Extracto
Antecedentes
El cáncer de páncreas es uno de los cánceres más mortales con una tasa de supervivencia a 5 años del 6%. Las opciones terapéuticas son muy limitadas y hay una necesidad médica no satisfecha de tratamientos seguros y eficaces. metabolismo de las células del cáncer y las mitocondrias proporcionan objetivos inexplorados para esta enfermedad. Recientemente hemos identificado una nueva clase de compuestos de sales de trifenilfosfonio, TP, con propiedades contra el cáncer de amplio espectro. Se examinó la capacidad de nuestro compuesto prototípico TP421- elegido por sus propiedades fluorescentes -. Para inhibir el crecimiento de células de cáncer de páncreas y más investigado los mecanismos moleculares por los cuales ejerce sus efectos contra el cáncer
Metodología /Principales conclusiones
TP421 exhibió submicromolares IC
50 valores en todas las líneas celulares de cáncer pancreático a prueba utilizando ensayos de MTT y de formación de colonias. TP421 localizada predominantemente a las mitocondrias e indujo G
0 /G
1 detención, la acumulación de ROS, y la activación de varias quinasas reguladas estrés. Se observaron caspasa y PARP-1 escisión que indica una respuesta apoptótica mientras LC3B-II y p62 se acumularon indicando la inhibición de la autofagia. Además, TP421 inducida de-la fosforilación de moléculas de señalización clave que participan en la adhesión mediada por FAK que se correlacionaron con la inhibición de la migración celular.
Conclusiones /Importancia
TP421 es un compuesto representativo de una nueva clase prometedora de agentes mitocondriales de orientación útiles para el tratamiento del cáncer de páncreas. Debido a su mecanismo de acción único y eficacia mayor desarrollo está garantizado
Visto:. Shabaik YH, Millard M, N Neamati (2013) Evaluación de los mecanismos de acción de una novela pequeña molécula diana mitocondrias en las células del cáncer pancreático. PLoS ONE 8 (1): e54346. doi: 10.1371 /journal.pone.0054346
Editor: Aamir Ahmad, Escuela de Medicina de la Universidad Estatal de Wayne, Estados Unidos de América
Recibido: 12 de julio de 2012; Aceptado: December 12, 2012; Publicado: 21 Enero 2013
Derechos de Autor © 2013 Shabaik et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado en parte por fondos del Premio de mama Programa de Investigación médica Dirigido por el Congreso del cáncer de síntesis y la Sharon y el Fondo de Investigación del cáncer William Cockrell dotado. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de páncreas es la cuarta causa principal de muertes relacionadas con el cáncer en los Estados Unidos con una tasa de supervivencia global a 5 años, de 6% [1]. Desde 2005, el tratamiento quimioterapéutico estándar es la administración de gemcitabina, un análogo de nucleósido, en combinación con erlotinib, un inhibidor de quinasa [2], [3]. La gemcitabina se dirige a la ribonucleótido reductasa causando el agotamiento de los dNTPs y además se incorpora en el ADN causando un puesto en la síntesis de [4]. Por otro erlotinib parte, pensado originalmente para dirigir el factor de crecimiento epidérmico receptor (EGFR), recientemente se ha documentado que un inhibidor de la multi-quinasa [5]. La vía para la actividad de gemcitabina es suficientemente complicado, incluyendo transportadores de captación y fosforilación intracelular que conduce a la citotoxicidad, lo que contribuye a la baja tasa baja tasa de respuesta en pacientes y el creciente desarrollo de la quimio-resistencia [6]. Se ha propuesto recientemente que PDAC estratificación en múltiples subtipos basados en las diferencias moleculares puede determinar la respuesta a la quimioterapia [7]. Dos de los tres subtipos definidos están representados entre las líneas celulares de cáncer de páncreas de uso común, incluyendo MIA Paca-2, PANC-1 y HPAC la que hemos utilizado en nuestro estudio.
Entre los cambios moleculares tempranos de cáncer de páncreas es subyacente un constitutivamente la activación de la mutación K-ras que se produce en casi el 100% de los casos [8], [9]. Durante la transformación, K-ras de señalización unidades excesiva proliferación celular y promueve la supervivencia. Se ha propuesto que la producción de energía mitocondrial es fundamental para apoyar las células transformadas por Ras que se convierten en muy dependiente de la autofagia, un estado conocido como "adicción a la autofagia", para mantener una piscina saludable de las mitocondrias y suficiente del ciclo TCA intermedios para apoyar la fosforilación oxidativa ( la fosforilación oxidativa) [10], [11]. Cabe destacar que, en líneas celulares de cáncer de páncreas y las muestras de pacientes, el nivel basal de la autofagia es elevado en comparación con las células normales o células de otras líneas celulares de tumor y se correlaciona con resultados más pobres clínicos [10], [12]. Este fenotipo característico de células transformadas por Ras, los hace particularmente susceptibles a la interrupción de la respiración mitocondrial y la autofagia. De hecho, la inhibición farmacológica, así como el silenciamiento de genes clave autofagia se ha traducido con éxito en la reducción del consumo de oxígeno mitocondrial y los niveles de ATP intracelulares que conducen a una profunda inhibición del crecimiento del cáncer pancreático tanto in vitro como in vivo [10]. Por lo tanto, la inhibición de la autofagia y la orientación mitocondrial podría proporcionar un nuevo enfoque para el tratamiento de PDAC que son por lo general altamente refractaria a las quimioterapias disponibles. De hecho, ha habido un reciente aumento en el interés por la orientación mitocondrias celulares de cáncer tras el reconocimiento de su estado alterado bioenergético como factor que contribuye a la patogénesis del cáncer [13]. En consecuencia, las mitocondrias de orientación ha surgido como un nuevo ideal para la terapia contra el cáncer ayudado en parte por el conocimiento de lograr la entrega precisa de medicamentos para el orgánulo. El uso de agentes dirigidos mitocondriales de terapias contra el cáncer presenta un beneficio adicional de actuar directamente sobre el regulador principal de la muerte celular programada dentro de la célula y pasando por alto por completo las cascadas de señalización aguas arriba que a menudo se ven socavados [14]. Ha sido bien documentado que las mitocondrias de las células malignas presentan un potencial transmembrana superior en comparación con células no malignas con diferencias en la actividad de las enzimas, transportadores de electrones y la estructura lipídica de la membrana como posibles causas subyacentes [15]. La explotación de este atributo único ha llevado al diseño de nuevos cationes lipófilos que pueden acumularse preferentemente en las mitocondrias de células tumorales sobre el tejido normal accionado por el aumento del potencial transmembrana [15]. Conjugación de trifenilfosfonio (TPP) cationes a una variedad de sondas químicas y fármacos es ampliamente utilizado para lograr la orientación específica a la mitocondria [16], [17], [18], [19], [20]. Una vitamina E analógico-etiquetados TPP (MitoVES) ha sido ampliamente estudiado por su apoptóticos y anti-angiogénicos, que están ahora en aumento sobre la del compuesto sin designación de los padres, el apoyo orientación mitocondrial como un enfoque viable para mejorar la eficacia de la actividad moderada candidatos a fármacos [20], [21], [22]. Por otra parte, las compañías de suministro de fármacos tales como dendrímeros y lipososmes han sido modificados con cationes TPP y se utilizan para entregar la carga a la mitocondria [17], [23], [24], [25]. Cuando estas compañías estaban cargadas con fármacos quimioterapéuticos modelo incluyendo paclitaxel o doxorubicina, la eficacia fue en aumento sobre los transportistas que no son objeto que indican que la entrega de las mitocondrias puede mejorar la apoptosis y la citotoxicidad.
Hemos informado anteriormente el descubrimiento de una nueva clase de sales de TPP que tienen actividad contra el cáncer de amplio espectro [26]. Estos compuestos se pueden acumular en las mitocondrias en virtud de sus restos TPP de carga positiva y el potencial negativo a través de las membranas mitocondriales [27]. Posteriormente, hemos demostrado que estos compuestos son capaces de abrogar la respiración mitocondrial y el aumento de niveles de superóxido mitocondriales. Lo más importante, hemos demostrado que esta clase de compuestos puede inhibir eficazmente el crecimiento del tumor en un modelo de xenoinjerto de cáncer de mama de ratón desnudo sin toxicidad aparente [26]. Debido a su mecanismo único de acción de orientación de las mitocondrias y la exquisita dependencia de los tumores dirigidos-Ras en la función mitocondrial, hemos tratado de desarrollar esta clase de compuestos como agentes novedosos contra el cáncer de páncreas. Además, dada la importancia de la autofagia para mantener una piscina saludable de las mitocondrias para apoyar la supervivencia y proliferación de las células transformadas Ras, la hipótesis de que TP421 podría inducir la muerte celular en células de cáncer de páncreas en una manera que implica la regulación de la autofagia de las mitocondrias.
Materiales y Métodos
líneas celulares y cultivo Reactivos
MIA Paca-2, PANC-1, las líneas celulares de cáncer de páncreas HPAC fueron adquiridos de la American Type Culture Collection (ATCC BxPC-3 y; Manassas, VA). MEF atg3 + /+ y atg3 - /- líneas celulares murinas fueron un regalo de Masaaki Komatsu (Escuela de Medicina de la Universidad de Juntendo, Bunkyo-ku, Tokio) [28]. HFF-1 línea celular de fibroblastos normales fue proporcionada por el Dr. Carla Grandori (Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA). Todas las líneas celulares utilizadas para la experimentación se mantuvieron en cultivo de menos de 35 pasajes y pruebas periódicas para determinar la contaminación por micoplasmas usando PlasmoTest ™ (InvivoGen, San Diego, CA). células PANC-1 MIA PaCa-2 y se mantuvieron en DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS; Gemini-Bioproducts, West Sacramento, CA). BxPC-3, MEF atg3 + /+ y atg3 - /- las células se mantuvieron en RPMI suplementado con 10% FBS. células HPAC se mantuvieron en 01:01 mezcla de DMEM y medio F12 de Ham suplementado con 5% de FBS. Las células se cultivaron a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO2. Para todos los experimentos, las células en fase de crecimiento exponencial se lavaron con DPBS sin calcio y magnesio, brevemente con tripsina en un pequeño volumen de 0,25% de solución de tripsina-EDTA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), se resuspendieron en medio de cultivo completo , contados manualmente y se sembraron en placas estériles y se dejaron adherir durante la noche antes de tratar.
compuestos
Todos los compuestos se almacenan como DMSO madre concentradas congeladas a -20 ° C. Las diluciones se prepararon en DPBS, sin calcio y magnesio, y re-utilizados para un máximo de 3 ciclos de congelación-descongelación. Los compuestos fueron adquiridos de LKT Laboratories Inc. (St. Paul, MN), Sigma-Aldrich Corp. (St. Louis, MO) y Asinex Ltd (Moscú, Rusia).
Ensayo de citotoxicidad
la citotoxicidad se mide por el 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio (MTT) ensayo colorimétrico como se describe anteriormente [26].
ensayo de formación de colonias
las células se sembraron en placas de 6 pocillos (500-1000 células por pocillo, dependiendo de la línea celular) y se dejó durante la noche a adherirse. El día siguiente, se añadieron los fármacos a los pocillos de 24 h después de lo cual los medios de comunicación se sustituyó con el fármaco libre de los medios de comunicación. Las células se incubaron adicionalmente durante 7-14 días para permitir que las colonias a la forma. Las colonias se tiñeron con una solución de cristal violeta (0,05% de cristal violeta, 0,74% de formaldehído y 36% de metanol), enjuagados y luego fotografiado.
La exclusión de azul de tripano Ensayo
Se recogieron las células tratadas a través de breves tripsinización y teñidas utilizando solución de azul de tripano al 0,4% (Lonza Group Ltd) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Las células se contaron usando un hemocitómetro.
Alamar Blue viabilidad celular Ensayo
Las células fueron manejados idéntico al ensayo MTT descrito anteriormente. Al final del tratamiento, azul alamar (ABD Serotec
©) se añadió a los pocillos de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. La fluorescencia se detecta en longitudes de onda 560/590 EX /em.
Ciclo Celular Determinación
Se recogieron las células tratadas con la droga a través de tripsinización breve, y se fijaron en etanol al 70% a -20 ° C durante al menos 4 h. Para determinar el contenido de ADN, las muestras se centrifugaron y se resuspendieron en DPBS que contenía yoduro de propidio (50 mg /ml de concentración final) y RNasa A (100 mg /ml de concentración final) y se analizaron por citometría de flujo.
Cell Los lisados y transferencia Western Análisis
cellswere tratada se enjuagó con DPBS y se lisaron en hielo mediante la adición de un pequeño volumen de tampón de lisis celular que contiene SDS durante 15 min. Los lisados se recogieron en tubos Eppendorf, se sonicó en hielo a cizallamiento del ADN, y se cuantificaron usando el ensayo de proteínas RC DC (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Treinta microgramos de lisado celular fue cargado en cada carril y se sometieron a SDS-PAGE y posteriormente se transfirieron a Immun-Blot membranas de fluoruro de polivinilideno (PVDF; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Brevemente, las membranas fueron bloqueadas en leche al 5% en TBST, seguido de incubación en el anticuerpo primario diluido en tampón de bloqueo apropiado a 4 ° C durante la noche.Después, las membranas se lavaron, se añadió anticuerpo secundario apropiado para 1 h a temperatura ambiente y finalmente se lava antes de formación de imágenes. Todos los anticuerpos fueron adquiridos de cualquiera de Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA) o Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA). la detección de proteínas se llevó a cabo utilizando el Super Señal West Dura sustrato quimioluminiscente (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) y se proyecta sobre ChemiDoc ™ + XRS sistema (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Para todos los datos de transferencia Western, las imágenes son borrones representativos seleccionados de al menos dos experimentos independientes.
Medición de niveles de peróxido de hidrógeno
La generación de peróxido de hidrógeno se midió utilizando un ensayo enzimático Amplex Red. Las células sembradas en placas de 96 pocillos negras de fondo claro fueron tratados durante 4 h con la concentración deseada de fármaco en fenol DMEM libre de rojo de medio suplementado con 10% FBS. Al final del tratamiento, las células se lavaron y se lisaron en tampón DPBS que contiene 50 mM Amplex Red (Molecular Probes) y 0,1 unidades /ml de peroxidasa de rábano picante (HRP; Sigma, St. Louis, MO) y se incubaron durante 30 min a 37 ° C , protegido de la luz. Después de la incubación, se detectó la intensidad de fluorescencia de cada pocillo a longitudes de onda de 540/590 EX /em.
La medición de los niveles de superóxido anión
Drogas tratados células Paca-2 y BxPC-3 MIA se tiñeron brevemente con indicador rojo MitoSOX mitocondrial superóxido (Invitrogen, Carlsbad, CA) siguiendo intensidad recommendations.Fluorescence del fabricante se midió mediante citometría de flujo como se describe anteriormente [26].
Microscopía fluorescente de TP421 localización subcelular
MIA líneas Paca-2 y células PANC-1 fueron sembradas en doble cubierta de vidrio de cámara (Nalge Nunc International, Rochester, NY) a una densidad de 50.000 células /cámara y se dejaron durante la noche para adherirse. El día siguiente, las células se trataron con 2 M TP421 por períodos de tiempo de hasta 72 h. Antes de las imágenes, las células se tiñeron durante 15 minutos a 37 ° C utilizando 200 nM Mitotracker CMXRos Roja o 50 nM LysoTracker Red DND 99 manchas de orgánulos de células vivas (Life Technologies, Grand Island, NY) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Las células vivas se visualizaron utilizando una Nikon DAIPHOT 300 microscopio invertido (Nikon Instruments, Melville, NY) equipado con DAPI y Cy3 bloques de filtros, piezas de 10x y 100x ojo /1.3 Nikon lente de inmersión en aceite y la lámpara de mercurio de muy alta presión. Para evitar photobleaching, exposición de la muestra a la luz se redujo al mínimo durante la adquisición de imágenes mediante la participación de los filtros de densidad neutra (ND2 y ND4) para limitar la intensidad de la luz que llega a la muestra. Las imágenes fueron capturadas utilizando una cámara Fotometría CoolSNAP 9 CCD (Roper Científico, Ottobrunn, Alemania) y se procesaron usando Q-Capture Pro v 5.1.1.14 software de imagen (corporación de imagen Q, Surrey, BC, Canadá).
inmunofluorescencia
la tinción de LC3B
MIA PaCa-2 células se sembraron en cubreobjetos de vidrio a una densidad de 50.000 células y se dejó durante la noche a adherirse. El día siguiente, las células se trataron con 2 TP421 mu M en presencia o ausencia de 5 rapamicina M o 10 mM de cloroquina durante 18 h. Al final del tratamiento, se retiró de los medios y las células se lavaron con 500 l DPBS antes de la fijación con 3,7% de formaldehído durante 15 m a temperatura ambiente. Las células fijadas se lavaron con 500 l DPBS antes y después de permeabilización con acetona enfriada con hielo durante 5 minutos a -20ºC. Los cubreobjetos se bloquearon durante 30 minutos con albúmina de suero bovino 1% (BSA) en DPBS antes de la incubación durante la noche a 4 ° C con anticuerpo LC3B en 1% de BSA. El anticuerpo se retiró y los cubreobjetos se lavaron en DPBS con agitación suave. anticuerpos Cy5 y Cy3-conjugado (GE Healthcare Lifesciences, Pittsburgh, PA) diluido en BSA al 1% se incubaron con cubreobjetos durante 2 h. Los cubreobjetos se lavaron de nuevo en DPBS con agitación suave, se seca al aire y se montaron en pre-limpiado slidesusing vidrio Prolong Oro anti-fade medios de montaje (Life Technologies, Grand Island, NY). Las imágenes se obtuvieron utilizando un microscopio Lieca SP2 de barrido confocal (Leica Microsystems, Heidelberg, Alemania) equipado con 488 argón nm y 633 láser de criptón nm (potencia del láser se mantuvo a un mínimo & lt; 50% del total) y el software Leica Confocal v 2.61 ( Leica Microsystems, Heidelberg, Alemania).
in vitro Ensayo de migración
la migración celular se ensayó usando insertos de cultivo celular de 24 pocillos de placas provistas de membranas de PET transparente que tiene 8 micras poros de tamaño (BD Biosciences, San Jose, CA). 7,5 × 10
4 privadas de suero MIA PaCa-2 células se sembraron en la cámara superior en medio libre de suero y se dejaron adherir durante la noche a la ligera. Al día siguiente, la migración fue estimulado con medio FBS 10% añadido a la cámara inferior. los pocillos de control negativos recibieron medio de suero 1% en lugar. TP421 muestras tratadas, recibió el 10% de medio FBS en la cámara baja y el compuesto en un medio libre de suero en la cámara superior. Después de 24 h, las células adherentes a la parte superior de la membrana fueron desechados ligera de usar un Q-tip. Las células en el lado inferior de la membrana se tiñeron con la tinción nuclear Giemsa durante 30 minutos a temperatura ambiente y se lavaron con agua desionizada. Las imágenes de las membranas teñidas fueron capturados en los campos representativos utilizando Nikon microscopio invertido usando un objetivo de 10X.
Curación de Heridas Ensayo
El cultivo de tejidos tratados placas de 96 pocillos se recubrieron con colágeno I disuelto en 0,2 N ácido acético (esterilizada por filtración) a una concentración final de 45 mg /ml, durante la noche a 4 ° C durante la noche. El siguiente día el exceso de colágeno se retiró, los pocillos se lavaron dos veces con DPBS y se bloquearon con 2 mg /ml de BSA en DPBS durante 1 h a temperatura ambiente. Después del bloqueo, los pocillos se lavaron de nuevo DPBS. células PANC-1 se siembran a continuación a una densidad de 35.000 células /pocillo en medio de suero completos y se dejaron adherir durante la noche. El medio se cambió a medio libre de suero y las células se incubaron adicionalmente durante la noche. El día siguiente, los arañazos se realizaron mediante el borde de una punta de 200 l y los pocillos se lavaron con DPBS. Tratados y los pozos de control tratados por la ONU recibieron el 10% de FBS que contiene los medios de comunicación y se añadió drogas. los pocillos de control negativos recibieron medio libre de suero. Las heridas se dejaron 24 h para cerrar al final de los cuales los pocillos se lavaron con DPBS, se fijaron las células en 100% de metanol durante 10 min y se tiñeron con tinción de Giemsa nuclear de 30 min. Finalmente, los pocillos se lavaron con agua desionizada y se revolcaban secar. Las heridas fueron imágenes con un utilizando un objetivo de 4X.
Análisis estadístico
Donde, P-valores indicados se calcularon utilizando la prueba t de Student no pareado de dos colas con varianzas desiguales. Los valores de P inferior a 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.
Resultados
TP421 Muestra citotoxicidad rápido y potente en un panel de líneas celulares de cáncer de páncreas
En nuestro informe inicial sobre la actividad anticancerígena de esta clase de compuestos que describimos su potente citotoxicidad contra las líneas celulares de cáncer de diferentes linajes [26]. Aquí en, probamos la capacidad de uno de los compuestos de plomo identificados forma nuestra pantalla inicial, TP421, para inducir la citotoxicidad e inhibir la proliferación celular en un panel de líneas celulares de cáncer de páncreas. Usando el ensayo de MTT, se evaluó el efecto de 72 h la exposición continua a dosis crecientes de TP421, TP187, TP197 y en el crecimiento de PANC-1 y células HPAC líneas MIA PaCa-2, BxPC-3,. Los resultados (Tabla 1) revelaron una potente citotoxicidad, con TP421 IC
50 valores en el rango sub-micromolar en todas las líneas celulares ensayadas con independencia de sus diferencias en el estado de diferenciación o de fondo de mutación genética. Estructuras de los compuestos ensayados se muestran en la figura de soporte (Figura S1). El resto de TPP en este compuesto es esencial para la actividad como 7-dietilamino-4-metil-cumarina, un análogo estructuralmente idéntico de TP421 que carece del resto de TPP, no produjo citotoxicidad en las líneas celulares ensayadas. Además, examinó el efecto de la exposición 24 h a TP421 en la formación de colonias capacidad de las células MIA PaCa-2 en comparación con gemcitabina y erlotinib (Figura 1). Los resultados confirmaron la capacidad de TP421 para inhibir la proliferación de células
in vitro
a niveles comparables con gemcitabina y mucho más potente que erlotinib. Para caracterizar adicionalmente las actividades citotóxicas de TP421, se incubaron células en presencia o ausencia de un intervalo de concentraciones de TP421 para 0,25, 0,5, 1 o 5 h, seguido de incubación en medio libre de fármaco durante 24, 48 y 72 h. En paralelo, se trataron las células con una exposición continua a TP421 para el 24, 48 y 72 h. Al final de las incubaciones se evaluó la viabilidad celular a través de MTT. Como era de esperar, la IC
50 de TP421 tenían una correlación inversa con el tiempo de tratamiento, así como la duración total del tiempo de incubación, como se muestra en la Tabla 2. Sin embargo Inesperadamente, se observó que con tiempos de exposición muy cortos, lo más corto 15 min, TP421 fue capaz de alcanzar 50% de citotoxicidad aunque a concentraciones más altas (20 mM) que indica un efecto del fármaco inicial muy rápida. Curiosamente, se encontró que para PANC-1 en las células tratadas de esta manera, los tiempos de exposición más cortos fármaco reduce en gran medida la citotoxicidad de TP421. Las curvas de supervivencia comparando los tiempos de continuos y 0,25 h de exposición en las tres líneas celulares se muestran en la Figura 2.
Efecto de 24 h la exposición al fármaco en colonia capacidad de (A) MIA PaCa-2 y (B) de formación de BxPC -3. Las imágenes son representativos de tres experimentos independientes.
dosis curvas de supervivencia de respuesta para las líneas celulares tratados con TP421 comparando la exposición continua (cuadrados cerrados) a 0,25 h la exposición al fármaco seguido de un medio de lavado hacia fuera (cuadrados abiertos) y incubación adicional. El tiempo total de incubación se indica entre paréntesis. Los datos son la media ± SD de tres experimentos independientes. las concentraciones de TP421 se representan en una base de registro 10 escala.
TP421 citotoxicidad es selectiva hacia las células del cáncer
Tras el supuesto de que TP421 se acumularía selectivamente en las células cancerosas impulsado por el mayor potencial de membrana, se comparó el efecto de TP421 en las características de crecimiento de la línea celular de fibroblastos normales HFF-1 contra tres de las líneas celulares de cáncer de páncreas. El tratamiento de PaCa-2 y HFF-1 en las células MIA con un rango de dosis de TP421 durante 72 h revelaron claramente mayor sensibilidad de la línea celular de cáncer de páncreas hacia el fármaco (Figura 3A). Esto se confirmó adicionalmente mediante la medición del porcentaje de células muertas acumuladas por tratamiento TP421 que fue significativamente mayor en las células de cáncer de páncreas en comparación con HFF-1 (Figura 3B). Además, utilizando el colorante indicador azul de Alamar, se observó una diferencia de 4 veces en la inhibición de la proliferación de las células MIA PaCa-2 en comparación con células HFF-1 siguiente 72 h período de incubación con TP421 a las dosis indicadas. (Figura 3C).
(A) El crecimiento de las células normales HFF-1 no se ve afectada, mientras que el cáncer de páncreas MIA Paca-2 células muestran una extensa muerte después de 72 h de exposición a dosis crecientes de TP421. (B) TP421 induce una mayor muerte celular en tres líneas celulares de cáncer pancreático en comparación con células HFF-1, medida por exclusión de azul de tripano. (C) Proliferación de MIA PaCa-2 pero no HFF-1 se inhibe en gran medida por TP421 en el ensayo de azul alamar. Tres experimentos independientes se llevaron a cabo, imágenes representativas se muestran en (A), media ± SD se representan en (B) y (C). *, **, *** Y **** indicar valor de p & lt; 0,05, p & lt; 0,01, p & lt; 0,001 y P & lt; 0,00005, respectivamente.
TP421 líneas celulares de cáncer pancreático en detenciones G
0 /G
1 fase del ciclo celular en un tiempo y dependiente de la dosis Forma
con el fin de dilucidar el mecanismo por el cual TP421 inhibe la proliferación celular, se evaluó su efecto sobre el ciclo celular cinética. MIA PaCa-2 (Figura 4), PANC-1, BxPC-3, HPAC y (3) Tabla células se trataron con dos concentraciones de TP421 para aumentar la duración de tiempo y contenido de ADN se analizó mediante citometría de flujo. Se observó extensa G
0 /G
1 arresto en todas las líneas celulares a pesar de las pequeñas diferencias en su sensibilidad a TP421. Curiosamente, la distribución del ciclo celular para las células MIA PaCa-2 tratados con los otros dos análogos, TP187 y TP197, TP421 también parecía con detención significativa y temprano en G
0 /G
1 (Tabla 3). Este resultado difiere de la G
2 /M y la detención de la fase S inducida por estos compuestos en líneas celulares de cáncer no pancreáticas [26], lo que indica un efecto específico potencial de tipo tumor.
El efecto de tratamiento TP421 en la distribución del ciclo celular de las células MIA Paca-2 fue examinado en una dosis y tiempo-dependiente. Las células se dejaron sin tratar o se trataron con 0,1 y 1 M TP421 para 24, 48 y 72 h. Histogramas representados son representativos de tres experimentos independientes.
TP421 se localiza en estructuras mitocondriales con retención sostenido a través del tiempo
TP421 pertenece a una clase de compuestos que contienen un catión TPP conocido a acumular en la mitocondria [27]. Con el fin de confirmar la localización mitocondrial, las células PANC-1 se trataron con 2 M TP421 durante diversos períodos de tiempo. Inmediatamente antes de exponer, las células fueron co-teñidas con colorante 200 nM MitoTracker Red para etiquetar las mitocondrias. Hemos observado significativa co-localización que persiste durante hasta 72 h (Figura 5A) que indica que TP421 de hecho acumula en la mitocondria y se mantuvo durante un período prolongado de tiempo. Como verificación secundaria de localización mitocondrial hemos tratado de determinar el papel del potencial de membrana mitocondrial en la acumulación de TP421 en las células. Utilizando el ionóforo de cianuro de carbonilo-4- (trifluorometoxi) fenilhidrazona (FCCP), comúnmente utilizado para disipar el potencial de membrana mitocondrial, se analizó el patrón de fluorescencia TP421. Pretratados células PANC-1 por 30 min con 10 M FCCP seguido de una incubación de 15 min con TP421. las células de control no recibieron FCCP y se expusieron a 15 min solamente TP421. En presencia de FCCP, se observó una fluorescencia difusa TP421 claramente (Figura 5B), que no se parecía a la de localización mitocondrial que confirma que en condiciones normales TP421 acumula dentro de las mitocondrias impulsada por el potencial transmembrana. Ya que habíamos observado que el 7-dietilamino-4-metil-cumarina no fue citotóxica para las células, hemos explorado aún más la relación entre la localización mitocondrial y la citotoxicidad TP421. Pretratados células MIA PaCa-2 durante 30 minutos con 10 mM FCCP luego añadió TP421 para un 30 min adicionales. Al final de la duración del tratamiento, se lavaron las células y se sustituyó el medio para eliminar el exceso de fármaco y se incubaron las células durante 24, 48 y 72 h y la viabilidad celular medida. En presencia de FCCP las células estaban protegidas significativamente de TP421 citotoxicidad (Figura 5C), indicando que la localización a la mitocondria fue directamente responsable de la acción de nuestra droga.
células (A) Panc-1 tratados con TP421 y se tiñeron con MitoTracker Red (MTR) revelar extensa co-localización de TP421 y colorante marcador mitocondrial. las células (B) Panc-1 pretratadas con FCCP muestran la localización TP421 no mitocondrial. (C) la citotoxicidad reducida de TP421 en PaCa-2 células MIA pretratados con FCCP se ve en 24, 48 y 72 h. Los datos son la media ± SD de tres experimentos independientes. * Indica p. & Lt; 0,01
TP421 tratamiento induce mitocondrial y citosólica de acumulación de especies reactivas del oxígeno
TP421 disminuye la capacidad respiratoria mitocondrial y aumenta la superóxido (O
2
- ) acumulación de [26]. Sin embargo, en comparación con O
2
-, peróxido de hidrógeno (H
2O
2) es un ROS relativamente más estables y de membrana permeable que pueden causar los lípidos, las proteínas y el daño del ADN y participa en de transducción de señales [29]. Por lo tanto, hemos examinado el nivel de H
2O
2 en células de cáncer de páncreas después del tratamiento TP421. MIA PaCa-2 y células BxPC-3 fueron tratados con dosis crecientes de TP421 para 4 horas seguido de una breve incubación con 50 mM Amplex Red en presencia de 0,1 unidades /ml de HRP. En presencia de HRP, reactivo Amplex Red reacciona con H
2O
2 en una estequiometría 01:01 para producir resorufina altamente fluorescente. La intensidad de fluorescencia resultante se midió a longitudes de onda de excitación y emisión de 540 nm y 590 nm, respectivamente. Como era de esperar, el tratamiento resultó en un aumento de 2,5 veces en H
2O
2 niveles en BxPC-3 en la mayor concentración de TP421 con una buena correlación entre H
2O
2 niveles y dosis de TP421 utiliza (Figura 6A). Por otro lado, un aumento similar de la fluorescencia no se pudo detectar en MIA PaCa-2 células (datos no presentados). Para determinar si la falta de H
2O
2 acumulación de estas células se debió a la ausencia de O
2
- generación, se utilizó un ensayo de rojo MitoSOX [26] para medir el nivel de mitocondrial O
2
- en MIA Paca-2 y lo comparó con BxPC-3. Ambas líneas de células tratadas con dosis crecientes de TP421 durante 4 h exhibieron 3-5 veces mayor en O
2
- nivel (Figura 6B) y esos niveles se mantuvo alta a las 24 h (datos no mostrados). Esto sugiere que la falta de H
2O
2 acumulación observada en las células MIA Paca-2 no fue debido a la deficiente O
2
-producción en estas células.
El efecto del tratamiento TP421 sobre los niveles de (a) H
2O
2 y (B) mitocondrial O
2
- en Paca-2 células BxPC-3 y MIA se midieron utilizando las sondas fluorescentes Amplex Red y MitoSOX Red, respectivamente. (C) efecto del pretratamiento antioxidante sobre la citotoxicidad de TP421 en las células PANC-1. *, ** Y *** indican p & lt; 0,05, p & lt; 0,005 y p. & Lt; 0,001, respectivamente
A medida excesiva de ROS se sabe para llevar a la muerte celular, se analizó el potencial papel protector de un antioxidante. células PANC-1 se trataron previamente con 15 mM
N
cisteína acetil-L- (NAC) durante 2 h antes de la adición de TP421. Después de una incubación de 24 h en la medida de la citotoxicidad se determinó mediante MTT. pretratamiento antioxidante podría proteger las células de la citotoxicidad inducida TP421 hasta en un 35% (Figura 6C) y no se observaron resultados similares en células MIA Paca-2 y BxPC-3 (datos no mostrados).
TP421 Tratamiento Activa Estrés- Rutas inducida
Dada la fuerte acumulación de ROS después del tratamiento TP421, la hipótesis de que, estrés celular JNK, p38 y ERK, se activará [30], [31], [32]. MIA PaCa-2 y células BxPC-3 fueron tratados con dosis crecientes de TP421 para 4 h o con 5 M durante 1-8 h y la quinasa de activación se evaluó mediante transferencia Western.