Extracto
Antecedentes
El carcinoma hepatocelular (CHC) es el quinto cáncer más común y la tercera causa más común de muerte por cáncer en todo el mundo. Sorafenib es el único fármaco para pacientes con carcinoma en estadio avanzado hepatocelular (HCC) que se ha demostrado que confieren un beneficio de supervivencia para los pacientes con HCC; sin embargo, tiene muchos efectos secundarios. Por lo tanto, se deben desarrollar estrategias terapéuticas alternativas con mayor seguridad y eficacia terapéutica para el tratamiento de HCC.
métodos y las conclusiones
Se demuestra que un extracto de
Graptopetalum paraguayense gratis ( GP) el regulado los niveles de expresión de varias proteínas, incluyendo onco AURKA, AURKB, y FLJ10540, en células de HCC. Para aislar los componentes activos en los extractos GP, hemos preparado fracciones extractos y se evaluaron sus efectos sobre la expresión de onco-proteínas en células de HCC. La fracción designada HH-F3 fue enriquecido en principios activos, exhibido efectos citotóxicos, y suprimido la expresión de los onco-proteínas en células de HCC. Se encontró que la estructura del compuesto activo principal en HH-F3 que sea similar a la de los compuestos de proantocianidina derivados de
Rhodiola rosea
. Además, se identificó un nuevo compuesto con características propias, en 3, 4, restos bencílicos 5-trihidroxi en las preparaciones HH-F3. Estudios mecanísticos indican que la apoptosis inducida HH-F3 en células de HCC mediante la promoción de la pérdida de potencial de membrana mitocondrial y la producción de especies reactivas del oxígeno. HH-F3 también se ha mejorado la expresión de PTEN y la disminución de la fosforilación de AKT en Ser473 de una manera dependiente de la concentración en células de HCC. Además combinación de GP o HH-F3 y sorafenib inhibe sinérgicamente la proliferación de células Huh7. El tratamiento de un modelo de rata con dietilnitrosamina (DEN) inducida por cáncer de hígado con extractos de GP y HH-F3 disminución de contenido de colágeno hepático y inhibió el crecimiento tumoral.
Conclusiones
Estos resultados indican que GP extractos y HH-F3 puede proteger el hígado por la supresión del crecimiento tumoral; en consecuencia, estos compuestos podrían considerarse para el tratamiento de HCC
Visto:. Hsu W-H, Chang C-C, Huang K-W, Chen Y-C, Hsu S-L, Wu L-C, et al. (2015) Evaluación de la hierba medicinal
Graptopetalum paraguayense
como un tratamiento para el cáncer de hígado. PLoS ONE 10 (4): e0121298. doi: 10.1371 /journal.pone.0121298
Editor Académico: Yuan-Soon Ho, de la Universidad de Medicina de Taipei, Taiwán
Recibido: 19 Agosto, 2014; Aceptado: 29 Enero 2015; Publicado: 7 Abril 2015
Derechos de Autor © 2015 Hsu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Consejo Nacional de Ciencia de Taiwán bajo el número de subvención NSC102-2627-B-010-001-, MOST103-2627-B-010- 001-, y MOST103-2627-B-030-001-; el Ministerio de Economía de Taiwán conceder los números 99-CE-17-A-S1-152, 100-EC-17-A-S1-152 y 101-EC-17-A-S1-152); y por una beca del Ministerio de Educación, el objetivo para el Plan Universitario Superior (103AC-T503). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el alcoholismo, la hepatitis viral y la esteatohepatitis no alcohólica son las tres principales causas de la inflamación crónica del hígado y lesiones. inflamación del hígado crónica puede conducir a la fibrosis hepática, cirrosis y carcinoma hepatocelular (HCC), que es la forma más común de cáncer de hígado y es responsable de 70% a 85% de las neoplasias malignas hepáticas primarias en adultos. Más del 80% de los pacientes con CHC son diagnosticados en una etapa avanzada de la enfermedad a la que ya no está indicado el tratamiento quirúrgico. En general, los pacientes con HCC no resecable tienen un mal pronóstico y rara vez se benefician de los tratamientos no quirúrgicos como la quimioterapia o la quimioembolización sistemática [1, 2].
señalización anormal en la vía PI3K /PTEN /AKT contribuye al desarrollo de una variedad de enfermedades hepáticas, incluida la enfermedad no alcohólica del hígado graso (NAFLD), esteatohepatitis no alcohólica (NASH), enfermedad hepática alcohólica (ALD), hepatitis viral y HCC [3]. La vía PI3K /PTEN /AKT se activa por la supresión epigenética de PTEN y /o mutaciones en o amplificación de los componentes individuales de la vía en aproximadamente el 40-50% de los pacientes con HCC [4-6]. Experimentalmente, la deleción de PTEN o la sobreexpresión de AKT en los hígados de ratones resulta en la esteatosis y el desarrollo de tumores [7, 8]. Estas observaciones experimentales sugieren fuertemente que la PI3K /PTEN /Akt juega un papel importante en hepatotumorigenesis.
Sorafenib, un inhibidor de quinasa de objetivos múltiples que fue aprobado para el tratamiento de HCC en 2007 [9], es el fármaco quimioterapéutico único estándar para los pacientes en estadio avanzado de HCC [10]. Este fármaco ha demostrado inhibir la proliferación de células tumorales mediante el bloqueo de la /vía Ras Raf /MAPK y la angiogénesis mediante el bloqueo de los dos VEGFR y PDGFR de señalización, frenando así el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos dentro del tumor [11]. En un estudio doble ciego, aleatorizado, ensayo clínico controlado (ECA) con una variable principal de supervivencia global [12], sorafenib aumentó el tiempo de supervivencia de los pacientes con HCC de 7,9 a 10,7 meses [13]. Sorafenib es el único fármaco que ha demostrado que confieren un beneficio de supervivencia para los pacientes con HCC; sin embargo, tiene muchos efectos secundarios. Actualmente, las opciones de tratamiento para los pacientes con CHC avanzado son limitadas. Por lo tanto, se deben desarrollar estrategias terapéuticas alternativas con mayor seguridad y eficacia terapéutica para el tratamiento de HCC.
Las hierbas medicinales se han utilizado durante miles de años para tratar una amplia gama de enfermedades, incluyendo las enfermedades inflamatorias y enfermedades crónicas del hígado (incluyendo hepatitis, fibrosis hepática y carcinoma hepatocelular). En este estudio, nos centramos en
Graptopetalum paraguayense gratis (GP), una hierba china tradicional que posee varios beneficios para la salud. De acuerdo con su prescripción china arcaica, GP es capaz de aliviar los trastornos hepáticos, presión arterial baja, blanquear la piel, aliviar el dolor, el tratamiento de infecciones, inhibir la inflamación y mejorar la función cerebral [14-16].
in vitro
estudios han demostrado que los extractos de las hojas de GP inhibir la tirosinasa y la enzima convertidora de angiotensina y eliminar los radicales libres [14-16]. Extractos del tallo de GP cultivadas con células de la línea celular HepG2 de HCC humano también se han demostrado que presentan propiedades antioxidantes y anti-proliferativos [17]. extractos a base de agua de GP también se han demostrado tener antioxidantes y propiedades anti-inflamatorias que protegen las células de daños CCl
4 inducida por el hígado oxidativo [18]. Los datos de nuestro anterior estudio de microarrays de perfiles mostraron que la expresión de varios genes relacionados con el metabolismo, el crecimiento y /o mantenimiento de células fue restaurado a niveles casi normales en ratas tratadas con DMN tratados con GP [19]. Nuestro estudio anterior también mostró que la administración de GP mitigado el daño y fibrosis
in vivo
hepático inducido por productos químicos y suprimió las células hepáticas estrelladas (HSC) y la activación de las células de Kupffer
in vitro
.
Los resultados antes mencionados sugieren que GP puede representar una opción terapéutica para el tratamiento de la inflamación hepática y fibrosis [20]. En este estudio, hemos demostrado que el médico de cabecera y su fracción HH-F3 tienen efectos anti-cáncer en el modelo de rata de diethylnitrosamine (DEN) inducida por el cáncer de hígado. posteriormente Mostramos que los extractos de GP y HH-F3 inducir la muerte celular apoptótica en células de HCC, lo que sugiere que GP y HH-F3 se podrían utilizar para la prevención o el tratamiento de HCC.
Materiales y métodos
líneas celulares p> Huh7 y PLC5 se obtuvieron del Dr. Zhong-Lin Zhe, hospital de la Universidad Nacional de Taiwán, Taiwán. línea celular HepG2 se adquirió de American Type Culture Collection (ATCC, http://www.atcc.org/en.aspx). Mahlavu líneas celulares fueron proporcionados por el Dr. Muh-Hwa Yang, Instituto de Medicina Clínica, Universidad Nacional Yang-Ming, Taiwán. hepatocitos humanos se adquirió de Sciencell Research Laboratories (http://www.sciencellonline.com/~~number=plural).
GP y
Rhodiola rosea
extracción, purificación y caracterización
hojas GP se molieron y se liofilizó en un polvo a -20 ° C y se almacena en un destructor de humedad a 25 ° C antes de la extracción. En primer lugar, 1,5 g de polvo de GP se sometió a vórtice con 10 ml de 100% de metanol (MeOH) durante 5 min y se centrifugó a 1500
g
por 5 min. El sobrenadante se retiró y diversos extractos se prepararon resuspendiendo los gránulos en 10 ml de H
2O, 100% de acetona, metanol al 100%, 100% de etanol, 70% de etanol, 50% de etanol, 100% de DMSO o 30 % de DMSO. La suspensión se agitó en vórtex durante 5 minutos, se centrifugó dos veces en 1500
g
de 5 min, se centrifugó de nuevo a 9300
g
por 5 min y se filtró a través de un filtro de 0,45-micras en una campana de flujo laminar a temperatura ambiente. El sobrenadante DMSO 30% se almacenó a -20 ° C como a /ml solución madre de 150 mg (referido como 30% de extractos DMSO GP) o fracciona en cuatro fracciones (F1-F4) utilizando una columna de Sephadex LH-20 (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Suecia) columna (Método I). Para simplificar los protocolos de preparación, también se llevó a cabo la diálisis directa de los extractos DMSO GP 30% contra el agua (Método II). ensayos colorimétricos en el 30% de DMSO GP extractos para la identificación de los taninos hidrolizables y condensados se realiza [21]. Las células de HCC fueron tratados con los extractos, y los niveles de proteína AURKA, AURKB y FLJ10540 se analizaron por Western blot; Se identificaron moléculas activas en la fracción F3 (que se refiere como la fracción HH-F3). La fracción HH-F3 se analizó adicionalmente por HPLC con un detector de UV (Shimadzu SPD-M10A), una columna de HPLC de fase normal (Phenomenex Luna 5u de sílice (2) 100A, 4,6 x 250 mm) y
1H- y
13C-NMR espectros para identificar la estructura de las moléculas activas. extractos de GP y la fracción HH-F3 también se sometieron a diálisis frente a agua utilizando una membrana de diálisis (MWCO 12-14,000) (Spectrum Laboratories, Rancho Domínguez, CA) para obtener los compuestos activos.
Rhodiola rosea
plantas se liofilizaron en un polvo y se almacenan en un destructor de la humedad a 25 ° C antes de la extracción. Una muestra de 1,5 g de
Rhodiola rosea
polvo se disolvió en 10 ml de H
2O, se centrifugó a 1500
g
por 5 min y se filtró a través de un filtro de 0,45 micras-en el laminar fluir campana a temperatura ambiente. Las muestras se almacenaron a -20 ° C como 150 mg de soluciones madre /ml.
Western blot
Los lisados de células de HCC se sometieron a SDS-PAGE para resolver las proteínas expresadas y se transfirieron a difluoruro de polivinilideno (PVDF) membranas utilizando un sistema de transferencia de Bio-Rad. Después de la transferencia, las membranas se tiñeron con Ponceau S para confirmar la eficacia y la uniformidad de la transferencia de proteínas. Las membranas se bloquearon con leche sin grasa desnatada 5% a temperatura ambiente durante 30 min y se incubaron con el anticuerpo primario a 4 ° C durante la noche. Posteriormente, las membranas se lavaron tres veces (10 min cada una) con solución salina tamponada con Tris 1x que contenía Tween-20 (TBST) y se incubaron con conjugado HRP-anticuerpos secundarios durante 2 horas. se añadieron y las señales de anticuerpos secundarios en las membranas se visualizaron con un sistema de análisis de imágenes luminiscentes LAS4000 Fujifilm: HRP; solución de peróxido de sustrato /reactivos de luminol (relación 1 se mezclaron en una proporción 1 Immobilon occidental Sustrato quimioluminiscente, Millipore). Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: anti-PTEN, anti-AKT, anti-p70S6K, anti-caspasa 3 y anti-PARP (Cell Signaling); anti-BCL2, anti-Bcl-XL y anti-caspasa 9 (GeneTex); anti-AURKA y anti-AURKB (BD Biosciences); y anti-FLJ10540 (Abnova). Todos los anticuerpos se utilizaron a una dilución de 1:. 1000
Viabilidad ensayo
Las células se sembraron en placas de 24 pocillos (4.000-5.000 células /pocillo) durante tratado durante la noche y luego con la 30% de DMSO extrae médico de cabecera o la fracción HH-F3: de 0, 24, 48 o 72 horas. Después del tratamiento, las células se lavaron suavemente 3 veces con 1x PBS (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na 10
2HPO
4, KH 2 mM
2 PO
4) y después se incubó con 0,5 mg /ml de 3- (4,5-cimethylthiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazolio (MTT, Sigma-Aldrich) durante 2 horas. El medio se eliminó, y los cristales de color azul oscuro se disolvieron con 100% de DMSO a temperatura ambiente durante 10 minutos. valores de DO se midieron a 570 nm con un lector de ELISA.
Recuento celular
Las células fueron sembradas en placas de 12 pocillos (10.000-20.000 células /pocillo) y se incubaron durante la noche. El día siguiente, las células fueron tratadas con la fracción de HH-F3 de 0, 24, 48 o 72 hrs. Después las células se tripsinizaron, se trató con 0,4% de azul de tripano y se contaron.
análisis del ciclo celular y citometría de flujo
Después de que las células habían sido tripsinizaron y se lavaron tres veces con PBS, se centrifugaron a 800
g
durante 5 min. Las células se resuspendieron en 70% de etanol en PBS y se mantuvieron a -20 ° C durante más de 16 horas. Las células se centrifugaron a 800
g
durante 5 minutos, y los sedimentos celulares se resuspendieron en PBS frío que contiene 100 mg /ml de ARNasa A (Sigma-Aldrich) durante 20 min. Después las células se tiñeron con 20 mg /ml de yoduro de propidio (PI, Sigma-Aldrich) durante 20-30 minutos, y se midió el contenido de ADN y se analizaron usando un software de análisis de BD FACSCanto y Flow Jo, respectivamente.
potencial de membrana mitocondrial ensayo
El potencial de membrana mitocondrial se analizó utilizando 5, 5 ', 6, 6' tetracloro-l, 1 ', 3, yoduro de 3'-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine (JC-1) adquiridas en Cayman Chemical Co. las células cultivadas se sembraron en placas de 96 pocillos negras a una densidad de 7.000 células /pocillo, se incubaron durante la noche y tratados con o sin la fracción HH-F3 durante 48 hrs. La solución de tinción JC-1 se añadió a cada pocillo y se mezcló suavemente a 37 ° C durante 15 a 30 min en la oscuridad. Las placas se centrifugaron a 400
g
a temperatura ambiente durante 5 min y el sobrenadante se eliminó de cada pocillo. El tampón de ensayo JC-1 se añadió a cada pocillo, las placas se centrifugaron durante 5 min a 400
g
a temperatura ambiente y se retiró el sobrenadante de cada pocillo. Finalmente, se añadió JC-1 tampón de ensayo a cada pocillo, y las placas se analizaron utilizando un lector de placa fluorescente.
La medición de los niveles de ROS
La generación intracelular de radicales superóxido (O
2
-) se evaluó mediante fluorescencia hydroethidine (AAT Bioquest, Inc.). Las células se trataron con o sin la fracción HH-F3 durante 48 hrs. Hidroetidina (10 mM) se añadió a cada pocillo y se mezcló suavemente durante 30 a 60 min a 37 ° C en la oscuridad. fluorescencia celular se monitorizó a una longitud de onda de excitación de 520 nm y una longitud de onda de emisión de 610 nm. los niveles de peróxido intracelular se midieron utilizando diclorofluoresceno (DCFH) diacetato (marcador genético Technologies, Inc.). Después de que las células habían sido tratadas con la fracción de HH-F3 durante 48 horas, el medio se aspiró y las células se lavaron dos veces con PBS. Las células se incubaron con DCFH a una concentración final de 20 mM en un medio libre de suero durante 30 a 60 min a 37 ° C en la oscuridad, se lavaron de nuevo con PBS y se mantuvieron en 200 l de medio de cultivo. fluorescencia celular se monitorizó a una longitud de onda de excitación de 485 nm y una longitud de onda de emisión de 528 nm.
animales, el medio ambiente experimental, y el protocolo
El Cuidado de Animales y el uso comité de la Facultad de Medicina , Universidad Nacional de Taiwán, aprobó todos los protocolos experimentales. Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del cuidado de animales de la universidad.
Se utilizaron Ciento veinte ratas de seis semanas de edad, machos Wistar albinas (150-180 g). Todos los animales se les permitió aclimatarse durante siete días y siempre pienso estándar y agua
ad libitum
durante el período experimental.
Las ratas fueron asignados al azar al grupo normal (N = 10), el dietilnitrosamina (DEN) grupo (N = 30), el grupo GP de baja dosis (N = 30) o el grupo de dosis alta GP (N = 30). Cinco ratas adicionales se incluyeron en el grupo tratado con HH-F3. Para todos los grupos excepto el grupo normal, la única fuente de agua potable durante 63 días era una solución acuosa de 100 ppm (v /v) DEN (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.) que se ha cambiado todos los días; a partir del día 64, las ratas se les proporcionó agua del grifo durante otros 14 días. La solución se preparó DEN cada semana y consistió en una dosis individualizada calculado de acuerdo con el aumento de peso /pérdida experimentada por el animal en respuesta a la dosis previa. No se observaron tumores en el hígado a partir del día 42, y se observó fibrosis hepática a partir del día 63. Durante el período experimental, los animales se pesaron semanalmente para calcular la ganancia de peso; Además, se midió la cantidad de agua consumida por las ratas cada semana. Las ratas del grupo de dosis baja recibieron 0,6 g /rata de polvo liofilizado GP; las ratas en el grupo de dosis alta recibieron 1,8 g /rata de polvo de GP liofilizada; las ratas del grupo de HH-F3 recibieron 0,036 g /rata de polvo liofilizado HH-F3 todos los días durante tres semanas comenzando el día 42.
procedimiento de recolección y evaluación morfológica del hígado
Todo animales fueron sacrificados en el día 84. Los animales se mantuvieron en ayunas durante la noche y se sacrificaron por CO
2 inhalación. Después de que las ratas habían sido sacrificados, se pesaron sus cuerpos, hígados y bazos; una laparotomía media se llevó a cabo y las condiciones de los órganos fueron observadas en la autopsia. Todos los lóbulos del hígado se recogieron rápidamente y se examinaron a fondo para describir la superficie del hígado y para caracterizar el desarrollo de focos de hígado, nódulos persistentes (PN) o cáncer en cada punto de tiempo. Posteriormente, el hígado se cortó en secciones de 5 mm. Todos los nódulos macroscópicamente visibles en la superficie del hígado y en las secciones de 5 mm fueron contadas y medidas.
La carga tumoral evaluación
Para establecer el curso del desarrollo de tumores en los animales expuestos a DEN, todo lóbulos del hígado se recogieron inmediatamente, y todos los nódulos macroscópicamente visibles en la superficie del hígado y en las secciones de 5 mm fueron contados y medidos. cargas tumor en el hígado se determinaron mediante la estimación de las sumas de los volúmenes de todos los nódulos tumorales mayor que 3 mm de diámetro para cada animal; las cargas tumorales fueron comparados entre los grupos.
velocidad de flujo de bilis
Antes del sacrificio, los animales fueron anestesiados con 80 mg /kg de ketamina y su tasa de flujo de la bilis se midió con un PE10 tubo de silicona colocado en el conducto biliar común y conectado a un tubo de polietileno calculado. El flujo biliar en el tubo se midió a intervalos de 5 minutos.
evaluación histopatológica
Después de que se haya drenado la sangre, tejidos rodajas de 5 mm de espesor que contienen tumores fueron disecados de cada lóbulo de la hígado. Se cortaron secciones (5 micras) y se tiñeron con hematoxilina y eosina para el análisis histopatológico utilizando publicado criterios de diagnóstico.
Tinción inmunohistoquímica de α-actina de músculo liso (α-SMA)
Las muestras de hígado fueron fijado con formalina, embebido en parafina y se seccionaron en secciones de 5 micras. Las secciones se desparafinaron, se rehidrataron y se trataron con peróxido de hidrógeno 0,03% durante 10 min a apagar la actividad de la peroxidasa endógena. Después de dos lavados con PBS, las secciones se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con un anticuerpo monoclonal anti-humano α-SMA ratón (dilución 1:50, Dako Cytomation, Dinamarca). Para la tinción de α-SMA, las secciones se lavaron y se incubaron con un anticuerpo secundario de conejo anti-IgG de ratón (dilución 1: 200) a temperatura ambiente durante 1 hr. Las secciones fueron desarrollados de manera similar. Después de la tinción, las secciones se contratiñeron con hematoxilina para los análisis de microscopía. El porcentaje de zonas de α-SMA-positivas (mm
2 /cm
2 de la sección del hígado) se determinó usando un sistema de cámara digital HC-2500 (Fuji Photo Film), Adobe Photoshop versión 5.0J e Imagen-Pro además de la versión 3.0.1J
Ensayo de contenido de hidroxiprolina en el hígado
muestras de hígado se pesaron, y se hidrolizan 20 mg de las muestras congeladas en 20 ml de HCl 6 N y cuidado del suelo.; Después, se añadió HCl 6 N para obtener un volumen total de 30 ml /mg de tejido. El tejido molido se hidrolizó a 120 ° C durante 16 hrs. Después de un breve período de enfriamiento en hielo y centrifugación a 8000
g
de 10 min, se retiró el sobrenadante y se colocó en un nuevo tubo; el volumen perdido por evaporación se repone con agua. Se añadió un volumen igual de NaOH 6 N y se mezcla, y el pH de la solución se ajustó a pH 4-9 usando papel de tornasol. Cuarenta microlitros de la solución de la muestra neutralizada se añaden a los pocillos de una placa de 96 pocillos ELISA y se oxida utilizando una solución que contiene 5 ml de 7% de la cloramina T (Sigma-Aldrich) y 20 ml de tampón de acetato /citrato. Se añadió un ciento cincuenta mililitros de la solución de Ehrlich. La mezcla final se incubó a 60 ° C durante 35 min y a temperatura ambiente durante 10 min; A continuación se determinó la absorbancia a 560 nm. Las soluciones estándar que contienen 100, 80, 60, 40, 20 y 0 mg /ml de la auténtica-hidroxi-L-prolina 4 (Sigma-Aldrich) se trataron de una manera similar. La curva estándar fue lineal en este rango de concentraciones (
r
= 0,99). El nivel de hidroxiprolina hepática se expresó como mg de hidroxiprolina /g de peso del hígado húmedo. Todos los ensayos se realizaron por triplicado.
El análisis estadístico
Todos los resultados se expresaron como la media ± error estándar de la media. Los niveles de significación fueron evaluados por dos colas
t-test o
solo sentido el análisis de varianza de Student para datos apareados (ANOVA).
P Hotel & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
Resultados
Los efectos antiproliferativos de diferentes preparaciones GP en Huh7 y células Mahlavu
Para probar los posibles efectos biológicos de GP, GP diversos extractos se prepararon utilizando agua, butanol, acetona, metanol, 100% de etanol, 70% de etanol, 50% de etanol, 100% DMSO o 30% DMSO y se utilizan para el tratamiento de células de HCC humanos. La inhibición del crecimiento inducida por los diferentes extractos GP se examinó. Los datos de los ensayos de MTT indicó que el DMSO 30% Extractos redujo significativamente la viabilidad de las células Huh7 y Mahlavu (Fig 1A); más específicamente, las concentraciones de 500 y 250 g /ml resultaron en una inhibición del 50% de la viabilidad celular (IC
50) 72 horas post-tratamiento para Huh7 y Mahlavu células, respectivamente (Fig 1B).
Huh7 y células Mahlavu se trataron con extractos de GP preparada en agua, butanol, acetona, metanol, etanol al 100%, 70% de etanol, 50% de etanol, 100% de DMSO, o 30% de DMSO en concentraciones de 100, 150, 250, 500, 750 , 1000 y 1500 mg /ml durante 72 horas. La viabilidad de las células tratadas se determinó usando ensayos de MTT. Los extractos DMSO GP 30% se asoció con la mayor inhibición de crecimiento de las células Huh7 y Mahlavu después de 72 hrs. (B) células Huh7 y Mahlavu fueron tratados con concentraciones de 0, 250, 500, 750 y 1000 mg /ml del 30% de DMSO GP extrae por 24, 48, y 72 hrs, y se llevaron a cabo ensayos de MTT. El IC concentraciones
50 del 30% de DMSO GP extractos para la inhibición del crecimiento de las células Huh7 y Mahlavu fueron aproximadamente 500 y 250 g /ml, respectivamente, después de 72 horas de tratamiento. las células (C) HepG2 y Huh7 fueron tratados con los extractos preparados en GP 30% de DMSO, agua o butanol (BuOH) durante 48 hrs. Los niveles de AURKA, AURKB y FLJ10540 se midieron mediante análisis de transferencia Western. Los niveles de expresión de AURKA, AURKB y FLJ10540 en células HepG2 y Huh7 fueron suprimidos por los extractos DMSO GP 30%, pero no por las fracciones preparadas en agua o butanol. (D) células HepG2 fueron tratadas con 75 ng /ml del agente de sincronización nocodazole (NOC) durante 18 horas; las células se trataron entonces con 750 g /ml de la 30% de extractos DMSO GP o control de vehículo (30% DMSO) para otras 3 hrs. transferencia de Western se realizó con anti-FLJ10540, anti-AURKA y los anticuerpos anti-AURKB. células HepG2 (E) fueron tratados con los extractos DMSO GP 30% y sus fracciones (HH-F1, HH-F2, F3 y HH-HH-F4) durante 3 hrs. AURKA y AURKB niveles de expresión en las células HepG2 fueron suprimidos por la fracción HH-F3, pero no por las otras fracciones. células (F) Huh7, Mahlavu y PLC5 se trataron con varias concentraciones de HH-F3 durante 48 hrs. La expresión de proteínas AURKA y FLJ10540 se evaluó mediante análisis de inmunotransferencia. HH-F3 reduce los niveles de proteína y AURKA FLJ10540 de una manera dependiente de la concentración.
GP reduce AURKA, AURKB y FLJ10540 niveles de expresión de proteínas durante tanto interfase y mitosis en las células estrelladas hepáticas activadas y las líneas celulares de HCC
AURKA, AURKB y FLJ10540 son oncogenes que comúnmente se sobreexpresan en HCC [22-24]. Accidentalmente, se encontró que los 30% de extractos DMSO GP inhibieron los niveles de expresión de proteínas de FLJ10540, AURKA y AURKB en líneas celulares de HCC (HepG2 y Huh7) de una manera dependiente de la concentración (Figura 1C, S1 FIG). Por el contrario, los extractos GP preparados en agua o butanol no inhibieron los niveles de expresión de proteínas de AURKA o AURKB en las células HepG2 después de 72 horas de tratamiento (Fig 1C). Es bien conocido que los niveles de expresión de AURKA, AURKB y FLJ10540 son más altos durante la metafase que durante la interfase [25-27]. Por ello, investigó si los 30% de extractos DMSO GP podrían inhibir la expresión de estas proteínas durante la mitosis en células de HCC. células HepG2 fueron tratados primero con 75 ng /ml de nocodazol durante 18 horas; estas células se trataron luego con el 30% de DMSO GP extrae durante 3 horas (sin lavado de la nocodazole). AURKA, AURKB y FLJ10540 niveles de expresión eran altas durante la mitosis. En las células tratadas con los extractos DMSO GP 30%, los niveles de expresión de proteínas de AURKA, AURKB y FLJ10540 se redujeron durante la interfase y metafase (Fig 1D); en contraste, no se observaron cambios significativos en los niveles de expresión de otras proteínas de la mitosis (PIN1, HURP y PLK) (datos no mostrados).
HH-F3 suprime la expresión de proteínas AURKA en líneas celulares de HCC
a continuación, utilizando una columna de Sephadex LH-20, se obtiene cuatro fracciones de los extractos DMSO GP 30% (S2A FIG). Western blot realizados 3 horas después del tratamiento mostraron que sólo la tercera fracción (HH-F3) suprimió la expresión de AURKA y AURKB en las células HepG2 (Figura 1E). A continuación, las células Huh7, Mahlavu y PLC5 fueron tratadas sin o con 25, 50 y 75 g /ml de la fracción HH-F3 durante 48 hrs. La expresión de AURKA y FLJ10540 en las tres líneas celulares de HCC se suprimió significativamente por HH-F3 (Fig 1F). Para investigar si los efectos inhibitorios de HH-F3 se produjeron a nivel transcripcional, se analizó la variación de niveles de expresión génica de
FLJ10540
y
AURKA
,
AURKB
y
AURKC gratis (miembros de la familia de las quinasas Aurora de genes). células HepG2 fueron tratados con 50 mg /ml de la fracción HH-F3 durante 6 horas, y la expresión génica y los niveles de proteína se midieron por microarray (chip U133A, Affymetrix) y transferencia Western, respectivamente. No había casi ningún cambio en los niveles de expresión génica de cualquiera de los genes de referencia por el tratamiento con HH-F3; sin embargo, se observaron descensos en los niveles de proteína (datos no mostrados). Estos resultados sugieren que la fracción HH-F3 regula la expresión de FLJ10540 y las moléculas de la familia quinasa Aurora a nivel de traducción en lugar de en el nivel transcripcional.
Identificación de los componentes activos en GP
para simplificar los protocolos de preparación, se utilizó otro método (método II) mediante diálisis directa de los extractos DMSO GP 30% contra el agua. Las propiedades fisicoquímicas de los compuestos obtenidos utilizando el Método II se enumeran en la Tabla S1, y estos datos indicaron que las fracciones obtenidas con el Método I (el método utilizado inicialmente para preparar HH-F3) y Método II eran idénticos. Después de la liofilización, característico color rosado y el brillo de metal como la plata parcial de la fracción HH-F3 se observó. De acuerdo con las señales aromáticas ampliado en
1H y
13C espectros de RMN, los componentes principales de la fracción HH-F3 fueron identificados como compuestos polifenólicos; más específicamente, taninos. Un ensayo colorimétrico (OD
500) para la cuantificación de la tanino condensado usando catequina como el estándar mostró que el contenido total de taninos de la fracción HH-F3 fue de aproximadamente 68% (datos no mostrados). La huella de la HPLC de la fracción de HH-F3 (S2 Fig 2B) reveló que esta fracción contenía dos grupos de compuestos (los Grupos A y B) con gamas distintas de pesos moleculares; Grupo B contenía una mayor y un componente de menor importancia. Estos resultados revelaron la fracción de la HH-F3 era rico en taninos condensados y contenía compuestos con pesos moleculares elevados.
(A) de hepatocitos humanos se trataron con varias concentraciones de 30% DMSO extractos GP /HH-F3 para 72 horas Los datos se expresan como media ± desviación estándar (DE) de tres experimentos independientes. Huh7, células Mahlavu y PLC5 se trataron con 5, 25, 50 y 75 g /ml de la fracción HH-F3 en para 24, 48 y 72 hrs después se sometieron al ensayo MTT (B) y tripán ensayo de azul (C). El IC
50 concentraciones de HH-F3 para la inhibición del crecimiento de las células Huh7, Mahlavu y PLC5 eran aproximadamente 50, 37,5 y 75 mg /ml, respectivamente, después de 72 horas de tratamiento.
Debido a que no hay compuestos poliméricos sin embargo, se han aislado de GP, los compuestos polifenólicos de
Rhodiola rosea gratis (raíz de oro), otra hierba de la familia Crassulaceae, se utilizaron como compuestos de referencia para la determinación estructural de compuestos en el HH- fracción F3.
R
.
rosea
se ha informado que contienen taninos condensados (TC). Las propiedades químicas de los compuestos principales en la sub-fracción HH-F3a, tanto de los métodos I y II, fueron muy similares a las de los transformadores de intensidad en
R
.
rosea gratis (raíz de oro). Además, ya que los compuestos de CT se encuentran con frecuencia en muchas especies de uva común,
Vitis vinifera
TC fueron también usados como compuestos de referencia. S1 tabla resume las propiedades fisicoquímicas de la proantocianidina polimérico de
R
.
rosea
y
Vitis vinifera
. Su alta proporción en 3, 4, 5-trihidroxi sustituyentes bencílicos de HH-F3a (identificados por los
13C desplazamientos químicos en 105 ppm y 109 ppm para C-2 '/6' y C-2 "/6" de la unidad de EGCG, respectivamente; espectros no se muestra) era muy similar a la del compuesto que se encuentra en
R
.
rosea
, pero mucho más alto que el compuesto que se encuentra en la piel de la uva y semillas (ver Tabla S1). En consecuencia, el TC presenta en HH-F3a se propuso como proantocianidinas polimérico con una unidad dominativa prodelfinidina repitiendo y (4 → 8) -linkages (ver Fig S2C).