Extracto
inducible por hipoxia factor (HIF) vía de señalización es importante para las células tumorales con suministros limitados de oxígeno, según se demuestra estar involucrado en el proceso de proliferación y la angiogénesis. Dado su papel fundamental en la biología del cáncer, ensayos robustos para el seguimiento de cambios en la expresión de HIF son necesarios para la comprensión de su regulación en cáncer, así como el desarrollo de terapias que se dirigen a la señalización de HIF. Aquí mostramos una novela constructo indicador HIF que contiene repeticiones en tándem de sitios de unión a HIF mínimos aguas arriba de la secuencia codificante de eYFP. Se demuestra que la construcción indicadora tiene una excelente relación de señal a fondo y la actividad del indicador depende HIF y directamente se correlaciona con los niveles de proteína HIF. Mediante la utilización de este nuevo constructo, que ensayaron los niveles de actividad de HIF en diferentes líneas celulares de cáncer cultivadas en diversos grados de hipoxia. Este análisis revela una línea celular de cáncer variación específica sorprendente de la actividad de HIF en el mismo nivel de la hipoxia. Además, muestran que en dos líneas celulares de cáncer de cuello uterino, ME180 y HeLa, los diferentes niveles de actividad de HIF observados se correlacionan con los niveles de Hsp90, un cofactor que protege contra la degradación de HIF-BVS independiente. Este nuevo constructo indicador HIF sirve como una herramienta para definir rápidamente los niveles de actividad de HIF y por lo tanto la capacidad terapéutica de potenciales represores HIF en distintos tipos de cáncer
Visto:. Zhou W, Dosey TL, Biechele T, Luna RT, Horwitz EM , Ruohola H-Baker (2011) Evaluación de niveles del factor inducible por hipoxia en líneas celulares de cáncer que son hipóxico inducción el uso de un constructo indicador de la novela. PLoS ONE 6 (11): e27460. doi: 10.1371 /journal.pone.0027460
Editor: Gangjian Qin, Northwestern University, Estados Unidos de América
Recibido: May 4, 2011; Aceptado: 17 de octubre de 2011; Publicado: 23 Noviembre 2011
Derechos de Autor © 2011 Zhou et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por R01GM083867-01, R01GM097372-01, y 1P01GM081619 del Instituto Nacional de Ciencias médicas generales y un proyecto de Programa de Investigación del cáncer de mama piloto subvención a la HR-B. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
La hipoxia es bien conocido para regular fundamentalmente muchos aspectos de la biología celular. La mayoría de los efectos de la hipoxia implican el factor inducible de hipoxia (HIF), una regulada oxígeno factor de transcripción heterodimérico altamente conservada y crucial compuesta de una alfa (α) y una subunidad beta (β). Ambas subunidades pertenecen al grupo PER-ARNT-SIM (PAS) en hélice-bucle-hélice básico (bHLH) de la familia de factores de transcripción [1]. Dos genes que codifican subunidades HIFa de mamíferos (HIF1α, HIF2α) están bien estudiados: HIF1α se expresa de forma ubicua mientras que la distribución tisular más restringido HIF2α exhibición [2]. En normoxia, HIFa sufre hidroxilación prolil y se une a una ubiquitina ligasa E3-, la proteína de von Hippel-Lindau (VHL), que conduce a polyubiquitination y rápida degradación proteosomal de HIFa [3], [4]. Bajo hipoxia, HIFa hidroxilación se inhibe, lo que resulta en la acumulación de HIFa y la formación de heterodímeros HIFa-HIFß. Los heterodímeros más complejos con los coactivadores p300, y se unen a los promotores de los genes diana HIF para inducir la expresión de genes [5]. Además de la hipoxia, muchas otras vías pueden afectar a la estabilización de HIF [6], [7]. Cofactores, como FAP P300 /CBP factor asociado [8] y hsp90 [9], [10], también ayudan a facilitar la estabilización de HIF y potenciar la actividad de HIF. Hsp90 ha demostrado que protege contra la degradación HIFa BVS-independiente que puede ocurrir en la hipoxia [11].
El HIF bien estudiado genes diana incluyen aquellos que están involucrados en la entrega de oxígeno y la proliferación celular, como el crecimiento del endotelio vascular los factores (
VEGF
) [12], [13] y
p21
[14]. Además, HIF facilita la adaptación a la privación de oxígeno mediante la regulación de genes implicados en la captación de glucosa y el metabolismo, tales como la anhidrasa carbónica (
CA9
) [15], que mantiene el pH celular
i homeostasis en condiciones de hipoxia. Recientemente se ha informado que HIF y su gen diana,
Oct4
, son responsables de la hipoxia inducida fenotipo de células madre del cáncer que se piensa para conducir la progresión y la agresividad en ciertos tumores [16]. efectos beneficiosos dado su papel fundamental en la angiogénesis y la progresión tumoral, HIF es una diana terapéutica atractiva y el bloqueo de HIF, especialmente cuando se combina con las terapias convencionales, se ha demostrado [17], [18].
Para examinar los HIF 'temporal y la expresión espacial en los tejidos, varios sistemas indicadores directos e indirectos son desarrollados con el fin de realizar un seguimiento de expresión de la proteína HIF
in vivo
. De cualquier longitud completa HIF ADNc o un fragmento bajo la regulación dependiente de oxígeno se ha relacionado con la proteína fluorescente [19], o luciferasa de luciérnaga [20] para la construcción de proteínas de HIF-fusión. Por otra parte, dado que los estudios de proteínas de fusión HIF no revelan si complejo HIF es transcripcionalmente activo, en base a la prensa promotoras también se han desarrollado. Típicamente, 5-8 repeticiones de los elementos de respuesta a la hipoxia (HREs) (5'-GCCCTACGTGCTGTCTCACACAGC-3 ') de la región 3' potenciador del gen Epo humano, o el HRE de VEGF (5'-CACAGTGCATACGTGGGCTCCAACAGGTCCTCT-3 ') están vinculados en tándem con un promotor mínimo para conducir la expresión de un gen indicador corriente abajo [21], [22]. Cabe señalar que en estos constructos, HRE contiene no sólo el HIF-1α o sitios de unión consenso HIF2α (5'-CGTG-3 'y 5'-TRCGTG-3', respectivamente), pero también
Epo
o
VEGF
secuencias específicas promotor. Recientemente
Oct4
ha demostrado ser inducida por HIF en condiciones de hipoxia [16], sin embargo,
Oct4
promotor contiene sólo tres repeticiones de la CGTG, el sitio de unión a HIF real, pero no las secuencias HRE observado ya sea en
Epo
o
VEGF
promotor.
con el fin de maximizar la especificidad y sensibilidad de la construcción de reporte, la estrategia de utilizar el factor de transcripción más primitivo sitio de unión en tándem en un reportero ha sido utilizado con éxito anteriormente en el caso de análisis de Wnt-vía [23], [24]. En el presente estudio, se utilizó una estrategia similar para construir un indicador basado promotor, que incorporen únicamente la HIF1α mínima y HIF2α sitios de unión de juntas (CGTGTACGTG) en tándem en el promotor. Se demuestra que este nuevo reportero de HIF con HIF repeticiones de unión (HBR) tiene una buena relación señal a fondo la dinámica y de la señal de desoxigenación y reoxigenación. También demostramos que la señal es dependiente de HIF según lo revelado por estudios de HIF RNAi, y se correlaciona con el nivel de proteína HIF celular en diferentes líneas celulares. Mediante la utilización de nuestro nuevo constructo, se muestra que los niveles de actividad de HIF varían significativamente en diferentes líneas celulares de cáncer cultivadas en el mismo grado de hipoxia. Nos revelan, además, que en dos líneas celulares de cáncer de cuello uterino, las diferencias en los niveles de actividad de HIF se correlacionan con el nivel del cofactor HIF, Hsp90, que protege contra la degradación de HIF-BVS independiente.
Resultados
Hemos construido un plásmido lentiviral, en la que la expresión de la mayor proteína fluorescente amarilla (eYFP) estaba bajo la regulación de doce repeticiones en tándem de sitios de unión mínima de HIF-(CGTGTACGTG), seguido de un mínimo de timidina quinasa humana (TK), el promotor (12U- HBR). Además, un 770 bps de secuencias de intrones beta-globina fue incorporado entre el promotor TK y eYFP para una mejor transcripción de eYFP (Figura 1a, la Figura S1). Para ensayar la función del constructo
in vitro
, transduced el virus en células HeLa y las cultivadas en cualquiera de normoxia (20% O
2) o hipoxia (2% O
2) condiciones. Después de 24 horas, se observó que las células en condiciones de hipoxia expresaron uniformemente eYFP (~ 70% de eYFP positivo), mientras que los menores normoxia sólo ganó fluorescencia con una intensidad muy reducida (~ 6% de eYFP positiva, la Figura 1b y la Figura S2).
3, 6 o 12 unidades en tándem de repeticiones de unión a HIF (3U, 6U o 12U-HBR) y una mínima promotor TK ambas regulan la expresión eYFP. b-c) Optimización del número de repeticiones de unión a HIF. b) las células HeLa 6U-HBR se convierten en eYFP en el 2%, pero no en el 20% de oxígeno. La misma cantidad de células (5 × 10
4) se chapada en ambas placas de cultivo y microscopía y análisis FACS se realizaron después de 2 días; c) la relación de señal a fondo se representa mediante el análisis FACS. Las células HeLa se transdujeron con partículas reportero lentiviral HIF-HBR durante 24 horas y después se cultivan bajo normoxia (20% de O2) o hipoxia (2% de O2) durante 48 horas antes del análisis FACS. Relaciones son de medias geométricas de la intensidad eYFP en un 2% a un 20% de oxígeno.
Para optimizar aún más la relación señal a fondo, hemos reducido el número de sitios de unión de HIF-, creando de este modo con HIF-reporteros 3 sitios de unión en tándem (3U-HBR) o con 6 sitios (6U-HBR) (Figura 1a). Al analizar en las células HeLa, se observó que el constructo 6U-HBR logra una mejor relación señal-fondo de 3U-HBR y construcciones 12U-HBR (33.4, 5.8 y 15.1, respectivamente. Figura 1c). Para comparar la especificidad y la sensibilidad a otros reporteros hipoxia, obtuvimos específicamente una de las reportero HIF ampliamente utilizado 5HRE_hCMV_Luc [25]. Después transitoria transfectadas reportero 5HRE_hCMV_luc en células HeLa, se observó 50-100 veces mayor actividad luciferasa bajo 2% O
2 en comparación con células que crecen en 20% O
2, lo que era consistente con el hallazgo inicial. En comparación, nuestro reportero HBR_eYFP muestra alrededor de 30-40 veces mayor en 2% de O
2, un incremento que cae en una escala similar a la observada con el reportero 5HRE_hCMV_luc. Con la similitud en la intensidad de la señal, sin embargo, las dos construcciones de reportero HIF no son directamente comparables, ya que tienen secuencias distintas de cadena principal, diferentes promotores mínimos y genes informadores, todos los cuales ellos podrían hacer comportamiento distinto y dinámica en condiciones de hipoxia. En este estudio, 6U-HBR fue utilizado para una mayor optimización y caracterización.
A continuación se caracteriza la dinámica de la construcción en el proceso de desoxigenación y reoxigenación. Cuando transferido de normoxia a la hipoxia (2%), las células 6U-HBR-HeLa tenían respuesta rápida (figura 2a); sin embargo, cuando se transfiere de nuevo a la hipoxia normoxia, la intensidad de fluorescencia disminuyó lentamente (72 horas para alcanzar el nivel basal; la Figura 2b). Para una construcción con una mejor capacidad de reflejar oportuna la facturación de HIF, modificamos eYFP y generó una versión desestabilizada uniendo ratón ornitina descarboxilasa 422-461 de dominio, una región responsable de la rápida degradación de la proteína [26], a la C-terminal de eYFP, por lo tanto, la creación de la construcción de desestabilizado-6U-HBR (6UD-HBR). Hemos observado que 6UD-HBR tenía una fluorescencia reducida, sino una dinámica similar como se ve con 6U-HBR (Figura 2a). Cuando se transfiere de nuevo a la normoxia, la señal fluorescente de células 6UD-HBR mostró una reducción dramática de alcanzar el nivel más bajo en 10 horas. Sobre la base de estas observaciones, 6U-HBR es más sensible en la detección de cambios en el proceso de desoxigenación mientras 6UD-HBR refleja mejor los cambios en el proceso de reoxigenación.
5 × 10
4 células se sembraron en 35 placas mm y después se cultiva en cualquiera de normoxia (20% o
2) o hipoxia (2% de o
2). En diferentes puntos de tiempo, se recogieron las células y se fijaron para el análisis FACS. La media y las barras de error son de tres repeticiones biológicos.
Para confirmar HIF-dependencia del reportero, hemos realizado experimentos de RNAi dirigidas a HIF en condiciones de hipoxia. Cuando derribando tres HIF (HIF1α, HIF1β y HIF2α), las células 6U-HBR-HeLa en condiciones de hipoxia habían fluorescencia, cerca del nivel visto bajo normoxia (Figura 3a-f, aproximadamente el mismo número de células observadas en a-d) reduce considerablemente . Además, hemos demostrado que la sobre expresión de HIF1α no degradable o HIF2α sola era suficiente para activar la expresión de la construcción (Figura 4a y 4b). Para probar si la señal inducida por la sobreexpresión HIFa (OE) fue causada directamente por la actividad canónica de HIFa, introdujimos RNAi contra el cofactor esencial de HIFa, HIF1β, en las células HIFa OE. Hemos demostrado que cuando se transfectan con HIF1β RNAi, la intensidad eYFP inducida por HIFa OE se redujo considerablemente (Figura 4b-d). Es de destacar que en los experimentos de ARNi realizadas en una plataforma de alto rendimiento, las células mostraron intensidad equivalente a través de los pozos en el mismo grupo de tratamiento (Figura 4b-d). Estos experimentos demuestran la aplicabilidad y la sensibilidad de la construcción 6U-HBR en una plataforma de alto rendimiento. La sensibilidad de la construcción tanto HIF1α y HIF2α fue confirmado por los resultados cuando derribando HIFa o HIF individuo con diversas combinaciones en las células HeLa (Figura S3). En total, se muestra que el reportero está detectando directamente HIF señalización en las células.
células HeLa transfectadas con siRNAs contra tres HIF (HIF1α, HIF1β y HIF2α) HBR-6U son eYFP negativo en condiciones de hipoxia, demostrada por microscopía (panel superior a-d) y los resultados de FACS (panel inferior e y F). La misma cantidad de células (5 × 10
4) se sembraron en placas de cultivo y microscopía y análisis FACS se realizaron después de 2 días después de la transfección de siRNA.
a) construcción de 6U-HBR en el A549 es activada, ya sea con o ndHIF1α ndHIF2α, pero no con la construcción de vector vacío. b-d) HIF1β siRNA solo reduce en gran medida señales fluorescentes inducidas por ndHIF1α /ndHF2α la sobre expresión (ndHIFα OE) en células HeLa, que indica que las señales de EYFP son reversibles mediante la manipulación de los niveles de factores de HIF. Ambos se muestran imágenes de microscopía (b) y cuantificación fluorescente (C y D).
En la embriogénesis y el desarrollo de los mamíferos, los tejidos se desarrollan en un microenviroment con varios niveles de oxígeno. Se ha demostrado que la hipoxia, por un lado, es esencial para la formación del corazón [27], [28], [29] y la formación de hueso endochondrial [30], [31], [32], [33]; sin embargo, por otro lado, se deteriora el tejido adiposo desarrollo [34], [35] y miofibroblastos piel diferenciación [36]. Dado el papel crítico de HIF señalización en la hipoxia, una cuestión fundamental es si las células obtienen respuestas específicas de tejido a su entorno bajo en oxígeno mediante la regulación diferencial de la vía HIF. Para determinar cómo las células de diferentes orígenes tisulares responden a la hipoxia en términos de niveles y actividades de HIF, examinamos 5 líneas celulares de carcinomas 6U-HBR, a saber, 786 + BVS de adenocarcinoma de células renales, A549 de carcinoma de pulmón, ME180 de un carcinoma epidermoide de cuello uterino , U251 de glioma, y HeLa de adenocarcinoma cervical. Las células se incubaron en diferentes niveles de oxígeno (20%, 5%, 3%, 2%, 1% o 0,3%) durante 4 días, y la fluorescencia media 6U-HBR se determinó mediante análisis FACS. habría sido de esperar que estas células comportan de manera similar en condiciones de hipoxia debido a el hecho de que se han adaptado a condiciones de cultivo; Sin embargo, se observó que respondieron claramente, con el mismo grado de oxígeno. Por ejemplo, ME180 y HeLa ambos tenían poca respuesta a 3% de oxígeno, sin embargo, cuando el nivel de oxígeno estaba por debajo de 3%, ME180 exhibido aumento dramático de la señal, mientras que HeLa tenía relativamente bajo aumento (Figura 5). Por otra parte, la señal de U251 aumentó lentamente al 5% y 3% de oxígeno, más dramáticamente en 2% y 1% de oxígeno, y distintamente continuó aumentando incluso en 0,3% de oxígeno (Figura 5).
cinco líneas celulares de cáncer infectados con 6U-HBR lentivirus se cultivaron bajo diversos grados de hipoxia, incluyendo 20%, 5%, 3%, 2%, 1% y 0,3% de O
2. Sus intensidades EYFP se determinaron después de 4 días de cultivo mediante análisis de FACS. Los grados de hipoxia se presentan como registro de la relación O
2 nivel con la normoxia (20% O
2).
Además, verificó que las señales 6U-HBR en estas líneas celulares correlacionados con los niveles de proteína HIF intracelulares. Dado que el entorno de oxígeno 1% exhibió la mayor diferencia en las señales de 6U-HBR entre las células ME180, U251 y HeLa, se utilizó este nivel de oxígeno para ensayar HIF mRNA y proteína. Mientras que los niveles de ARNm de HIF1α fueron similares entre estas líneas celulares, los niveles de ARNm variaban HIF2α (Figura S4), que estaba de acuerdo con un estudio anterior [2]. Para el nivel de proteínas, que primero demostró que cuatro horas en la hipoxia inducida más altos niveles de proteína en HIF1α ME180, U251 y A549 que en HeLa y 786-O + VHL (Figura 6a-b). Puesto que se ha informado anteriormente que en la hipoxia prolongada, la proteína HIF1α degrada mientras HIF2α exhibe un cambio mínimo [37], la hipótesis de que no sólo el total de los niveles de proteína HIF sino también la dinámica de estabilización de las proteínas son responsables de diferentes actividades reportero 6U-HBR en estas líneas celulares. Por lo tanto, se analizaron las diferencias en la cinética de degradación de proteínas HIFa en todas las líneas celulares de cáncer de cinco en el 1% de oxígeno. Este análisis reveló que HIF1α en células HeLa es menos estable durante la hipoxia prolongada que en cualquier otro tipo de células analizadas (Figura 6C y D). Al comparar los niveles HIF2α en el 1% en comparación con la hipoxia normaxia, la diferencia entre estas cinco líneas celulares se ve disminuida en términos de niveles de proteínas totales y patrones de degradación (Figura S5). Sin embargo, mientras que no se observó proteína HIF1α en células 786-O + BVS, proteína HIF2α fue inducida en la hipoxia en estas líneas celulares, explaning la capacidad de respuesta de esta línea celular con el reportero 6U-HBR (Figura S5; Figura 5). En conjunto, los datos muestran que los niveles más altos de proteínas HIFa más estables se observan en ME180, A549 y U251 en comparación con las células HeLa y 786-S + BVS, apoyando las conclusiones reveladas por el reportero 6U-HBR que estas cinco líneas celulares muestran actividades HIF distintas en el mismo grado de hipoxia.
a) HIF1α en ME180, U251, A549, HeLa y células 786-S + BVS menos del 1% de O
2 durante 4 horas. b) La cuantificación de la proteína HIF1α se muestra en a). La cuantificación se realizó en las imágenes escaneadas de película obtenidos de transferencias Western separadas. c) los niveles HIF1α y d) la cuantificación en ME180, U251, A549, HeLa y células 786-S + BVS por debajo del 1% de O
2 en tres momentos: 4 horas, 12 horas y 48 horas, en comparación con los niveles menores 20% de O
2 como controles.
Hemos elegido HeLa y ME180 para su estudio, ya que son las dos líneas celulares de cáncer de cuello uterino que muestran respuestas muy distintas a la hipoxia. Con el fin de comprender la regulación de HIFa en estas dos líneas celulares de cáncer de cuello uterino, se analizaron los datos de microarrays de ARNm realizados con anterioridad en estas líneas celulares en un 2% la hipoxia [38]. Curiosamente, hemos identificado ARNm hsp90 expresados diferencialmente entre células HeLa y ME180. Nos primera validado este hallazgo por análisis de PCR en tiempo real y mostró que ME180 tiene niveles más altos de hsp90 tanto en normoxia e hipoxia (Figura 7). Para determinar si los niveles más altos de hsp90 en ME180 podría ser causal de una mayor actividad de HIF, hemos reducido la unión a HIF1α en ME180 hsp90 mediante la incubación de las células con el 17-alilamino-demethoxygeldamycin (17-AAG) en 2% las condiciones de hipoxia. 17-AAG inhibe la unión de ATP a hsp90, evitando de este modo la interacción de hsp90 y su proteína diana [39]. Puesto que se muestra la interacción hsp90 con HIF1α para aumentar la estabilidad HIF1 en la hipoxia [11], 17-AAG debería reducir la actividad de HIF1 dependiente hsp90. En consecuencia, 6U-HBR ME180 incubó con 17-AAG mostraron niveles más bajos de actividad de reportero 6U-HBR que las observadas en los controles (Figura 8a). Además, la expresión de ARNm de HIF1α CA9 gen diana se redujo significativamente (Figura 8b), lo que sugiere que la actividad de HIF se redujo en ME180 cuando hsp90 se vuelve inactivo. Estos datos apoyan la hipótesis de que la diferencia en los niveles de HSP90 es causal para la diferencia en la actividad de HIF observado en las dos líneas celulares de cáncer de cuello uterino. Se excluyeron la posibilidad de reducción de las actividades de HIF causados por la regulación transcripcional general en las células mostrando la expresión estable de otro gen endógeno de limpieza en ambos tipos de células (WYHAZ, la figura 8c).
Las células se incubaron ya sea bajo 1% hipoxia o 20% normoxia durante 48 horas antes de la cuantificación del nivel de ARNm hsp90 por PCR en tiempo real. Las barras de error se presentan como error de muestreo de la media (SEM) de tres experimentos biológicos independientes.
resultados de tres experimentos independientes se resumen y las barras de error se presentan como error de muestreo de la media (SEM ). a) intensidades de fluorescencia de HeLa en DMSO, ME180 en DMSO y ME180 en 100 nM 17-AAG en 2% hipoxia se normalizan a la de 20% normoxia. b) las veces los cambios de los niveles de ARNm normalizados CA9 a 20% normoxia en esas células sugieren que la diferencia, en términos de la actividad de HIF, se reduce en presencia de 17-AAG. c) La expresión estable de otro gen de mantenimiento, tirosina 3-monooxigenasa /triptófano 5-monooxigenasa activación de la proteína, polipéptido zeta (YWHAZ), demuestra la actividad transcripcional generalmente normales en las células tratadas ya sea con DMSO o 17-AAG.
Discusión
Aquí creamos y caracterizar un nuevo constructo indicador HIF, en el que la expresión está regulada por eYFP repeticiones en tándem de HIF1α mínima y sitios de unión HIF2α. Mediante el empleo de células que están infectadas con lentivirus de la construcción de HIF-HBR, mostramos que las células con 6 repeticiones en tándem como el promotor de la construcción (6U-HBR) dar una mejor relación señal a fondo que los que tienen 3 o 12 repeticiones. También, en términos de cinética de reportero, el constructo de 6U-HBR logra una señal más fuerte en el proceso de desoxigenación, mientras que las células con la construcción-HBR desestabilizado-6U reflejan más exactamente la reducción de los niveles de HIF en el proceso de la reoxigenación. Por otra parte, a través de estudios de siRNA contra HIF1α, HIF2α y HIF1β, así como estudios sobre expresión de ndHIF1α y ndHIF2α, se demuestra que el constructo es HIF específica y es capaz de responder a tanto HIF1α y HIF2α. Utilizando 5 líneas celulares de cáncer diferentes infectadas con el constructo 6U-HBR, se observa que las diferentes líneas celulares de cáncer tienen señales EYFP distintos en las mismas los niveles de oxígeno, que se correlacionan con la cantidad total de α HIF1 y proteínas HIF2 alfa en estas líneas celulares.
Hemos utilizado el reportero para explorar diferencia en la respuesta hipóxica de líneas celulares de cáncer cervical HeLa y ME180. Hemos observado que estas dos líneas celulares de cáncer tienen señales 6U-HBR distintas que se correlacionan con la cantidad de proteínas HIFa en respuesta al mismo nivel de la hipoxia. Del mismo modo, los diferentes comportamientos entre HeLa y ME180 en condiciones de hipoxia se observan también en la expresión del factor de crecimiento angiogénico [40], [41], así como en proteasoma, la histona deacetilasa [42] y la acción Hsp90 [43]. Entre ellos, Hsp90 es de particular interés. De acuerdo con el análisis anterior [43], se muestra que ME180 tiene mayores niveles de Hsp90 mRNA que HeLa tanto bajo normoxia e hipoxia. nivel basal Superior de HIF cofactor Hsp90 en ME180 podría contribuir a la actividad de HIF más alto observado, desde hsp90 unión a HIF ha informado para proteger contra la degradación HIFa BVS-independiente [9], [11]. Los bajos niveles de oxígeno inactivan la degradación dependiente PHD /BVS de HIF, lo que resulta en el factor de transcripción HIF estabilizado y activa. Sin embargo, HIFa finalmente se degrada en condiciones de hipoxia. Esta degradación BVS-independiente de HIF1α ha demostrado ser dependiente de RACK1 [11]. Hsp90 compite con la unión a HIF1α RACK1, protegiendo así contra la degradación HIF1α hipóxica. En este estudio, mostramos que las células ME180 tienen mayores niveles de Hsp90 y proteínas HIFa más estables en comparación con las células HeLa (Figura 6). Además, muestran que la reducción de hsp90 en ME180 disminuye la diferencia de nivel y la actividad de HIF en comparación con HeLa. Estos datos sugieren que los diferentes niveles de Hsp90 podrían ser causal para los diferentes niveles de actividad HIF observados en las dos líneas celulares de cáncer de cuello uterino bajo el mismo nivel de la hipoxia. Será interesante para probar en el futuro si el oxígeno /PDH /degradación HIFa BVS-independiente es, en general, el regulador clave de las diferencias de actividad HIF observados en líneas celulares de cáncer bajo el mismo nivel de la hipoxia.
Es sabe que las células de cáncer cervical a menudo se infectan con un virus del papiloma humano de tipo oncogénico (VPH), y HeLa se transforma por HPV18 mientras ME180 por HPV68. HPV de diferentes tipos varían en la expresión y regulación de los dos oncogenes VPH primarios, E6 y E7 [44], que son suficientes para alterar el nivel de HIF-1α. HPV11 E6 y HPV31 E6 pueden estimular la expresión de HIF-1α como consecuencia de la degradación dependiente de ubiquitina de p53 [45] mientras que HPV16 E7 puede interactuar con un complejo de ubiquitina ligasa cullin-2 que media VHL dependiente de la degradación HIFa [46]. Será interesante para revelar en el futuro si las diferentes respuestas a la hipoxia observada en HeLa y ME180 están asociados con el tipo de VPH oncogénico que están infectadas con el.
En este estudio se presenta un novedoso construcción de reporte que contiene HIF tándem repeticiones de sitios de unión a HIF mínimos aguas arriba de la secuencia de codificación eYFP. Se demuestra que la señal del informador depende HIF y se correlaciona con los niveles de proteína HIF celulares en diferentes líneas celulares. Mediante la utilización de este nuevo constructo, nos encontramos con una sorprendente variación de la actividad de HIF en diferentes líneas celulares de cáncer bajo el mismo nivel de hipoxia. Este nuevo constructo indicador HIF puede servir como una herramienta para definir rápidamente los niveles de actividad de HIF y, por tanto, la capacidad terapéutica de potenciales represores HIF en distintos tipos de cáncer.
Materiales y Métodos
Células, cultivo de tejidos y la inducción de hipoxia
HeLa y ME180 (carcinoma cervical), A549 (carcinoma de pulmón), células U251 (glioma) eran de la American Type Culture Collection (Rockville, MD). Las células 786-S transfectadas con un VHL de tipo salvaje se obtuvieron del Dr. William G. Kaelin Jr. (Instituto Dana-Farber, en Boston, MA). Las células cancerosas se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con penicilina, estreptomicina y 10% de suero bovino fetal (FBS, Invitrogen, Carlsbad, CA). Se pasaron las células con tripsina /EDTA (Invitrogen, Carlsbad, CA) cuando alcanzaron 80% de confluencia.
Hipoxia inducción
Las células fueron cultivadas en incubadoras multi-gas (Sanyo, San Diego, CA ). El gas nitrógeno se suministra a las cámaras a fin de inducir un porcentaje reducido controlada de oxígeno. Para normoxia, las células fueron cultivadas en viveros que contienen 5% de CO
2 y la concentración atmosférica de O
2, aproximadamente el 20% al 21% de O
2. A lo largo de este documento "normoxia" fue referido como el 20% de O2.
construcción del plásmido de Lentiviral
Hemos generado reportero HIF construir un sitio de unión consenso HIF1α CGTG seguimos HIF2α sitio TACGTG juntos como una unidad del sitio de unión para los factores de HIFa y les repite en tándem 12 veces (12U-HBR), con 5 pares de bases de nucleótidos de diversas combinaciones de espaciamiento entre. CACAG elemento de inducción, un elemento de ADN necesaria para la inducción hipóxica, se insertó de manera uniforme en toda la secuencias de tres veces para ayudar en el proceso de inducción. Las secuencias finales de unión a HIF-fueron sintetizados directamente por Integrated DNA Technologies, Inc, Coralville, Iowa (Figura S1). Los conocimientos tradicionales promotor mínimo seguido de 770 bps β-globina secuencias de intrones y eYFP se amplificó a partir del plásmido pBARL (cortesía del laboratorio del Dr. Randall Luna, Universidad de Washington, Seattle, WA) y vinculado a la secuencia de unión HIF-fusión por PCR. Las secuencias de HIF-TK-EYFP se ligaron su vez en un plásmido lentiviral PRRL-cPPT-X-PRE-SIN [47] (cortesía del laboratorio del Dr. William Osborne, Universidad de Washington, Seattle, WA) entre los sitios ClaI y XhoI. 6U-HBR y 3U-HBR se construyeron de la misma manera, excepto las secuencias de unión a HIF-sólo contienen seis repeticiones de unión (6U-HBR) o tres repeticiones (3U-HBR). Para construir la versión desestabilizado-6U-HBR, las secuencias de dominio ornitina descarboxilasa de ratón 422-461 fueron amplificados por primera vez de plásmido M38 TOP-DGFP (cortesía del laboratorio del Dr. Randall Luna) y luego se insertan en 6U-HBR construir a través MluI sitio después de la 3 'de la secuencia de eYFP.
producción Lentivirus y la transducción estable de líneas celulares
plásmidos lentivirales se transfectaron en líneas celulares FT293 (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) por transfección con fosfato de calcio para producir lentiviral partículas. Específicamente, el plásmido de transferencia (12U-HBR, 6U-HBR, 3U-HBR, o constructo desestabilizado-6U-HBR), plásmido de empaquetamiento, VSVG plásmido y plásmido REV se transfectaron conjuntamente en relación 23:15:8:11.5, y 25 g de plásmidos mezclados fueron transfectadas por placa de 150 mm con 1 ml de 2X HBS y 0,1 ml 2,5 M CaCl
2. Después de la transfección, los medios se cambiaron después de 24 horas y los sobrenadantes virales se cosecharon y se filtró después de 72 horas. Para obtener virus concentrado, los sobrenadantes virales se centrifuga a 6100 rpm durante 17 horas a 4 ° C. El precipitado se resuspendió en 1X (mM Tris.HCl 50, pH 7,4 y NaCl 150 mM) TBS y se almacena en -80 ° C antes de su uso. Para transducir líneas de células con virus, cantidad apropiada de virus se añadieron directamente en los medios de comunicación con la presencia de bromuro de hexadimetrina a 4 ng /ml (polibreno, Invitrogen Inc, Carlsbad, CA) y se cambió el medio después de 24 horas.
celular activada por fluorescencia (FACS) análisis
las células a analizar se tripsinizaron de las placas, se centrifugaron hacia abajo y después se fijaron en 4% de paraformaldehído durante al menos 30 minutos antes del análisis. Ajustes estándar se aplicaron en la clasificación celular con tensiones de canal apropiados y se analizaron al menos 30.000 células para cada experimento. canal FITC se utilizó para detectar la fluorescencia eYFP. FlowJo (Árbol Star, Inc. Ashland, Oregón) fue empleado para visualizar los datos y los valores de FITC se define como la media geométrica de intensidad de fluorescencia de la población eYFP positiva para las muestras de hipoxia. Para muestras incubadas en 20% O
2, las intensidades se definieron como la media geométrica de intensidad de fluorescencia de eYFP de la población total (eYFP negativo).
HIF no degradable (ndHIF) sobre la expresión
para obtener la proteína HIFa expresión constitutiva estable, ndHIF sobre-expresión de plásmidos (Addgene plásmido 19005 y 19006) fueron usados, en el que dos de los sitios Proline de HIF ADNc fueron cambiados a alanina como se describe anteriormente [48]. Retrovirus a partir de los plásmidos fueron infectados en líneas HeLa y de células A549 en presencia de bromuro de hexadimetrina a 4 ng /ml (polibreno, Invitrogen Inc. Carlsbad, CA) y se cambió el medio después de 24 horas. La sobreexpresión de la HIF1α y HIF2α fue confirmada por transferencias Western como se muestra en la Figura S6.
ARNsi contra ensayo de HIF
siRNAs contra el factor HIF fueron obsequio del Dr. Zhan Zhang [38]. siRNAs fueron transfectadas transitoria en células en la placa de 6 pocillos con Lipofectamine 2000 (Invitrogen Inc. Carlsbad, CA) siguiendo las instrucciones Lipofectamine 2000.