no tiene ninguna exposición previa a BV y es por lo tanto inmunológicamente naive. La cápside BV es capaz de expandirse para acomodar grandes insertos transgénicos, y el tropismo natural de baculovirus se modifica fácilmente. BV es capaz de transducir tanto activamente en división y las células de mamífero quiescentes, una característica que tiene una particular relevancia en el tratamiento de cáncer de próstata, un tumor de crecimiento lento [7]. La presencia de baculovirus, incluso a una alta multiplicidad de infección (MOI), no es tóxico y no afecta el crecimiento celular y potencial de diferenciación [8], [9]. Por último, los estudios de seguridad a largo plazo extensas, llevadas a cabo en la década de 1960, cuando baculovirus surgieron como una perspectiva importante como un insecticida biológico, han demostrado baculovirus inofensivo para el hombre [10]
.
La capacidad de BV para entregar transgén funcionalmente sostenible la expresión en células de mamífero se ha demostrado por primera vez en 1995 [11]. Desde entonces,
Ac
MNPV ha demostrado ser capaz de transducir una gran variedad de tipos de células de mamíferos, incluyendo las neuronas primarios humanos [12], el hígado [11], las células madre mesenquimales [13] y las células madre embrionarias [9] . Mientras que los primeros intentos de lograr la transferencia de genes mediada por BV
in vivo
falló debido a la inactivación vector por los componentes del suero, tales como complemento [14], eficiente transducción de baculovirus se puede lograr en la presencia de a los productos químicos o en proteínas inhibidores del complemento en base, ya sea como co-inóculos [15], [16], [17] o incorporaciones a la proteína de la envoltura BV [17], [18], [19]. BV ha sido utilizado con éxito como un vector de terapia génica preclínica
in vivo
[12], [20], [21], [22], gástrico murino [23], y en el contexto del cáncer se ha tratado con éxito xenoinjertos [24].
Aquí, evaluamos BV como un vector de terapia génica para el tratamiento de cáncer de próstata humano. Se describe el uso de BV para transducir preferentemente y entregar ambos genes indicadores y células letales a las muestras malignas de próstata de la línea celular y el origen del paciente, además de cultivos tridimensionales y
tumores murinos in vivo
, con alta eficiencia.
Materiales y Métodos
células de insecto Línea Mantenimiento
Sf21 y Sf9 (Invitrogen) líneas celulares (aislados del tejido ovárico del gusano ejército caída,
Spodoptera frugiperda
) se mantuvieron en matraces spinner colgando barra de agitación a 27 ° C en medio de Grace suplementado con 10% de suero de ternero fetal (PAA Laboratories) y 0,1% (v /v) Pluronic® F-68 (Invitrogen). Los cultivos monocapa se mantuvieron en ausencia de Pluronic.
próstata humana línea celular mantenimiento
LNCaP (células de cáncer de próstata, bien diferenciados sensibles a los andrógenos derivados de una metástasis de ganglios linfáticos) y PC-3 (las células independientes de andrógenos, diferenciados pobremente cáncer de próstata derivadas de una metástasis ósea) fueron adquiridos de la American Type Culture Collection (ATCC, EE.UU.). Se establecieron (células sensibles a los andrógenos, bien diferenciados de cáncer de próstata derivadas de un tumor de próstata primario) PC346C en el Centro Médico Erasmus, Países Bajos [25]. P4E6 (células epiteliales derivadas de un tumor de próstata primario bien diferenciado inmortalizada por transfección con HPV E6), se establecieron (células de la próstata no maligno de diferentes pacientes, respectivamente, inmortalizadas por transfección con SV40) PNT1A y PNT2C2 en nuestro laboratorio [26] , [27]. Todas las células se manejan bajo condiciones de buenas prácticas de laboratorio en las ventanas de paso definido, fueron certificados mensual libre de micoplasma y se genotipo (usando el sistema Powerplex 1.2 aprobada por la ATCC, Promega) para asegurar la autenticidad. Las células se pasaron rutinariamente en las condiciones descritas anteriormente [28].
cultivo de células primarias
tejido de la próstata del paciente fue tomada con conocimiento y el consentimiento y la aprobación por escrito del Comité de Ética de Investigación York a partir de pacientes sometidos a resección transuretral de la próstata, la cistectomía radical o prostatectomía. Se aislaron las células epiteliales como se describe anteriormente [29] y seleccionados para α
2β
1
hi expresión usando la adherencia rápida para escribir placas recubiertas con colágeno I (BD Biosciences). Las células se co-cultivaron en colágeno I plasticware con células alimentadoras STO murinas irradiado hasta que el crecimiento estaba bien establecida, en KSFM suplementado con 5 ng /ml de EGF, 50 mg /ml de extracto de pituitaria bovina y 2 mM L-glutamina (KSFMsup). Para inducir la diferenciación, las células se cultivaron en una mezcla 50:50 (v /v) de DMEM y F12 de Ham, suplementado con 10% de FCS, 10 nM DHT y 2 mM L-glutamina (DH10) durante 4-6 días. Las células estromales aisladas se propagaron en matraces T25 en medio RPMI suplementado con 10% de FCS y 2 mM L-glutamina.
Baculovirus Preparación
vectores de baculovirus recombinantes se construyeron utilizando el kit BacVector 1000 (Novagen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante, con el pBAC64 la medida: CMV-EGFPCAT, pBAC64: CMV-EGFP o pBAC64: plásmidos de transferencia de CMV-NTR-EGFP. Estos plásmidos tienen la columna vertebral de pBAC4X-1 (Novagen) con inserciones de la
polh
promotor y
gp64
secuencias de codificación de pBACsurf-1 (Novagen) gen y el promotor de citomegalovirus (CMV) temprano inmediato promotor de la transcripción de EGFP, una proteína de fusión EGFPCAT (BD Biosciences Clontech) o mNitroreductase (NTR) de conducción -IRES-EGFP casetes de expresión. Los virus recombinantes se sometieron a tres rondas de purificación en placa y las existencias de alto título se cultivaron mediante la infección de células de insecto Sf21 a MOI = 0,1 unidades formadoras de placas (UFP) por célula y el virus de la cosecha sobrenadante después de 5 días. sobrenadante de células que contienen el virus se concentró por ultracentrifugación a 24.000 rpm durante 90 minutos a 4 ° C usando un rotor Beckman SW28 y se purificó adicionalmente por ultracentrifugación a través de un gradiente de sacarosa a 24.000 RPM en un rotor Beckman SW41. Las partículas de virus se lavaron y se resuspendieron en PBS (aproximadamente 1/500 del volumen de partida) y se titularon mediante ensayo de placas en células Sf9. La partícula: relación de PFU era generalmente dentro del intervalo de 100 a 300 [30], [31], [32]. Para la transducción de las células de la próstata, el virus se diluyó en medio libre de suero apropiado para cada tipo celular, a menos que se indique lo contrario.
confocal Microscopía Análisis de monocapas y bicapas
En ambos monocapa y bicapa experimentos de confocal , se sembraron células en portaobjetos de cámara de 8 pocillos con una base de cubreobjetos (Lab-Tek) a una densidad inicial de 2 a 5 × 10
4 células por pocillo (pre-recubiertas con 0,1 mg /ml de poli-L-lisina para las células LNCaP). Para generar una bicapa, el medio se cambió cada 2 días hasta que se consiguió una capa dual de crecimiento epitelial. Se añadieron BV [CMV-EGFPCAT] o [BV CMV-EGFP] partículas en 500 UFP /célula durante un período de tiempo especificado después de lo cual se lavaron las células para eliminar el virus no unido y se fijaron inmediatamente en paraformaldehído al 4% (w /v) . Las células se permeabilizaron en 0,5% (v /v) de Triton-X 100 (Sigma) o 70% de EtOH, y luego bloqueadas en 10% de suero. La proteína de la cápside BV, VP39, se detectó utilizando un anticuerpo primario monoclonal (P10C6), cortesía del Dr. L. E. Volkman, Universidad de California, Berkeley, EE.UU. [33] y una cabra anti-ratón de Alexa Fluor 568 anticuerpo secundario (Invitrogen). En experimentos de doble capa, las diluciones de anticuerpos se preparan en 0,1% (w /v) de BSA Fracción V (Sigma) para ayudar a la penetración en las capas basales, mientras que en los experimentos de monocapa, las diluciones de anticuerpos se prepararon en PBS. Para el análisis de la diferenciación celular primaria, se añadió anticuerpo HMWCK (Dako) con la aplicación posterior de un Alexa 568 anticuerpo secundario de cabra anti-ratón (Invitrogen). A continuación, se aplicó un segundo anticuerpo primario (CK18-FITC (Sigma)). Vectashield que contiene DAPI (Vector Lab) se añadió antes de visualizar las células bajo fluorescencia utilizando un microscopio confocal Zeiss LSM 510 meta.
Citometría de Flujo
Las células se sembraron a una densidad de 0,2-1 x 10
5 por pocillo de una placa de 48 pocillos y se incubaron a 37 ° C durante la noche. Las células se lavaron una vez en PBS antes de la adición del virus diluido en medio libre de suero apropiado para cada tipo de célula. Después de que el período de tiempo deseado, virus se aspiró, las células se lavaron una vez en medio libre de suero y sobrepuesto en medio de crecimiento que contenía suero. Las células se separaron usando tripsina:. EDTA y se resuspendieron en 0,02% (w /v) EDTA, con un mínimo de 10.000 eventos singlete contadas usando un ADP cian ™ citómetro de flujo
PC346C esferoide Transducción
esferoides espontáneamente formados se recogieron de la superficie de un matraz T25 que contiene células PC346C y se incubaron durante 10 minutos a 37 ° C en medio de cultivo completo que contiene SV- [CMV-EGFP] a una concentración de 8,6 × 10
9 PFU /ml . Se diluyeron las esferoides en 2,5 ml de medio y se re-sembraron en un matraz T12.5. Fluorescente imágenes fueron capturados utilizando un microscopio Nikon Eclipse TE300 a los tres días después de la infección.
ortotópico xenoinjertos
Los tumores fueron establecidos por la inyección de 1 x 10
6 células PC346C ortotópica en el dorsolateral de próstata de los ratones desnudos atímicos (NMRI nu /nu, Taconic M & amp; BA /S, Ry, Dinamarca) como se ha descrito anteriormente [34], de conformidad con los procedimientos éticos y bajo la aprobación del comité de ética Erasmus Experimental Animal Center. El crecimiento del tumor se monitorizó mediante ultrasonografía transrectal usando un sistema de ultrasonidos intravascular adaptado [35]. En tamaños de los tumores entre 80 y 120 mg, dos dosis (3 × 10
7 o 1 × 10
8 pfu) de BV [CMV-EGFP] se administraron intratumoral bajo anestesia. Los animales se sacrificaron 3 días más tarde, se recogieron los tumores, se fijaron durante 2 h en 2% de paraformaldehído en PBS, en rodajas en un Vibratome (Campden Instruments, Loughborough, Reino Unido) en 70 micras de grosor y (v /w) montado en portaobjetos de vidrio en Vectashield (Vector Lab). expresión de EGFP fue visualizada por microscopía confocal (Carl Zeiss, Benelux).
Evaluación de la viabilidad celular en un ensayo MTS
Las células se sembraron a una densidad de 1 × 10
4 células por pocillo en una placa de 96 pocillos y se dejó que se unieran durante la noche. SV- [CMV-NTR-EGFP] se añadió a pocillos por triplicado a una MOI = 500 durante 4 horas, se lavaron y se incubaron durante 20 horas antes de la adición de CB1954 (20 mM para todas las muestras primarias y líneas celulares excepto para PC-3, para los que se utilizaron 40 mM). Después de otras 48 h de líneas celulares o 30 h para células primarias, la viabilidad celular se midió utilizando el CellTiter 96® Aqueous reactivo de ensayo (Promega) según las instrucciones y las placas del fabricante leen utilizando un lector de placas BMG Labtech polarstar OPTIMA. La proporción de células muertas se calculó comparando a las células viables en un pozo transducido. Un duplicado de los pozos se utilizaron para citometría de flujo como se ha descrito anteriormente para determinar la frecuencia de células transducidas positivamente.
Resultados
BV transducción es más eficiente en líneas celulares malignas de próstata en comparación con no maligno controles
con el fin de determinar la capacidad de BV para la transducción de forma diferencial objetivos malignos de próstata en comparación con no malignas, se evaluó la susceptibilidad de un panel de líneas celulares de próstata humanos establecidos a BV transducción. Se incubaron las células con un vector de BV recombinante modificado para llevar un transgén EGFPCAT (SV- [CMV-EGFPCAT]) utilizando una MOI fija de 500 y un tiempo de incubación de 48 h. líneas de células malignas con alto potencial metastásico, incluyendo LNCaP, PC3 y PC346C, fueron altamente transducidas (~ 80% de células EGFP-positiva), mientras que las líneas de células no malignas PNT1A y PNT2C2 fueron menos transducidas (hasta 10% de células EGFP-positivo) (Figura 1A). P4E6, una línea celular derivada de un tumor en estadio temprano iniciado pero, estaba en el rango intermedio, con aproximadamente 20% de células EGFP positivas (Figura 1A). Por lo tanto, la frecuencia de células transducidas positivamente por BV correlacionado con la malignidad y el potencial metastásico.
(A) Porcentaje de células EGFP-positivas después de la transducción de un panel de alto grado de malignidad (rojo), de bajo grado de malignidad (negro ) o líneas celulares (azul) de la próstata no malignos con BV [CMV-EGFPCAT] a MOI = 500 durante 48 h. Las barras de error representan - /+ una desviación estándar. (B) los niveles de expresión de EGFP siguientes transducción con BV [CMV-EGFPCAT] a una MOI de saturación (500 para LNCaP, PC3 y PNT1A, 1000 para PNT2C2). El porcentaje de células EGFP-positivas se normalizó a las obtenidas después de 48 h de incubación en presencia de virus para cada tipo de célula (puesto a 1). líneas de células malignas: PC3 (▴), LNCaP (▪); Líneas de células no malignas: PNT2C2 (♦), PNT1A (▾). Las barras de error representan - /+ una desviación estándar. (C) Confocal imágenes de microscopía (porción individual o Z-stack) de las células LNCaP, PC3 o PNT1A transducidas-BV a las 8 horas después de la transducción (MOI = 500). fluorescencia roja indica la cápside BV (anti-VP39), la tinción nuclear en azul (DAPI) y la expresión de EGFP impulsada por BV en verde.
Para investigar las condiciones óptimas para la transducción altamente susceptibles (LNCaP, PC- 3) frente a líneas celulares de próstata) PNT2C2 menos susceptibles (PNT1A y, analizamos tanto el MOI requerida para alcanzar la saturación de transducción y la cinética de la transducción en este MOI. Las células se incubaron durante 1 h en presencia de dosis crecientes de SV- [CMV-EGFPCAT], y se analizó la proporción de células EGFP-positivas después de 24 h. El MOI necesario para lograr la frecuencia máxima de las células transducidas era 500 PFU por célula para LNCaP, PC3 y PNT1A, y 1000 PFU por célula para PNT2C2 (datos no mostrados). El uso de estos MOIs saturar, la cinética de la transducción se investigaron con el tiempo. líneas de células malignas de próstata (LNCaP y PC-3) demostraron la absorción rápida y eficaz de SV- [CMV-EGFPCAT], que requieren tiempos de incubación solamente cortos (~ 45 o ~ 90 min, respectivamente) para alcanzar 50% de los niveles registrados a 48 h (Figura 1B). líneas celulares de próstata Por el contrario, no malignas (PNT1A y PNT2C2) requieren tiempos de incubación prolongados (~ 10 h o ~ 8 h, respectivamente) para lograr 50% de los niveles a las 48 h (Figura 1B) guía.
Uno interpretación de estas diferencias en la transducción es que la importación nuclear de la cápside BV es defectuoso en algunos tipos de células (por [36]). Para evaluar esta hipótesis en nuestros modelos de línea celular de próstata, la localización subcelular de BV cápsides se investigó mediante microscopía confocal a las 8 h después de la transducción en las líneas celulares LNCaP maligno y PC-3 altamente susceptibles y la línea celular de PNT1A no maligno menos susceptibles . Se observaron cápsides BV en el núcleo de los tres tipos de células (Figura 1C), y el análisis visual de múltiples campos de visión no revelaron diferencias en los niveles de la localización de la cápsida nuclear. Sin embargo, las células PC-3 tenían un mayor nivel de la superficie determinada BV, mientras que las células PNT1A tenían un mayor nivel de BV en el citoplasma (Figura 1C).
Las células de Basal (indiferenciado) Fenotipo son transducidas con mayor facilidad que luminal (diferenciado) Las células de la próstata epitelial primaria culturas
con el fin de ampliar nuestra evaluación de la VB en una situación más biológicamente relevante, se emplearon cultivos de células epiteliales primarias de pacientes biopsia derivados de la próstata. Dado que la mayor parte de los tumores de próstata humanos comprende células de origen epitelial, con ambos indiferenciada (basal) y fenotipos bien diferenciados (luminales) presente, determinamos si BV era capaz de dirigirse ambas poblaciones de células epiteliales en diferentes etapas de la diferenciación. células epiteliales de la próstata primarios derivados de tres biopsias de tumores de pacientes (puntuaciones de Gleason 6, 7 y 8/9) se cultivaron bajo dos condiciones diferentes: en medio KSFMsup para mantener las células en un estado basal, o en medio DH10 para inducir la diferenciación, basado en el trabajo por [37]. Los cambios en el estado de diferenciación bajo estas condiciones de cultivo diferentes fueron confirmados por análisis de inmunofluorescencia de marcadores de diferenciación clásica (basal marcadores: citoqueratinas (CK) 1, 5, 10 y 14; marcador de luminal: CK18), basado en el trabajo de [38] (Figura 1). Sobre una base por paciente, las células cultivadas en KSFMsup o DH10 se incubaron con SV- [CMV-EGFPCAT] para aumentar la longitud de tiempo y se analizaron por citometría de flujo a las 48 h. diferenciación epitelial reduce las frecuencias de transducción en general cuando las células se incubaron con virus durante menos de 10 h: por ejemplo, en células derivadas de un tumor de Gleason 6, las células el máximo nivel de infección logrado en basal (KSFMsup) a 4 h (45,33 ± 3,55 %) fue considerablemente mayor que el pico de la infección en luminal (DH10) células (21,69 ± 1,78%) a las 8 h (Figura 2A). Durante los períodos de incubación BV, la diferencia en los niveles de transducción entre KSFMsup- y más largos DH10-cultivadas células se volvieron menos pronunciada, pero seguían siendo inferiores en (DH10) poblaciones de células diferenciadas (Figura 2A).
(A) Porcentaje de células EGFP-positivas a las 48 horas después de la transducción con BV [CMV-EGFPCAT] a MOI = 500 para aumentar la longitud de vez en tres muestras epiteliales de próstata malignos primarios (Gleason 6, 7 ó 8/9), mantenido en un estado basal por cultivo in KSFMsup (▪), o cultivados en la diferenciación de las condiciones en DH10 (▴). Las barras de error representan - /+ una desviación estándar. (B) La localización de BV cápsides en las células epiteliales primarias de un tumor de Gleason 8/9 crecido en una bicapa, ya sea 1 hora o 16 horas después de la incubación con BV [CMV-EGFPCAT] a MOI = 250. fluorescencia roja indica cápsides BV detectado con anti-VP39, DAPI nuclear se muestra en la expresión de EGFP azul y conducido-BV en verde. Las imágenes confocales de la capa superior de células (luminal-similares; en una z-distancia media de 14,58 m de la posición ventral) y la capa inferior (basal-similares; en una z-distancia media de 6,47 micras desde la posición ventral) son mostrado. (C) Frecuencia (normalizado para burlarse = 1%) o intensidad de fluorescencia de las células del estroma primario EGFP-positivas derivadas de biopsias malignos o benignos 24 h después de la transducción con SV- [CMV-EGFPCAT] a MOI = 500.
con el fin de investigar más a fondo la rápida transducción de las células epiteliales basales con BV, hemos empleado un
in vitro de células
modelo de bicapa, que imita la estructura celular de la glándula prostática. La bicapa compuesta de una capa confluente de células epiteliales basales (CK1 /5/10/14 +) recubrió con una capa superior imperfecta de células con un más diferenciado, fenotipo luminal (CK18 +) [28], [38]. Se dejó que las células epiteliales de próstata malignos primarios derivados de una puntuación de Gleason 7 tumor para formar una bicapa, después se incubaron con SV- [CMV-EGFPCAT] durante 1 h o 16 h y se visualizaron mediante microscopía confocal. Después de la incubación con BV durante 1 h, cápsidas de virus se visualizaron en la capa basal en un patrón de tinción punteada, pero no se observaron en la capa luminal (Figura 2B). Tras un período de incubación (16 h) más largo, se detectaron cápsides de virus en ambas capas basales y luminales:. Sin embargo, las áreas notables en la capa luminal sigue carente de cápsidas de virus (Figura 2B)
BV puede rápidamente y eficazmente las células estromales de próstata transducir primaria
epiteliales y del estroma poblaciones representan los dos principales componentes celulares de tumores de próstata. Mientras que las células epiteliales típicamente comprenden la mayor parte de la población de células malignas, células del estroma se han implicado en un bucle de retroalimentación recíproca que soporta el crecimiento y mantenimiento de las células tumorales [39], [40]. Esto sugiere que el éxito de la terapia del cáncer de próstata debería incluir la erradicación del compartimiento del estroma malignidad asociada objetivo. Por ello, investigó la capacidad de BV para transducir células de origen estromal. Las células estromales derivadas de biopsias de próstata primario malignas o no malignas se incubaron con SV- [CMV-EGFPCAT] para 1, 16 o 24 horas y se analizaron por citometría de flujo. Después de 1 h, aproximadamente el 30% de las células fueron transducidas por BV, mientras que después de 16 h de incubación, todas las células del estroma se transdujo positivamente por BV (Figura 2C). No se observó ninguna diferencia en la frecuencia de células del estroma transducidas positivamente sobre la base de malignidad; sin embargo, en una base por célula, las células estromales derivadas de muestras de biopsia de próstata malignos mostraron una mayor intensidad de fluorescencia media de las derivadas de las muestras de biopsia benignos en puntos de tiempo tempranos (Figura 2C). Las células estromales fueron por lo tanto muy susceptibles a la BV transducción.
BV con éxito puede transducir 3-D de la próstata esferoides y ortotópico xenoinjertos
Se ha sugerido que un gen de la terapia de vector eficaz debe ser capaz de penetrar a través de varias capas de células con el fin de lograr una respuesta clínicamente relevante en el tratamiento de tumores sólidos. Para caracterizar la capacidad de la VB a migrar a través de las capas de células, se emplearon tanto
in vitro
y
in vivo
cultivos tridimensionales. Para
in vitro de modelado
, esferoides huecos de las células malignas de próstata PC346C, que comprendía una 'concha' de 2-3 capas de células y se separa espontáneamente de monocapas en cultivo de rutina, se incubaron con BV [CMV-EGFP] . En 72 h post-incubación, se observó un patrón altamente eficiente de la transducción de células, con una penetración de BV a través de todas las capas de células (Figura 3A).
(A) esferoides PC346C transducidas con SV- [CMV-EGFP] (o modelo de transduced) a los 3 días después de la infección. tumores (B) PC346C recogidas de ratones xenoinjertados a los 3 días después de la infección con BV en 3 × 10
7 (una imagen representativa se muestra) o 1 × 10
8 (dos imágenes representativas mostrados) PFU por inoculación. fluorescencia roja muestra los núcleos celulares (Hoechst), mientras que la expresión de EGFP impulsada por el BV se muestra en verde. Las flechas indican el sitio de la inyección intratumoral BV.
Para i
n de modelado vivo
, modelos de xenoinjertos de cáncer de próstata murino, generados a través de la inyección ortotópico de la línea celular PC346C en la próstata dorsolateral atímicos ratones desnudos, se inyectaron intratumoralmente con SV- [CMV-EGFP] a dos concentraciones diferentes (3 × 10
7 o 1 x 10
8 pfu). A las 72 h, los tumores se resecaron y se analizaron por microscopía de fluorescencia. BV se observó para penetrar con éxito en el tumor, y migrar fuera del lugar inicial de la inyección. Esto fue particularmente evidente tras la administración de la dosis más alta de virus (Figura 3B). Por lo tanto, incluso en cultivos tridimensionales, BV fue capaz de lograr un alto nivel de transducción celular.
Las células malignas de próstata se pueden matar eficientemente usando BV vectores en un enfoque basado en la nitrorreductasa GDEPT
con el fin de probar la capacidad de BV para lograr un resultado letal de células, se empleó una terapia enzima profármaco dirigida de genes (GDEPT) enfoque centrado en bacteriana
nitrorreductasa
(NTR), que convierte la pro- drogas CB1954 (5- (aziridin-1-il) -2,4-dinitrobenzamida) en un agente de reticulación potente DNA [41]. Por lo tanto, hemos construido un BV teniendo un casete de expresión donde el fuerte promotor de CMV mamíferos condujo expresión de MNTR-IRES-EGFP (BV [CMV-EGFP-NTR]). Un panel de líneas celulares de próstata malignos y no malignos se transdujeron con BV [CMV-EGFP-NTR], y se evaluó la viabilidad celular después de la administración del profármaco, CB1954. La proporción de células no viables, tal como se mide por el ensayo de MTS después de 48 h, fue significativamente mayor en las muestras malignas con alto potencial metastásico (PC346C, PC3 y LNCaP) en comparación con muestras no malignas (PNT1A y PNT2C2) (P & lt; 0,001) (Figura 4A). muestras malignas en etapa temprana (P4E6) cayeron en el rango intermedio de viabilidad. Además, la viabilidad celular después de la administración pro-fármaco se relaciona directamente con la tasa de BV de transducción (Figura 4A). Este análisis se extendió en cultivos de células epiteliales derivadas del paciente primarias. Tres muestras malignas y no malignas dos fueron transducidas con SV- [CMV-NTR-EGFP] y se trataron con CB1954. A 30 h de la administración-pro-fármaco, la muerte celular en estos cultivos varió de 10% a 50%, independientemente del estado de la enfermedad (Figura 4B).
(A) Porcentaje de células no viables a las 48 h después de la transducción con SV- [CMV-NTR-EGFP] (MOI = 500) y el tratamiento con CB 1954 en un panel de líneas celulares de próstata, que se muestra en relación con la frecuencia de células transducidas y ajustado por los controles no tratados. líneas de células malignas: PC346C (♦), PC3 (▴), LNCaP (▪), P4E6 (x); líneas de células no malignas: PNT1A (+), PNT2C2 (•). Estadísticas representan la prueba t entre PC346C /PC-3 /LNCaP vs. PNT1A /PNT2C2. (B) Porcentaje de células no viables en 30 h después de la transducción con SV- [CMV-NTR-EGFP] y el tratamiento con CB 1954 en muestras de células epiteliales de la próstata primarios individuales (n = 3 maligno y n = 2 no maligno), ajustadas para los controles no tratados.
Discusión
múltiples modelos de la enfermedad han demostrado que tiene un gran potencial de baculovirus como un nuevo vector para la terapia génica. Aquí, hemos explorado su utilidad para el tratamiento de cáncer de próstata humano. BV era capaz de transducir eficientemente una gama de células de la próstata derivados de múltiples fuentes, incluyendo
in vitro
y
in vivo y modelos. BV demostró transducción de diferencial de maligno en comparación con células de la próstata no malignos, una observación que apareció independiente de la tasa de crecimiento, ya que las líneas de células en cuestión exhiben capacidades proliferativas similares (tiempos de duplicación: PNT2C2 (39 h), LNCaP (34 h) PC- 3 (30-34 h) y PNT1a (30 h) [26], [42], [43]). Aunque un receptor celular de mamífero principal de BV de fijación permanece sin identificar, que especular que upregulation malignidad asociada de proteoglicanos de sulfato modificado de heparán (HSPGs) en la superficie de células tumorales [44], [45], que se sabe que están implicados en la unión BV [16], [46], desempeña un papel importante en este resultado.