Extracto

Antecedentes

En la actualidad la quimioterapia se limita sobre todo a las drogas genotóxicas están asociados con efectos secundarios graves debido a la orientación no selectivo de tejido normal. Los productos naturales desempeñan un papel importante en el desarrollo de la mayoría de los agentes quimioterapéuticos, con el 74,8% de todas las quimioterapias disponibles se deriva de productos naturales.

Objetivo

Para evaluar científicamente y validar el potencial anticáncer de una extracto etanólico del fruto de la pimienta larga (PLX), una planta de la
Piperaceae
familia que se ha utilizado en la medicina tradicional, especialmente Ayurveda e investigar el mecanismo de acción contra el cáncer de PLX contra las células cancerosas.

Materiales & amp; Métodos

Tras el tratamiento con extracto de pimienta larga etanólico, la viabilidad celular se evaluó mediante una sal de tetrazolio soluble en agua; Se observó la inducción de apoptosis después de la tinción nuclear por Hoechst, la unión de anexina V a la fosfatidilserina y la microscopía de contraste de fase exteriorizado. citometría basada en imágenes se utilizó para detectar el efecto de extracto de pimienta larga en la producción de especies reactivas de oxígeno y la disipación del potencial de membrana mitocondrial después de tetrametilrodamina o 5,5,6,6'-tetracloro-1,1 ', 3, tinción de cloruro de 3'-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine (JC-1). Evaluación de PLX
in vivo
se llevó a cabo usando ratones Balb /C (toxicidad) y ratones inmunocomprometidos CD-1 nu /nu (eficacia). El análisis por HPLC permitió la detección de algunos compuestos primarios presentes dentro de nuestro largo extracto de pimienta.

Resultados

Nuestros resultados indican que un extracto de pimienta larga etanol induce selectivamente la apoptosis independiente de caspasas en las células cancerosas, sin afectar no células cancerosa, por la orientación de las mitocondrias, que conduce a la disipación del potencial de membrana mitocondrial y el aumento de la producción de ROS. La liberación de la FIA y la endonucleasa G de las mitocondrias aisladas confirma la mitocondria como un objetivo potencial de pimienta larga. La eficacia de PLX en
in vivo estudios
indica que la administración oral es capaz de detener el crecimiento de tumores de cáncer de colon en ratones inmunocomprometidos, sin toxicidad asociada. Estos resultados demuestran la alternativa potencialmente seguro y no tóxico que es extracto de pimienta larga para la terapia del cáncer

Visto:. Ovadje P, Ma D, P Tremblay, Roma A, Steckle M, Guerrero J-A, et al. (2014) Evaluación de la eficacia & amp; Mecanismo bioquímico de inducción de muerte celular por
Piper longum
extraer selectivamente en
In-Vitro
y
in vivo
Modelos de células de cáncer humano. PLoS ONE 9 (11): e113250. doi: 10.1371 /journal.pone.0113250

Editor: Stephanie Filleur, Universidad Tecnológica de Texas Health Sciences Center, Estados Unidos de América

Recibido: 29 de mayo de 2014; Aceptado: 21 Octubre 2014; Publicado: 17 Noviembre 2014

Derechos de Autor © 2014 Ovadje et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos se presentan en forma de tablas y figuras, que se puede encontrar en el manuscrito

Financiación:. Este estudio fue financiado por Windsor & amp; Fundación del Condado de Essex cáncer Centro de Seeds4Hope Grant (URL: http://windsorcancerfoundation.org/). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:. El co-autor Siyaram Pandey es un miembro del Consejo Editorial PLOS. Sin embargo, esto no altera la adhesión de los autores a PLoS ONE políticas y criterios editoriales.

Introducción

El continuo aumento de la incidencia de cáncer significa una necesidad de seguir investigando en más eficaz y menos alternativas tóxicas a los tratamientos actuales. Sólo en Canadá, se estimó que surgirán 267,700 nuevos casos de cáncer, con 76,020 muertes ocurridas en 2012 solo. Las estadísticas globales son aún más grave, con 12,7 millones de casos de cáncer y 7,6 millones de muertes por cáncer que surgen en el año 2008 [1], [2]. Las características de las células cancerosas descubren la dificultad de atacar a las células cancerosas de manera selectiva. Las células cancerosas son notorios para el mantenimiento de la señalización proliferativa, evadiendo la supresión del crecimiento, la activación de la invasión y la metástasis y la resistencia a la muerte celular entre otras características [3]. Estas características plantean varios retos en el desarrollo de terapias contra el cáncer con éxito. La capacidad de las células cancerosas para evadir eventos de muerte celular ha sido el centro de atención de muchas investigaciones, con el foco centrado en la orientación de los diversos aspectos vulnerables de las células de cáncer para inducir las diferentes formas de la célula muerte programada (PCD) en las células cancerosas, sin asociada toxicidades a células no cancerosas.

la apoptosis (PCD tipo I) se ha estudiado durante décadas, la comprensión de lo que mejorará el posible desarrollo de terapias contra el cáncer más eficaces. Esta es una forma de muerte celular que se requiere para el desarrollo normal y la homeostasis celular, así como un mecanismo de defensa para deshacerse de las células dañadas; las células sometidas a la apoptosis invertir energía en su propia muerte, para no convertirse en una molestia [2]. Las células cancerosas evaden la apoptosis con el fin de conferir crecimiento ventaja añadida y sustento, por lo tanto, las terapias contra el cáncer actuales posible para aprovechar las diversas vulnerabilidades de las células cancerosas con el fin de desencadenar la activación de la apoptosis a través de ya sea la extrínseca o vías intrínseca [4], [5]. Los retos de algunas de las terapias de cáncer disponibles son sus capacidades para inducir la apoptosis en las células cancerosas mediante la inducción de daño en el ADN genómico. Aunque se trata de un principio eficaz, ya que se dirigen a células de división rápida [6], que suelen ir acompañados de efectos secundarios graves causados ​​por la focalización no selectiva de las células no cancerosas normales, lo que sugiere una necesidad de otros objetivos que no son comunes para la inducción de la apoptosis sin las toxicidades asociadas.

productos naturales de la salud (NHP) han demostrado una gran promesa en el campo de la investigación del cáncer. Los últimos 70 años han introducido varios productos naturales como la fuente de muchos fármacos en la terapia del cáncer. Aproximadamente el 75% de las terapias contra el cáncer aprobados se han derivado de productos naturales, una estadística de esperar teniendo en cuenta que más del 80% de la población del mundo en desarrollo depende de los productos naturales para la terapia [7]. productos vegetales contienen muchos productos químicos especialmente bioactivos que son capaces de desempeñar papeles específicos en el tratamiento de diversas enfermedades. Teniendo en cuenta las mezclas complejas y las propiedades farmacológicas de muchos productos naturales, se hace difícil establecer un objetivo y mecanismo de acción de muchos NHPs específico. Con PNS ganando impulso, especialmente en el campo de la investigación sobre el cáncer, hay una gran cantidad de nuevos estudios sobre la eficacia mecánica y la seguridad de primates no humanos como agentes potenciales contra el cáncer [8].

pimienta larga, de la familia Piperaceae, se ha utilizado durante siglos para el tratamiento de diversas enfermedades. Se han identificado varias especies de pimienta larga, incluyendo
Piper longum gratis (cuyo extracto se utiliza en este estudio),
Piper betel
,
Piper retrofactum
, extractos de los cuales se han utilizado durante años en el tratamiento de diversas enfermedades. Una larga lista de usos y beneficios están asociados con extractos de diferentes
Piper spp
, con informes que indican su eficacia como buenos agentes digestivos y dolor y supresores inflamatorias [9]. Sin embargo, hay poca o ninguna validación científica, única evidencia anecdótica, por los beneficios asociados con el uso de extractos de pimienta larga. Hay estudios científicos que se han llevado a cabo en varios compuestos presentes en los extractos de pimienta larga, incluyendo piperines, que se ha demostrado que inhibe muchas reacciones bio-transformación de la droga enzimática y desempeña papeles específicos en la activación metabólica de los carcinógenos y la producción de energía mitocondrial [10] - [13], y varios alcaloides de piperidina, con actividad fungicida [9], [14]. Algunos de estos compuestos han mostrado una potente actividad contra el cáncer [15], lo que sugiere que los extractos de pimienta largas podrían representar un nuevo PHN, con mejor eficacia selectiva contra las células cancerosas.

En este estudio, se analiza la eficacia de un extracto etanólico de pimienta fruta larga (PLX) contra varias células cancerosas, así como el intento de dilucidar el mecanismo de acción, después del tratamiento. Los resultados de este estudio demuestran que PLX redujo la viabilidad de varios tipos de células de cáncer en una dosis y manera dependiente del tiempo, donde se observó la inducción de la apoptosis, siguiendo la orientación mitocondrial y la liberación de factores pro-apoptóticos. Debido a las bajas dosis de PLX necesarios para inducir la apoptosis en células de cáncer, fue fácil de encontrar la ventana terapéutica de este extracto. Se encontró que la inducción de la apoptosis de ser independiente de caspasas, aunque no hubo activación tanto de la vías extrínseca e intrínseca y la producción de ROS no era esencial para el mecanismo de la inducción de muerte celular por PLX. El extracto polychemical complejo de la fruta de la planta de la pimienta larga, como un producto de salud natural con actividad contra el cáncer sin precedentes, proporciona una manera de dirigirse a múltiples vulnerabilidades de las células cancerosas. Incluso en presencia de ciertos inhibidores, PLX fue eficaz en la inducción de la apoptosis sugiere la aplicación potencial de desarrollar PLX como una terapia de cáncer seguro y eficaz.

Materiales y Métodos

Los estudios en animales se realizaron de acuerdo con el protocolo de cuidado de animales aprobado por la Universidad de cuidado de animales de Windsor; Este protocolo y el proyecto fue aprobado por el comité de cuidado de los animales - Número de protocolo:. AUPP 10-17), de acuerdo con el Consejo Canadiense de Cuidado de Animales (CCAC) directrices

Cell Cultura y
La línea celular de melanoma maligno G-361, las líneas celulares de cáncer colorrectal humano HT-29 y HCT116 (American Type Culture Collection, Manassas, VA, EE.UU. Cat No. CRL-1687, CCL-218 & amp;. CCL-247, respectivamente) se cultivaron con 5a medio de McCoy (Gibco BRL, VWR, Mississauga, ON, Canadá) suplementado con 10% (v /v) de FBS (Thermo Scientific, Waltham, MA, EE.UU.) y 40 mg /ml de gentamicina (Gibco, BRL, VWR). La línea celular de adenocarcinoma de ovario OVCAR-3 (American Type Culture Collection, Cat. No. HTB-161) se cultivó en RPMI-1640 (Sigma-Aldrich Canadá, Mississauga, ON, Canadá) suplementado con 0,01 mg /ml de insulina bovina, 20% (v /v) de suero bovino fetal (FBS) estándar (Thermo Scientific, Waltham, MA, EE.UU.) y 10 mg /ml de gentamicina. La línea celular de adenocarcinoma de páncreas BxPC-3 (American Type Culture Collection, Cat. No. CRL-1424) se cultivó en medio RPMI-1640 suplementado con 10% (v /v) de suero bovino fetal (FBS) estándar y 40 mg /gentamicina mL. mucosa línea celular NCM460 de colon normal derivada (incell Corporation, LLC., San Antonio, TX, EE.UU.) se cultivó en medio M3Base de incell (incell Corporation, LLC., Cat. Nº M300A500) suplementado con 10% (v /v) FBS y 10 mg /ml de gentamicina.

Todas las células se cultivaron en condiciones óptimas de crecimiento de 37 ° C y 5% de CO2. Por otra parte, se pasaron todas las células de ≤ 6 meses.

se obtuvieron pimienta larga Extracción

Indio frutas maduras y pimienta larga secos de calidad Natural Foods Limited, Toronto, Ontario. El material vegetal se trituró y se extrajo en etanol anhidro (100%) en una relación de 1:10 (1 g de material vegetal a 10 ml de etanol). La extracción se llevó a cabo durante la noche en un agitador a temperatura ambiente. El extracto se pasa a través de un filtro grueso P8, seguido por un filtro de 0,45 micras. El disolvente se evaporó usando un RotorVap a 40 ° C y se reconstituyó en dimetilsulfóxido (Me
2SO) a una concentración madre final de 450 mg /ml.

Tratamiento de la célula

Las células se sembraron y se desarrollaron hasta el 60-70% de confluencia, antes de tratarla con pimienta larga Extractos (PLX), N-acetil-L-cisteína (NAC) (Sigma-Aldrich Canadá, Cat. No. A7250), y el inhibidor de caspasa de amplio espectro, Z-VAD-FMK (EMD Chemicals, Gibbstown, NJ, EE.UU.) a las dosis indicadas y duraciones. NAC se disolvió en agua estéril. Z-VAD-FMK se disolvió en dimetilsulfóxido (Me
2SO). PLX se extrajo como se describió anteriormente, reconstituida en Me
2SO. Antes del tratamiento, se preparó una concentración diluida de trabajo de 10 mg /ml en PBS. Las células fueron tratadas con 10 mg /ml a las concentraciones finales obtenidos se indican en la sección de resultados.

Evaluación de la Eficacia de la pimienta larga extracto (PLX) en células de cáncer

WST-1 Ensayo para la viabilidad celular.

Para evaluar el efecto de PLX en las células cancerosas, una sal de tetrazolio soluble en agua ensayo colorimétrico basado (WST-1) se llevó a cabo según el protocolo del fabricante (Roche Ciencias Aplicadas, Indianapolis, IN, EE.UU. ), para cuantificar la viabilidad celular como una función del metabolismo celular. Igual número de células se sembraron en placas de 96 pocillos de cultivo de tejido inferior claro entonces tratados con los tratamientos indicados en las concentraciones y duraciones indicadas. Después del tratamiento, las células se incubaron con el reactivo WST-1 durante 4 horas a 37 ° C con 5% de CO2. El reactivo WST-1 se escinde en formazán por las enzimas celulares en células metabolizantes de manera activa. El producto de formazán se cuantificó por la toma de lecturas de absorbancia a 450 nm en un Victor Wallac
3 1420 Multilabel contador (PerkinElmer, Woodbridge, ON, Canadá). La viabilidad celular como una medida de la actividad metabólica se expresó como porcentaje de los grupos de control con disolvente.

tinción nuclear.

Después de tratamiento, los núcleos de las células se tiñeron con 10 mM colorante Hoechst 33342 ( molecular Probes, Eugene, OR, USA) o 1 mg /ml de yoduro de propidio (PI) (Sigma Aldrich, Mississauga, ON. Canadá), para vigilar la morfología nuclear para la inducción de la apoptosis en los puntos designados de tiempo y la muerte celular en general. Las células se incubaron con 10 M Hoechst tinte y 1 mg /ml PI durante 10 minutos y micrografías se tomaron con un Leica DM IRB microscopio invertido de fluorescencia (Wetzlar, Alemania) a 400 × magnificación. basado en citometría de imagen se utilizó para cuantificar la cantidad de muerte celular que se produce con la tinción PI.

Anexina V Ensayo de unión.

Para confirmar la inducción de la apoptosis, la unión de Anexina V a fosfatidilserina exterioriza en la superficie celular externa, se evaluó. Tras el tratamiento con PLX, las células se lavaron dos veces en solución salina tampón fosfato (PBS). Posteriormente, las células se resuspendieron y se incubaron en tampón de Anexina V (mM HEPES 10, NaOH 10 mM, NaCl 140 mM, CaCl2 1 mM, pH 7,6) con Anexina V-AlexaFluor 488 (01:50) (Invitrogen, Canadá, Cat No vinculante . A13201) durante 15 minutos. En los últimos 10 minutos de incubación, 10 M Hoechst y 1 mg /ml de yoduro de propidio se añadieron al tubo de microcentrífuga y se incubaron durante los últimos 10 minutos en la oscuridad. Las micrografías se tomaron a 400 × ampliación en un microscopio Leica DM IRB invertida (Wetzlar, Alemania) y citometría basada en imágenes se utilizó para cuantificar el porcentaje de muerte celular programada (anexina V células positivas) que ocurren después del tratamiento.

la tinción de TUNEL para detectar el daño del ADN y cuantificar la apoptosis
.
Tras el tratamiento PLX, las células HT-29 fueron marcadas con el ensayo Terminal desoxinucleotidil transferasa dUTP nick fin de etiquetado (TUNEL). El ensayo se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante (Molecular Probes, Eugene, OR), con el fin de detectar daños en el ADN. Las células se trataron con PLX o VP-16 (como control positivo) a las concentraciones indicadas y puntos de tiempo y se analizaron para la fragmentación de ADN. Después del tratamiento, las células fueron fijadas mediante la suspensión en 70% (v /v) de etanol y se almacenaron a -20 ° C durante la noche. La muestra se incuba con una solución de marcaje de ADN (tampón de reacción 10 l, 0,75 l de la enzima TdT, 8 l BrdUTP, 31,25 l de dH2O) durante 1 hora a 25 ° C. Cada muestra se expone a una solución de anticuerpo (5 l Alexa Fluor 488 de anticuerpo marcado anti-BrdU y solución de enjuague l 95). Las células se incubaron con la solución de anticuerpo durante 20 minutos y las células TUNEL positivas se cuantificaron por citometría basada en imágenes.

Cell Whole ROS Generation.

Tras el tratamiento con PLX, las células se incubaron con 2 ', 7'-diacetato dichlorofluorescin H
2DCFDA (Nº de catálogo D6883, Sigma Aldrich, Mississauga ON. Canadá) durante 45 minutos. Las células se recogieron, se lavaron dos veces en PBS y se observó fluorescencia verde utilizando un TALI imagen de base citómetro (Invitrogen, Canadá). NAC se utilizó para evaluar la dependencia de PLX en la generación de ROS y la viabilidad.

Evaluación de la función mitocondrial después del tratamiento con PLX

tetrametilrodamina éster metílico (TMRM) tinción
.
Para monitorear potencial de membrana mitocondrial (MMP), éster metílico de tetrametilrodamina (TMRM) (Gibco BRL, VWR, Mississauga, ON, Canadá) o 5,5,6,6'-tetracloro-1,1 ', 3,3'-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine cloruro de ( se han usado JC-1) (Invitrogen, Canadá). Las células se cultivaron en cubreobjetos, se trató con las concentraciones indicadas de los tratamientos en los puntos de tiempo indicados, y se incubaron con 200 nM TMRM durante 45 minutos a 37 ° C. Las micrografías se obtuvieron a 400 × magnificación en una Leica DM IRB microscopio invertido de fluorescencia (Wetzlar, Alemania). Para confirmar los resultados obtenidos por microscopía de fluorescencia, se utilizó citometría de basado en la imagen para detectar la fluorescencia roja. Las células se sembraron en placas de 6 pocillos y después del tratamiento, las células se incubaron con TMRM durante 45 minutos, se lavaron dos veces en PBS y se coloca en TALI se desliza. se obtuvo fluorescencia roja utilizando un TALI basado en imagen citómetro (Invitrogen, Canadá).

Aislamiento mitocondrial para evaluar orientación mitocondrial.

Las células se recogieron con tripsina, se lavaron una vez en PBS frío, se resuspendió en tampón hipotónico frío (EDTA 1 mM, 5 mM Tris-HCl, manitol 210 mM, sacarosa 70 mM, 10 mM Leu-pep y Pep-A, 100 mM de PMSF), y se homogeneizaron manualmente. La solución de células homogeneizada se centrifugó a 3000 rpm durante 5 minutos a 4 ° C. El sobrenadante se centrifugó a 12.000 rpm durante 15 minutos a 4 ° C y el pellet mitocondrial se resuspendió en tampón frío de reacción (malato 2,5 mM, succinato 10 mM, 10 mM Leu-pep y Pep-A, 100 PMSF mu M en PBS). Las mitocondrias aisladas se trataron con PLX a las concentraciones indicadas y se incubaron durante 2 horas en tampón de reacción frío. El grupo de control se trató con disolvente (etanol). Después de la incubación de 2 horas con extracto, las muestras mitocondriales se agitaron en vórtex y se centrifugaron a 12.000 rpm durante 15 minutos a 4 ° C. Los pellets sobrenadante y mitocondriales resultantes (resuspendidas en tampón de reacción fría) se sometieron a análisis de Western Blot para evaluar la liberación mitocondrial /retención de factores pro-apoptóticos.

Los análisis Western blot.

Proteína muestras se sometieron a SDS-PAGE, se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa, y se bloquearon con 5% v TBST leche (Tris-solución salina tamponada con Tween-20) solución /durante 1 hora w. Las membranas se incubaron durante la noche a 4 ° C con un anti-endonucleasa G (EndoG) anticuerpo (1:1000) en conejos (Abcam, Cat. Nº ab9647, Cambridge, MA, EE.UU.), una subunidad anti-deshidrogenasa (succinato Un SDHA) anticuerpo (1:1000) planteado en ratones (Santa Cruz Biotechnology, Inc., sc-59687, Paso Robles, CA, EE.UU.), o un anti-factor inductor de apoptosis (AIF) anticuerpo producido en conejos (1:1000) (Abcam, Cat. Nº ab1998, Cambridge, MA, EE.UU.). Después de la incubación del anticuerpo primario, la membrana se lavó una vez durante 15 minutos y dos veces durante 5 minutos en TBST. Las membranas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con un anticuerpo anti-ratón o un anticuerpo de rábano picante anti-conejo conjugado con peroxidasa secundaria (1:2000) (Abcam, ab6728, ab6802, Cambridge, MA, EE.UU.), seguido de tres lavados de 5 minutos en TBST. quimioluminiscencia reactivo (Sigma-Aldrich, CPS160, Mississauga, ON, Canadá) se utiliza para visualizar las bandas de proteínas y análisis de densitometría se realizó utilizando el software ImageJ.


In-Vivo
Evaluación de la pimienta larga Extracto

Evaluación de la toxicidad.

Seis ratones de semana Balb /C se obtuvieron de Charles River Laboratories y se alojaron en condiciones de laboratorio constantes de un ciclo de 12 horas de luz /oscuridad, de acuerdo con los protocolos de origen animal esbozado en la Universidad de Windsor Ética de la Investigación de reunion AUPP 10-17). Después de la aclimatación, los ratones se dividieron en tres grupos (3 animales /control (sin tratar), 3 animales /control de alimentación forzada (tratamiento con vehículo) y 4 animales /grupo de tratamiento). El grupo de control sin tratamiento se le dio agua del grifo filtrada, mientras que el segundo y el tercer grupo recibió 50 mg /kg /día de vehículo (Me
2SO) o PLX, respectivamente, durante 75 días. Durante el período de estudio, la toxicidad se midió pesando los ratones dos veces a la semana y se recogió la orina para análisis de orina de proteínas mediante tira reactiva de orina y ensayos de Bradford. A raíz de la duración del estudio, los ratones fueron sacrificados y se obtuvieron sus órganos (hígado, los riñones y el corazón) para inmunohistoquímica y el análisis toxicológico por el Dr. Brooke en la Universidad de Guelph.

Eficacia de PLX en xenoinjertos de tumores de Modelos los ratones inmunodeprimidos.

Seis semanas de edad ratones CD-1 nu /nu se obtuvieron de Charles River Laboratories y se alojaron en condiciones de laboratorio constantes de un ciclo de 12 horas de luz /oscuridad, de acuerdo con los protocolos descritos en animales la Universidad de Windsor Ética de Investigación de reunion AUPP 10-17). Después de la aclimatación, los ratones se inyectaron por vía subcutánea en el lado derecho e izquierdo flancos traseras con una suspensión de células de cáncer de colon (en tampón fosfato salino) a una concentración de 2 * 10
6 células /ratón (HT-29, p53
- /-, en el flanco izquierdo y HCT116, p53
+ /+, en el flanco derecho). Los tumores se dejaron desarrollar (aproximadamente una semana), después de lo cual los animales se asignaron al azar en grupos de tratamiento de 4 ratones por grupo, un grupo control, un grupo de control de alimentación forzada dado agua estéril llanura filtrada, así como régimen de alimentación forzada del vehículo (5 l Me
2SO en PBS) dos veces a la semana. El último grupo se le dio agua filtrada complementado con extracto de Piper longum a una concentración de 100 mg /ml, así como régimen de alimentación forzada de extracto de pimienta larga (extracto de 5 l en PBS), dos veces a la semana, lo que corresponde a 50 mg /kg /día . Los tumores se evaluaron cada dos días mediante la medición de la longitud, anchura y altura, usando un calibrador estándar y el volumen del tumor se calculó según la fórmula π /6 * longitud * anchura. También se evaluaron los ratones para cualquier pérdida de peso cada dos días durante la duración del estudio, que duró 75 días, tras lo cual se sacrificaron los animales y se obtuvieron sus órganos y tejidos (hígado, riñones, corazón y tumores) y se almacenan en 10 % de formaldehído para el análisis inmunohistoquímico y toxicológica

hematoxilina & amp.; Eosina (H & amp; E). La tinción

órganos de los ratones fueron fijadas en formol al 10%, después de lo cual se cryosectioned en 10 micras secciones y se colocan en un SuperFrost /Plus portaobjetos de microscopio (Fisherbrand, Fisher Scientific). Secciones de órganos se tiñeron de acuerdo con un estándar de H & amp; Protocolo E [16].

Análisis fitoquímico del extracto de pimienta larga por HPLC
análisis por HPLC
del extracto crudo pimienta larga se llevó a cabo en la Universidad de Ottawa en el laboratorio Arnason. Se analizaron un total de cinco piperamides bien conocidos y se compara con el extracto de pimienta larga crudo. Las normas extractos y piperamide se analizaron en un Luna C18-5u-250 × columna de 4,6 mm a 45 ° C a una velocidad de flujo de 1,0 ml /min con una fase móvil constituida por H
2O y metanol como se indica en la Tabla 1 . perfiles cromatográficos se utilizaron para detectar las diferencias entre un estándar de la muestra de piperamides conocidos en los extractos de pimienta larga de crudo.

Análisis estadístico

Todos los experimentos se repitieron al menos tres veces independientes . Se muestran imágenes de fluorescencia de representación, en su caso. El análisis estadístico se realizó utilizando el software GraphPad Prism 6.0 288. La media y el error estándar de tres experimentos independientes se analizaron para los datos de cuantificación. T-test de Student y ANOVA de dos vías se utilizaron para el análisis estadístico

Resultados

extracto etanólico de pimienta larga (PLX) con eficacia y de forma selectiva reduce la viabilidad de & amp.; Induce la apoptosis en células de cáncer en una dosis & amp; Tiempo manera dependiente

El primer paso en la comprensión del efecto del extracto de Piper longum en este estudio fue evaluar el efecto de PLX sobre la viabilidad de células cancerosas. Después del tratamiento con la concentración creciente de PLX a aumentar los puntos de tiempo, las células se incubaron con una sal de tetrazolio soluble en agua, que consigue metaboliza a un producto formazan rojo por las células viables con metabolismo activo. Este producto a continuación, se puede cuantificar por espectrometría de absorbancia. Hemos observado la eficacia de PLX crudo en la reducción de la viabilidad de las células cancerosas, incluyendo de colon (HCT116), cáncer pancreático (BxPC-3), de ovario (OVCAR-3) y células de melanoma. Este efecto fue dependiente de la dosis y del tiempo (Figura 1). A fin de evaluar la actividad anticancerígena de PLX, quisimos evaluar su papel en la muerte celular y su selectividad para las células cancerosas. Nuestros resultados demuestran que PLX es capaz de inducir selectivamente la muerte celular en células de cáncer (de colon, de páncreas y leucemia) en una dosis y manera dependiente del tiempo, tal como se caracteriza por el aumento de yoduro de propidio de células positivas en las células cancerosas tratadas con PLX (Figura 2) . Además, este efecto era selectivo, como las células epiteliales de colon normales no se vieron afectados por este tratamiento, en las mismas concentraciones y los puntos de tiempo (Figura 2B). Estos resultados se cuantificaron utilizando citometría basado en la imagen para determinar el porcentaje de células que experimentan apoptosis y la muerte celular total. Se observó un aumento de 30 a 40% en células positivas anexina V, después del tratamiento PLX y un aumento positivo PI 80-100% en las mismas muestras de células, confirmando la inducción de la apoptosis, seguida de necrosis en las células cancerosas cultivadas (Figura 3).

Colon (HCT116), de ovario (OVCAR-3), las células de páncreas (BxPC-3) de cáncer de melanoma y (G-361) fueron tratados con un extracto etanólico crudo de la pimienta larga (PLX), tras lo cual se incubaron con medio de viabilidad-1 WST celular durante 4 horas. La absorbancia se leyó a 450 nm y se expresó como un porcentaje del control. Los valores se expresan como media ± SD de quadruplicates de 3 experimentos independientes. ** P & lt;. 0,0001

(A) Después del tratamiento de páncreas humano (BxPC-3) de cáncer y las células T de leucemia de células con PLX, en los puntos de tiempo indicados, las células se incubaron con yoduro de propidio y evaluado para la inducción de la muerte celular por imagen basada en citometría. (B) Experimentos similares se llevaron a cabo en células humanas de cáncer de colon (HT-29) y las células epiteliales de colon normal (NCM460). Microscopía de fluorescencia se utilizó para evaluar la inducción de la muerte celular tal como se caracteriza por la presencia de células positivas con yoduro de propidio. Las imágenes fueron tomadas a 400 × magnificación en un microscopio de fluorescencia. Barra de escala = 15 micras.

citometría de imagen-base se utilizó para cuantificar la inducción de apoptosis (anexina V% positivo), seguido por necrosis (PI% positivo) en E6-1 y células HT-29 siguiente tratamiento PLX. La falta de anexina V o tinción PI se utilizó como una indicación de células vivas después del tratamiento (% Anexina V /PI células negativas) (* P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,003, *** P & lt; 0,0001). (E) Para confirmar aún más la inducción de apoptosis.

fragmentación del ADN es una característica bioquímica clave de la apoptosis. Para confirmar aún más esta inducción de la apoptosis, el etiquetado TUNEL para detectar fue empleado fragmentación del ADN. resultados de la cuantificación de la imagen basada en citometría muestran la eficacia de PLX en la inducción de la apoptosis, siguiendo la fragmentación del ADN en células HT-29 de cáncer de colon de una manera dependiente del tiempo. VP16, un agente quimioterapéutico conocido con ADN capacidades perjudiciales, se utilizó como control positivo (Figura 4).

etiquetado TUNEL se utilizó para detectar la fragmentación del ADN. Tras PLX y VP16 (como control positivo para el daño del ADN) de tratamiento, las células se marcaron con solución de tinción de ADN y se cuantificaron por citometría basada en imágenes. Las células tratadas se compararon con la muestra de células sin tratar de control. (**** P & lt; 0,0001).

Además, la inducción de la apoptosis en varias células cancerosas, el melanoma (G-361) de las células, de ovario y cáncer de colon (HT-29), fue confirmada por Anexina -V ensayo de unión. Esta inducción de apoptosis se confirmó que era selectivo para las células cancerosas, como las células normales del colon (NCM460) no se vio afectado por el tratamiento PLX. Esto se indica mediante la condensación nuclear, morfología celular y la externalización de la fosfatidilserina a la cara externa de la membrana celular, como se indica por la tinción de Hoechst, imágenes de contraste de fase y de unión de colorante de la anexina V, respectivamente (Figura 5A y B). La selectividad de PLX a las células cancerosas se confirmó adicionalmente mediante el ensayo de viabilidad celular WST-1 que mostró que PLX era muy efectivo en dosis tan bajas, se observó fácilmente una ventana terapéutica (Figura 5C). El tratamiento de HT-29 con 0,20 mg /ml redujo efectivamente la viabilidad en aproximadamente un 90%, mientras que las células NCM460 se mantuvieron en 100% de viabilidad a la misma dosis. Esto indica que PLX puede ser más eficaz a dosis muy bajas, lo que reduce aún más las posibilidades de toxicidad asociada con el tratamiento

después del tratamiento con PLX, las células (de ovario;. OVCAR-3, melanoma; G-361 y Normal células epitelios de colon (NCM460) se tiñeron con Hoechst para caracterizar la morfología nuclear y Anexina-V para detectar células apoptóticas (a) y la morfología celular mediante microscopía de contraste de fase (B);. Las imágenes fueron tomadas a 400 × magnificación en un microscopio de fluorescencia barra de escala = 15 micras. (C) después del tratamiento PLX, HT-29 células de cáncer colorrectal y células NCM460 no cancerosas se incubaron con medio de viabilidad WST-1 de células durante 4 horas y la absorbancia se leyó a 450 nm y se expresó como un porcentaje del control de . Los valores se expresan como media ± desviación estándar de 3 experimentos independientes ** P & lt;.. 0,0001

PLX induce la caspasa-independiente de la apoptosis en células de cáncer humano

Las caspasas son proteasas de cisteína que aspártico jugar un papel predominante como proteasas de muerte [17]. sus papeles en diversos procesos de muerte celular sigue siendo controvertido, ya que su activación o inhibición podría ser esencial para la progresión de la inhibición de las vías de muerte celular [18], [19]. Para evaluar el papel de las caspasas en nuestro estudio, después del tratamiento con 0,10 mg /ml PLX, en los puntos de tiempo indicados, se recogieron BxPC-3 células, se lavaron y se incubaron con tampón de lisis para obtener lisado celular. El lisado celular se incubó con los sustratos de caspasa, específicos para cada caspasa (3, 8 y 9) y se incubaron durante una hora. Las lecturas de fluorescencia se obtuvieron utilizando un espectrofluorímetro. Nuestros resultados indican que PLX es capaz de activar las dos vías (extrínsecos y apoptosis intrínseca) de una manera dependiente del tiempo.