Extracto
Fondo
terapia con profármacos enzimáticos dirigidos a genes (GDEPT) es un protocolo de tratamiento de dos etapas para tumores sólidos que implica la transferencia de un gen que codifica una enzima activadora de profármaco seguido mediante la administración del profármaco inactivo que posteriormente se activa por la enzima a su forma tóxica tumor. Sin embargo, el establecimiento de tales regímenes novedoso tratamiento para combatir el cáncer de páncreas requiere definido y robustos sistemas de modelos animales.
Métodos
A continuación, se compararon exhaustiva seis líneas celulares de cáncer de páncreas humano (PACA-44, PANC-1, MIA Paca-2, HS-766T, Capan-2, y BxPC-3) en modelos subcutáneos y orthotopical ratón, así como en su susceptibilidad a diferentes GDEPTs.
resultados
captación tumoral fue de 83% a 100% en el modelo subcutáneo y 60% a 100% en el modelo de ratón orthotopical, a excepción de las células Hs-766T, que no crecen ortotópicamente. análisis histopatológico de los modelos orthotopical revelaron un crecimiento infiltrante de casi todos los tumores en el páncreas; sin embargo, las diferentes líneas celulares dieron lugar a tumores con diferentes características morfológicas. Todos los tumores resultantes fueron positivos para MUC-1 tinción con indicación de su origen a partir de epitelio glandular o ductal, pero reveló tinción pan-citoqueratina dispersa. Transferencia del gen suicida citocromo P450 y la citosina desaminasa, respectivamente, en las líneas celulares de cáncer pancreático usando tecnología de vector retroviral revelado infectibilidad alto nivel de estas líneas de células y se deja el análisis de la sensibilidad de estas células a los fármacos quimioterapéuticos ifosfamida y 5-fluorocitosina , respectivamente.
Conclusión
Estos datos calificar las líneas celulares como parte de valiosos
in vitro
y
in vivo en modelos para el uso en preclínica definido estudios para la terapia de tumores de páncreas
Visto: J. Hlavaty, Petznek H, Holzmüller H, Url A, G Jandl, Berger A, et al. (2012) Evaluación de un dirigidos a genes Enzimoterapia-Producto (GDEPT) en las células tumorales pancreáticas humanas y su uso como modelos in vivo para el cáncer pancreático. PLoS ONE 7 (7): e40611. doi: 10.1371 /journal.pone.0040611
Editor: Hiroyasu Nakano, Escuela de Medicina de la Universidad de Juntendo, Japón
Recibido: Marzo 7, 2012; Aceptado: June 11, 2012; Publicado: July 16, 2012
Derechos de Autor © 2012 Hlavaty et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue financiada en parte por el programa del Fondo de Fomento de la Investigación Industrial de Austria, así como por el Laboratorio Doppler cristiano por gen terapéutico para el Desarrollo del vector. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, recopilación y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Coautores BS y WHG declaran afiliación a la empresa Austrianova Singapur PTE LTD. Esto no altera la adhesión de los autores a todos los PLoS ONE políticas sobre el intercambio de datos y materiales. No existen otras declaraciones relacionadas con el empleo, consultoría, patentes, productos en desarrollo o los productos comercializados etc. Autores JH, HP, HH, AU, GJ, AB, MR han declarado que no existen intereses en competencia.
Introducción
A pesar de grandes esfuerzos científicos y la acumulación de conocimientos sobre la biología del cáncer de páncreas, las tasas de mortalidad de esta enfermedad mortal en su mayoría no se han reducido de manera significativa durante los últimos 30 años. Por otra parte, la incidencia mundial de esta enfermedad está aumentando [1], [2]. Cuando sea posible, el tratamiento de referencia actual implica la resección quirúrgica con o sin quimioterapia postoperatoria o quimioterapia /radioterapia (para revisión ver [3]). Hasta hace poco, el agente quimioterapéutico más común usado para el tratamiento de cáncer de páncreas es 5-fluorouracilo (5-FU), administrado solo o en combinación con otros fármacos y /o radioterapia quimioterapéuticos [4], [5], [6]. Sin embargo, otro análogo de nucleótido, gemcitabina (Gemzar), llevado en el mercado en 1997 principalmente por sus efectos paliativos en vez de para la mejora de la supervivencia, se ha convertido rápidamente en el tratamiento quimioterapéutico de elección para el cáncer pancreático, debido a su potencial terapéutico solo o en combinación [7] , [8], [9].
Sin embargo, se necesitan con urgencia nuevas opciones de tratamiento, y durante las últimas décadas, varios investigadores han comenzado a evaluar estrategias nuevas y no convencionales para el tratamiento de cáncer de páncreas. Esto incluye nuevas estrategias inmunológicas que emplean anticuerpos monoclonales y vacunas terapéuticas, así como enfoques basados en genes tales como ácidos nucleicos antisentido, la expresión de mutantes de oncogenes dominantes-negativas, la expresión de genes supresores de tumor o terapia con profármacos enzimáticos dirigidos a genes (GDEPT; para revisión ver [10], [11]). En GDEPT, también conocida como terapia de gen suicida, un gen específico, heterólogo se introduce en las células tumorales [12]. Cuando se expresa, el producto génico respectivo es capaz de convertir localmente un profármaco no tóxico administrado sistémicamente en su forma de células tóxico activo, ejerciendo el efecto terapéutico en las células tumorales así como en las células circundantes debido a un denominado efecto espectador mediada por difusión de los metabolitos tóxicos.
Herpes simplex timidina quinasa del virus (HSVtk), la citosina desaminasa (CD) y el citocromo P450 (CYP) son genes suicidas que han sido previamente demostrado ser eficaces en diferentes sistemas modelo tumoral ( revisado en [13]). Los vectores virales basados en retrovirus, tales como el virus de la leucemia murina (MLV), han ganado popularidad significativa para la expresión génica eficiente y estable de estos genes suicidas en las células tumorales, los vectores retrovirales de este modo, varios estudios emplean para la entrega de genes terapéuticos en las células tumorales pancreáticas (para revisión ver [14]).
Como primer paso para evaluar nuevas ideas y conceptos de tratamiento, los experimentos con líneas celulares de tumores pancreáticos humanos disponibles se realizan a menudo. A pesar de la importancia de
in vitro
experimentos, la interpretación de los resultados y las conclusiones tienen que ser evaluados por la crítica, ya que los modelos que se utilizan a menudo representan un sistema artificial que puede no reflejar con exactitud el
in vivo
situación. La ausencia de modelos de ratón que recapitula los elementos críticos de la enfermedad ha obstaculizado los estudios no clínicos [15], incluidos los enfoques de GDEPT. Por lo tanto, una mayor evaluación no clínica de nuevas modalidades de tratamiento requiere la presencia de un modelo animal adecuado de cáncer de páncreas humano. Anteriormente, el desarrollo de modelos de tumores de páncreas in vivo ha sido descrito por Mohammad y sus colegas, que genera un modelo de xenoinjerto de ratón (por implantación de material de tumor humano primario) y modelos animales utilizando células primarias de pacientes, así como líneas de células [16], [ ,,,0],17], [18]. Recientemente, se han establecido varios modelos de cáncer de páncreas en base a los animales modificados genéticamente (para una revisión ver [19]).
En el presente estudio, que tuvo como objetivo analizar y comparar las seis líneas de células tumorales pancreáticas humanas en diferentes subcutánea y ortotópico modelos tumorales de ratón, así como para evaluar la idoneidad de estos modelos para los estudios no clínicos de GDEPT. Los tumores subcutáneos se formaron en SCID /ratones de color beige utilizando cada una de las líneas celulares. En el modelo ortotópico, cinco de las seis líneas de células dio lugar a tumores y la mayoría de éstos se infiltraron en el páncreas, con la excepción de la línea celular Capan-2. Además, hemos sido capaces de demostrar que la expresión mediada por retrovirus de genes suicidas que codifican citosina desaminasa o el citocromo P450 2B1 confiere la sensibilidad de las células transducidas al profármaco respectiva (5-fluorocitosina, ifosfamida) en concentraciones clínicamente relevantes. Los datos aquí presentados podrían ser de importancia para otros investigadores con respecto a la elección de un modelo animal adecuado de cáncer de páncreas humano.
Resultados y Discusión
En este estudio, se comparó un grupo de líneas celulares de carcinoma pancreático humano PANC-1, PACA-44, Capan-2, BxPC-3, MIA Paca-2, y Hs-766T en términos de idoneidad para un
in vivo
modelo de ratón de cáncer de páncreas. BxPC-3, Panc-1, Capan-2 líneas celulares PaCa-44 y se deriva de adenocarcinomas ductales de páncreas, mientras que MIA PaCa-2 células se originan a partir de carcinomas del cuerpo páncreas [20], [21], [22], [23], [24]. La línea celular Hs-766T se deriva de la metástasis en los ganglios linfáticos del carcinoma de páncreas [25]. Todas las líneas celulares fueron
in vitro
crecido como cultivos monocapa adherentes con epitelial (PANC-1, MIA Paca-2, HS-766T, BxPC-3) o redonda para poligonal (Capan-2, PACA-44) morfología. Dado que las integridades genéticas de la p53 marcadores tumorales, K-ras, p16 y Smad4 (también conocido como DPC) están asociados con el grado de tumorigenicidad [26], se compararon las líneas celulares utilizadas con respecto a su genotipo para estos marcadores (Tabla 1). Hay una clara consistencia en las alteraciones genéticas de los genes examinados de las respectivas líneas celulares es evidente y los resultados son a menudo depende del tipo de análisis aplicado (para revisión ver [27], [28]). Casi todas las líneas celulares tenían mutaciones en el supresores de tumor de células de ciclo de la regulación de p53 y p16. Las mutaciones dentro de la carcinoma asociado supresor de tumor pancreático Smad4, que está implicado en la transformación del factor de crecimiento beta (TGF) de señalización, se encontró alteración sólo en las líneas de células Hs-766T y BxPC-3 [27]. De todas las líneas celulares utilizadas en este estudio, sólo BxPC-3 se describe a tener un intactas oncogén K-ras [27].
subcutáneo y la formación de tumores ortotópico
Tras la inyección subcutánea de las diferentes líneas celulares de cáncer de páncreas, todos los animales mostraron la formación de tumor (excepto un ratón en el grupo de PANC-1). tumores derivados de Paca-44 mostraron el crecimiento más rápido, pero no homogénea. Siete días después de la inyección de células de estos tumores se pueden medir con un calibrador y el primer animal tuvo que ser sacrificado después de 18 días, como el tamaño del tumor se convirtió superior a 1900 mm
3, por lo tanto haber mostrado una tasa de crecimiento de más de 1600 mm
3 plazo de cuatro días (Fig. 1). La segunda tasa de crecimiento del tumor más pronunciada se observó a partir de tumores PANC-1, seguido por las células Capan-2, BxPC-3 y Hs-766T, que muestra un crecimiento del tumor más moderado. Similar a Paca-44, MIA Paca-2 tumores eran mensurables dentro de los siete días después de la inyección, pero en cambio, mantuvieron su tamaño durante 28 días antes de continuar creciendo (Fig. 1).
5 × 10
6 células de cada línea celular pancreática se inyectaron por vía subcutánea en el flanco izquierdo de CB-17 /IcrHsd-
Prkcd
SCID Lyst
bg
se midieron los ratones en el día 0. los tumores visibles dos veces por semana con un calibre y tamaño se calculó mediante la fórmula "de largo x ancho x ancho /2".
Para determinar el comportamiento orthotopical de los tumores de páncreas generados, piezas de los tumores por vía subcutánea formada se trasplantaron en estrecha proximidad con el páncreas de CB-17 /IcrHsd-
Prkcd
SCID Lyst
bg
ratones. PaCa-44, PANC-1, BxPC-3 y Capan-2 células creció por vía intraperitoneal (i.p.) en todos los animales. el crecimiento del tumor MIA PaCa-2 se encontró i.p. en tres de los cinco animales (Tabla 2). Aunque piezas de tumor Hs-766T fueron implantados en varias ocasiones ip, no se observó la formación de tumores (Tabla 2), aunque re-análisis de piezas implantadas confirmó la viabilidad de las células tumorales (datos no mostrados).
Más de dos tercios de PACA-44, PANC-1, MIA Paca-2 y BxPC-3 tumores se infiltraron en el páncreas. Sin embargo, los tumores residuales tenían una conexión a la pared abdominal en lugar de en el páncreas (Tabla 2). A partir de los Capan-2 tumores, sólo un infiltrado en el páncreas, mientras que los otros fueron unidos al bazo o a la pared abdominal sin mostrar penetración (Tabla 2). En contraste con el otro tipo de células, los tumores derivados Hs-766T no se adjunta a cualquier órgano en absoluto y se encuentra ubicado con holgura en el abdomen.
Tumor Patología
Tumores de toda la ortotópicamente líneas celulares de cultivo, así como la línea de células por vía subcutánea cada vez mayor Hs-766T se analizaron histológicamente. Análisis de la casi totalidad de los modelos de tumor ortotópico reveló invasión focal del páncreas autochtonic por un carcinoma anaplásico sólido excepto el modelo de tumor BxPC-3 que mostró difunde diferenciación tubular y Capan-2 células que crecieron como un adenocarcinoma ductal. PANC-1, BxPC-3 y Capan-2 tumores mostraron poco pleomorfismo celular y nuclear y se hicieron por células grandes con abundante citoplasma pálido y núcleos grandes (PANC-1, Capan-2) o células pequeñas, redondas con núcleos densos ( BxPC-3). Paca-44 y MIA PaCa-2 tumores, por el contrario, tenían prominentes pleomorfismo celular y nuclear. MIA Paca-2 tumores consistían principalmente en pequeñas y redondas de células fusiformes con núcleos densos, además de células grandes que revelan zonas citoplasmáticos hiper-eosinofílica típicos de las células acinares, mientras que Paca-44 tumores revelaron células grandes, el citoplasma rico con grandes núcleos. Además de BxPC-3 células tumorales que sólo tenían una tasa moderada de mitosis Capan-2 y, las células de todos los otros tumores mostraron un aumento de la actividad mitótica muy indicando el alto grado de malignidad de estos tumores. Además, en PANC-1, se pudieron observar MIA PaCa-2 y tumores BxPC3 grandes zonas en necrosis - un rasgo característico adicional de tumores altamente malignos. En conjunto, casi todos los tumores reveló un alto grado de desdiferenciación, con sólo Capan-2 tumores, así como en algunas zonas de BxPC-3 tumores residuales características típicas del origen glandular de los tumores son detectables.
Sólo poco linfocítica y la infiltración neutrofílica del tejido de tumor adyacente, tal como tejido adiposo y fibroso y el páncreas autochtonic, se detectó en el PANC-1, PaCa-44, BxPC-3, MIA PaCa-2, y Capan-2 modelos con infiltración linfocítica adicional en el propio tejido tumoral PaCa-44 (Fig. 2A). Además, se observó invasión difusa neutrofílica moderada de todo el MIA PaCa-2 tumores derivados con áreas focales de colliquation (Fig. 2A). Como la implantación orthotopical de piezas de tumor Hs-766T no dio como resultado el crecimiento del tumor, el modelo subcutáneo análoga se analizó histológicamente revelando un sólido carcinoma anaplásico con prominentes pleomorfismo celular y nuclear, que consiste principalmente de pequeños, redondos a las células en forma de huso con núcleos densos, una actividad mitótica alta, y grandes áreas de tejido necrótico tumoral (Fig. 2A). ramas generales de tejido fibroso fueron detectables en la periferia de los tumores, pero también difunden adyacente a grupos de células tumorales en BxPC-3, Capan-2 y PaCa-44 tumores; en Paca-44 tumores de la fibrosis fue acompañado por infiltrados leucocitarios inmaduros.
(2A) Secciones de tumores pancreáticos derivados de las líneas celulares pancreáticas indicados se tiñeron con hematoxilina y eosina. El espécimen Hs-766T fue disecada de un tumor subcutáneo; todas las demás muestras fueron tomadas de los tumores ortotópicamente cultivadas. (2B) Las diferentes secciones de un tumor derivado de BxPC-3 fueron sometidos a análisis inmunohistoquímico con anticuerpos contra mucina 1 (MUC-1), pan-citoqueratina (CK-Pan), y α-actina de músculo liso (SMA). La barra de color negro representa una longitud de 53 m, a excepción de anti-MUC-1 tinción (27 micras).
tinción PAS se realizó para identificar estructuras tumorales procedentes de conductos y /o acinos. En Capan-2 y BxPC-3 tumores 40% y el 25% de las células tumorales fueron positivas para PAS, respectivamente. El resto de los tumores, con la excepción de MIA Paca-2 y PANC-1, que se mantuvo completamente negativa, reveló que sólo un número marginal de células PAS-manchados - muy probablemente debido a su estado más indiferenciado (datos no mostrados)
.
inmunohistoquímica (IHC) tinción de la proteína MUC-1, que se expresa por la mayoría de las células epiteliales glandulares y ductales, condujo a etiquetado discreto de casi toda la masa tumoral en el PaCa-44, PANC-1, BxPC-3 (Fig . 2B) y modelos de tumor ortotópico Capan-2 y de alrededor de 75% de la PaCa-2 tumor MIA. En comparación con las señales inmunológicas observadas en el páncreas humanos normales, donde se encontró el etiquetado de color marrón en el citoplasma de los acinos y las células epiteliales ductales, los perfiles de expresión de los tumores son indicativos para su acinar y origen ductal. Aunque histomorfología sólo en raras ocasiones se asemeja tejido páncreas autochtonic, de acuerdo con los perfiles de tinción mencionados anteriormente, los tumores son identificables como adenocarcinoma de origen ductal, que representa el 85% a 90% de todos los tumores de páncreas [29], [30]. Sin embargo, de acuerdo con la clasificación de la OMS, que reconoce varias variantes además de la adenocarcinoma ductal tubuloglandular clásico [30], casi todos los tumores ortotópico corresponden a la variante de carcinoma anaplásico. Curiosamente, la detección de IHC de citoqueratinas (CK) 1-8, 10, 14-16 und 19 utilizando un anticuerpo Pan-CK resultó en etiquetado inmune de todo el tumor establecido con PaCa-44, BxPC-3 y Capan-2 células pero en sólo 60% y 40% de células teñidas en MIA PaCa-2 y PANC-1 tumores, respectivamente. Como Pan-CK tubular principalmente manchado /estructuras ductales del páncreas humanos normales, la disminución de inmunomarcaje en MIA PaCa-2 y PANC-1 en comparación con los otros tumores puede ser sugerente para un origen más acinar de estos tumores, o, sobre todo en caso de MIA PaCa-2, que también expresa MUC-1 en sólo el 75% de las células tumorales, el patrón de expresión puede ser indicativo de un grado más alto de malignidad, que se apoya en el aspecto histológico de este tumor con grandes áreas de necrosis, colliquation neutrofílica y un alto índice mitótico. Las señales obtenidas mediante el análisis de la capacidad de los anticuerpos pan-CK y MUC-1 para unirse a las líneas celulares eran no homogénea e inconsistente, lo que complica la interpretación de estos datos.
En resumen, de acuerdo con su aspecto histológico, el patrón de tinción PAS-y los perfiles de expresión para PANC-1 líneas celulares MUC-1 y Pan-CK, MIA Paca-2 y dieron lugar a los tumores más indiferenciados de este estudio; Sin embargo, parecido inequívoco de páncreas humano sano se dio en ninguno de los tumores, como, con la excepción de la pequeña zona tubular en Capan-2, incluso los tumores no anaplásicos mostraron un patrón de crecimiento sólido, no glandular.
el uso de anti-SMA, numerosos citoplasma de color células del estroma ricos profundamente parduscos adyacentes a las células tumorales se encuentran a lo largo de los tumores de todas las líneas celulares; páncreas normal permanecieron negativos (Fig. 2). La fibrosis distinta acompañada de las ventanillas únicas, el más obvio en BxPC-3, Capan-2 y Paca-44 tumores. GFAP tinción reveló inmunotinción positiva sólo en MIA Paca-2 tumores, lo que representa procesos de las células estrelladas marcados que rodean la acinos pancreáticos. Por lo tanto, como PSCs activados son conocidos por ser las células efectoras principales en la fibrosis, que es una característica patológica consistente en cáncer de páncreas humano [31], [32], [33], y perturbar el estroma del tumor desmoplásico mejora la entrega y la eficacia de la lucha contra El tumor drogas [33]. células BxPC-3, Capan-2, y Paca-4 representan los modelos de tumores más prometedoras para los estudios relativos a la inhibición de la fibrogénesis en el cáncer pancreático humano
.
Nuestros datos indican que, mediante el empleo de diferentes líneas de células pancreáticas en una ajuste ortotópico, un amplio espectro de tipos de tumores pancreáticos heterólogas se pudo establecer que sirve como modelo para diferentes aplicaciones terapéuticas en la terapia de tumores de páncreas. Estudios previos en ratones SCID revelaron que s.c. tumores implantados sólo raramente muestran metástasis [16]. En nuestro estudio, los ratones se mantuvieron durante hasta 18 semanas después del inicio del inicio Capan-2 y BxPC-3 tumoral, 13 y 10 semanas después de MIA Paca-2 y PANC-1 aparición del tumor, respectivamente, y 4 semanas después de Paca-44 de tumor y los análisis brutos de órganos de ratón indican que ninguna de las células tumorales dio lugar a metástasis locales o distales ya sea después de sc o trasplante ortotópico. Por el contrario, Tseng y sus colegas descubrieron recientemente metástasis hepáticas en B6 /129 ratones de 6 a 8 semanas después de la implantación de líneas de células de metástasis hepáticas obtenidas de K-ras (G12D /+), LSL-Trp53 (R172H /+) y PDX-1 ratones -Cre [34]. Al igual que en los seres humanos, la mayoría si no todos los carcinomas de páncreas muestran metástasis local y distal con el tiempo, la falta de tendencia metastásica tiene que ser tenido en cuenta cuando se establece un ensayo de eficacia de drogas con esas líneas de células tumorales.
Además de en modelos in vivo que llevan xenoinjertos de células humanas, recientemente, se han establecido modelos de ratones genéticamente modificados de cáncer de páncreas (para revisión ver [19], [35]). Dado que estos sistemas de modelos se basan en modificaciones genéticas individuales, son herramientas valiosas para el estudio de la influencia de tales alteraciones genéticas o de vías de señalización individuales en el desarrollo de tumores [19]. Sin embargo, son menos adecuados para evaluar nuevos conceptos terapéuticos para el tratamiento del cáncer de páncreas. En su lugar, los sistemas modelo como ortotópicamente tumores de crecimiento humanos xenoinjertos son mucho más adecuadas ya que se asemejan, por el origen de los tumores pancreáticos humanos, el estado actual y la heterogeneidad de la enfermedad humana.
de sensibilidad mediada por citosina desaminasa de las líneas de células pancreáticas humanas hacia 5-fluorocitosina
Para estudiar comparativamente el potencial de matar del sistema /5-FC citosina deaminasa en nuestros modelos de cáncer de páncreas, cada una de las seis líneas de células tumorales se infectan de manera estable
in vitro Vaya con el PCCDWmCMVpuro retrovirus vector, que alberga el gen de levadura citosina desaminasa (CD) bajo el control transcripcional de la omnipresente citomegalovirus murino (CMV) [36]. El CD de levadura permite la conversión de la no tóxico profármaco 5-fluorocitosina (5-FC) a la altamente tóxico agente quimioterapéutico 5-fluorouracilo (5-FU) y por lo tanto, después de la integración en las células de cáncer de páncreas, su expresión debería permitir tumor preferencial agotamiento de las células después de la administración 5-FC.
Para confirmar la transcripción CD después de la transducción de retrovirus, RT-PCR se realizó a partir de lisados de células transducidas, así como a partir de células no transducidas. El fragmento del gen CD ~480 pb se detectó claramente en células transducidas con el vector PCCDWmCMVpuro (Fig. 3), pero estaba ausente en las células no infectadas. Estos datos indican la integración vector adecuado y la expresión del transgén comparable CD en todas las líneas celulares (Fig. 3).
ARN celular total fue aislado de las líneas celulares indicadas y mRNA fue a transcripción inversa utilizando oligo (dT). CD, así como fragmentos de genes GAPH específicos fueron amplificados utilizando cebadores específicos y se separaron en un gel de agarosa que muestra los tamaños esperados de ~480 pb para CD y ~ 350 pb para GAPDH. La cantidad de ADNc usado para la amplificación PCR se ajustó para producir cantidades comparables de el fragmento del gen GAPDH.
Para evaluar esta estrategia GDEPT para el tratamiento de células de cáncer pancreático
in vitro
, hemos determinado la LD
50 después de la administración del profármaco 5-FC a las líneas celulares de tumores pancreáticos humanos previamente transducidas con PCCDWmCMVpuro. En comparación con las células no transducidas que no eran sensibles a 5-FC (& gt; 1,000 g /ml), la LD
50 se redujo en 16 veces en la media en todas las líneas celulares (Tabla 3). Este eminente aumento de la sensibilidad 5-FC indica que la expresión de CD establecido con éxito la conversión del profármaco 5-FC al tóxico 5-FU en todas las líneas de células tumorales de páncreas transducidas. Curiosamente, el CD línea celular que expresa BxPC-3 fue hasta 30 veces más sensible a 5-FC en comparación con las células Hs-766T transducidas. Para analizar si esta diferencia en la sensibilidad es independiente de la expresión de CD, ambas líneas celulares pancreáticas no tratados y transducidas se incubaron directamente con tóxico 5-FU. Como era de esperar, la susceptibilidad de todas las líneas celulares a 5-FU fue independiente de la transducción con vector PCCDWmCMVpuro. Sin embargo, de acuerdo a 5-FC los resultados del tratamiento, BxPC-3 células fueron aproximadamente 30 veces más sensible a 5-FU que las células Hs-766T (Tabla 3), lo que sugiere que las líneas de células pancreáticas probados tienen una susceptibilidad diferencial a la tóxico drogas
per se
. Según los estudios clínicos que emplean 5-FC, las concentraciones plasmáticas en los pacientes están llegando a niveles de 50 a 125 mg /ml 5-FC después de la administración oral de 150 mg 5-FC por kg de peso corporal [37], [38], [39] . Sin embargo, las concentraciones plasmáticas superiores a 100 mg /ml se consideran a menudo como tóxico para el paciente [39]. A este respecto, el tratamiento con PCCDWmCMVpuro vector permitió cuatro de las seis líneas celulares sometidas a prueba para responder a 5-FC concentraciones por debajo de 100 g /ml, lo que sugiere que GDEPT puede permitir un tratamiento tumor eficaz en dosis de profármaco por debajo de los niveles de toxicidad no específica.
destrucción mediada por el citocromo P450 de pancreáticos humanos Líneas de células tumorales
el uso de la ifosfamida agente quimioterapéutico para el tratamiento de cáncer de páncreas se ha descrito en varios estudios [40], [ ,,,0],41], [42], [43], [44]. La ifosfamida profármaco se convierte en phosphoramide mostaza por el citocromo P450. mostaza fosforamida hace ADN de células en división disfuncional mediante alquilación, que es la base de su selectividad para las células en división tales como comprendido en tumores de crecimiento rápido. Desafortunadamente, como el citocromo P450 se produce predominantemente en el hígado, toxicidad del metabolito ifosfamida es más bien sistémica y no-tumor específico. Para aumentar la toxicidad específica de tumor en nuestro modelo de tumor de páncreas comparativo, se utilizó el PCCWmCMV vector retroviral que alberga el P450 2B1 gen citocromo rata (CYP2B1) para la transducción estable de las líneas de células pancreáticas.
Para controlar la expresión de CYP2B1 después transducción, los análisis de Western blot se han realizado con lisados de proteína de las células transducidas y no transducidas. expresión CYP2B1 sólo se detectó en células previamente transducidas con el vector retroviral (Fig. 4). línea celular BxPC-3 reveló sólo menores niveles de expresión de CYP2B1. Para evaluar la sensibilidad de las líneas celulares de tumores de páncreas CYP2B1 que expresan BxPC-3, MIA Paca-2, HS-766T, Paca-44 y PANC-1 hacia la ifosfamida, la LD
50 se determinó en comparación con las células no transducidas. La toxicidad no específica de la ifosfamida profármaco en líneas de células no transducidas varió de manera significativa y se van desde 0.18 (células Hs-766T) mM hasta mm (células PANC-1) LD 2
50 valores (Tabla 4). La expresión del transgén CYP2B1 condujo a una hasta 13 veces mayor susceptibilidad a la ifosfamida en cuatro de las cinco líneas celulares ensayadas (Tabla. 4). Sólo las células Hs-766T, que eran más sensibles a la ifosfamida
per se
, no mostraron mayor susceptibilidad a la ifosfamida, a pesar de la expresión del gen CYP2B1.
Un total de lisados celulares a partir de 8 × 10
5 células se separaron en un gel de poliacrilamida al 10% bajo condiciones de desnaturalización. Después de la transferencia, se detectó la proteína CYP2B1 con un anticuerpo específico del CYP.
Los estudios sobre la viabilidad de GDEPT in vivo de cáncer de páncreas ya se han realizado anteriormente [44], [45], [46], [47], [48]. Hemos mostrado que las células encapsuladas modificadas genéticamente para expresar el gen del citocromo P450 suicidio implantado en ratones en el entorno de los tumores derivados de PaCa 44 células son capaces de causar la reducción del tumor, cuando se da el profármaco apropiado que es activado por el citocromo P450 [45] , [46]. Además, hemos utilizado estas células encapsuladas en un ensayo clínico en pacientes con cáncer de páncreas y fueron capaces de demostrar que la mediana de supervivencia de este grupo de pacientes se duplicó [44], [47].
En su conjunto, estos datos sugieren que tales GDEPT enfoques para el tratamiento del cáncer de páncreas son prometedores. Sin embargo, tales nuevas terapias necesitan ser probados en más de un sistema de modelo animal relevante se asemeja a la característica de los tumores respectivos medida de lo posible. Esto indica claramente una necesidad urgente de una mayor caracterización de modelos animales de elección, como lo hemos demostrado en este estudio.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
Todos los animales se manejaron en estricta conformidad con las buenas prácticas de los animales. los animales de trabajo fue aprobado por el Comité Consultivo para la Experimentación Animal del Ministerio Federal de Educación, Ciencia y Cultura de acuerdo con la Ley Federal austríaca de Experimentos con Animales (BGBl N ° 501/1988, BGBl I nº 169/1999 y BGBl I nº . 136/2001) y una licencia para la experimentación con animales fue emitida específicamente para este estudio (GZ 68.205 /177-BRGT /2003). Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento de los animales. Las cirugías se llevaron a cabo bajo anestesia general. Los animales se sacrificaron antes de que el tumor alcanzó un tamaño palpable de 1.500 mm
3.
plásmidos
La secuencia de codificación del gen de la citosina desaminasa (CD, GenBank adhesión no. U55193, pos. 183-659) a partir de
Saccharomyces cerevisiae
se amplificó por PCR a partir de ADN genómico de levadura (Sigma) y posteriormente se introdujo en el vector de clonación pCR-XL-TOPO (Invitrogen) como resultado el plásmido pYCD. A continuación, el ADNc citosina deaminasa fue puesto en libertad a partir del plásmido pYCD a través de una restricción que
EcoR
digestión y se ligó con los 7,7 kb
EcoR I-
fragmento del plásmido pPCEWmCMVpuro que codifica un vector retroviral basado en MLV [ ,,,0],36]. El plásmido resultante se denominó pPCCDWmCMVpuro. La secuencia de codificación del gen de citocromo P450 de rata 2B1 (CYP2B1) se amplificó por PCR a partir del plásmido pc3 /2B1 [47] utilizando cebadores Age-CYP (5'-GCGTACCGGTCCACCATGGAGCCCAGTATCTTGC-3 ') y CYP-Not (5'-AAGCGGCCGCTATCACCGAGCTGAGAAGCAG-3' ) que alberga
Edad
I y
No
específica sitios de restricción, respectivamente, y se clonó en la gran
Edad
I-
No
fragmento de la retroviral vector plásmido pPCEmCMV [36]. El plásmido resultante se denominó pPCCmCMV. Para generar el plásmido pPCCWmCMV, el elemento regulador postranscripcional virus de hepatitis de la marmota (WPRE) fue puesto en libertad a partir del plásmido pPCEWmCMV por digestión de restricción con
No
e insertado en el
vector No
linealizado-pPCCmCMV [36 ].
líneas celulares
células de empaquetamiento retrovirales anfotrópicos basados en la línea celular de riñón embrionario humano HEK293 [49], las líneas celulares de tumor pancreático humano PANC-1 (ATCC CRL-1469), PaCa- 44 [22], MIA PaCa-2 (ATCC CRL-1420), y Hs-766T (ATCC HTB-134) se cultivaron en Dulbecco modificado medio de Eagle (DMEM /Glutamax; Life Technologies) suplementado con suero de ternera fetal 10% (FCS , Life Technologies). líneas celulares de tumor pancreático humano BxPC-3 (ATCC CRL-1687) y Capan-2 (ATCC HTB-80) fueron cultivadas en medio RPMI (Life Technologies) suplementado con 10% de FCS y glutamina y medio McCoys (Life Technologies) suplementado con 10 % de FCS, respectivamente. células NIH3T3 (ATCC CRL-1658) se mantuvieron en DMEM /Glutamax suplementado con 5% de FCS.
producción de virus y la generación de células establemente infectadas
El método de co-precipitación con fosfato cálcico se utilizó para establecer de forma estable células productoras de virus [50]. En pocas palabras, 7 × 10
5 de células de empaquetamiento retrovirales basados HEK293 [49] se transfectaron en una placa de 6 pocillos con 3,0 g de plásmido pPCCDWmCMVpuro y pPCCWmCMV, respectivamente. 24 horas después, las células se tripsinizaron y se seleccionaron en DMEM que contenía 0,6 mg /ml puromicina (Sigma) para células o pPCCDWmCMVpuro transfectadas 400 mg /ml de geneticina (Gibco) para las células transfectadas pPCCWmCMV hasta que se formaron colonias de células individuales. Las celdas seleccionadas se expandieron y se utilizan para experimentos adicionales.