Extracto
Un mecanismo importante de los anticuerpos monoclonales que se dirigen selectivamente la insulina como factor de crecimiento tipo 1 receptor (IGF-1R) para inhibir el crecimiento del tumor es mediante la regulación negativa del receptor, sin tener en cuenta si son capaces (antagonista ) o incapaces (agonista) de bloqueo de la unión de ligandos afines. Hemos desarrollado y caracterizado un nuevo anticuerpo humanizado anti-IGF-1R agonística, hR1, y se utiliza el método Dock-y-Lock (DNL) para construir Hex-HR1 el primer anticuerpo multivalente que comprende 6 Fab funcionales de hR1, con el objetivo de mejorar la potencia de hR1. Sobre la base de experimentos de bloqueo cruzado, hR1 reconoce una región del dominio rico en cisteína en la α-subunidad, diferente de los epítopos mapeadas para los anticuerpos anti-IGF-1R existente, sin embargo, hR1 es similar a otros anticuerpos anti-IGF-1R en la regulación negativa de IGF-1R y la inhibición de la proliferación, la formación de colonias, o invasión de líneas celulares de cáncer seleccionado in vitro, así como la supresión del crecimiento del xenoinjerto rabdomiosarcoma RH-30 en ratones desnudos cuando se combina con el inhibidor de mTOR, la rapamicina. Hex-hR1 y hR1 son generalmente comparables en sus bioactividades bajo la in-intro y las condiciones in vivo investigadas. Sin embargo, en experimentos selectivos, que implican una comparación directa de la potencia, Hex-hR1 demostró un efecto más fuerte sobre la inhibición de la proliferación celular estimulada por el IGF-1 y podría regular a la baja eficacia de IGF-1R en una concentración tan baja como 20 pM.
cita: CH Chang, Wang Y, Trisal P, Li R, Rossi DL, Nair A, et al. (2012) Evaluación de una novela hexavalente humanizado anti-IGF-1R anticuerpo y su bivalente IgG de los padres en diversas líneas celulares de cáncer. PLoS ONE 7 (8): e44235. doi: 10.1371 /journal.pone.0044235
Editor: Zhaozhong Han, la Universidad de Vanderbilt, Estados Unidos de América
Recibido: 24 de mayo de 2012; Aceptado: July 30, 2012; Publicado: 31 Agosto 2012
Copyright: © Chang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue parcialmente apoyado por el Instituto Nacional del cáncer conceder 1R 43CA150742-01 de los Institutos nacionales de Salud de Estados Unidos. Sin financiación externa adicional fue recibida para este estudio. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado los siguientes intereses. A pesar de que uno o más de los autores son empleados de empresas comerciales Immunomedics, Inc, IBC Pharmaceuticals, Inc, y el Centro de Medicina Molecular e Inmunología, esto no altera la adhesión de los autores a todos los PLoS ONE políticas en materia de datos y materiales de uso compartido.
Introducción
señales transmitidas a través de los receptores del factor de crecimiento de la superficie celular tras la unión a ligandos afines son esenciales para la regulación del crecimiento normal de las células y la diferenciación, sino también contribuir al desarrollo, la proliferación, la supervivencia, la motilidad y la metástasis de diversos tipos de células malignas, como lo ejemplifican los factores de crecimiento similares a la insulina bien estudiados (IGF), y su principal receptor de señalización, IGF-1R [1] - [4]. El eje de señalización de IGF también se compone de la insulina como un ligando; tres otras homo-receptores, IGF-2R, isoforma del receptor de insulina A (IRA), y el receptor de la insulina isoforma B (IRB); tres híbridos-receptores, cada uno formado a partir de IGF-1R y IRA, IGF-1R y IRB, y IRA e IRB; seis proteínas de unión a IGF (IGFBRs); y un grupo de proteasas que degradan las IGFBPs para liberar IGFs. IGF-1R es una tirosina quinasa del receptor, que comprende dos subunidades alfa-extracelulares unidas por puentes disulfuro, cada uno también unidas por puentes disulfuro a una subunidad transmembrana β-. La región citoplasmática de la subunidad β-alberga un dominio de tirosina quinasa, así como un sitio de acoplamiento para los miembros de la familia sustrato receptor de insulina (IRS), y el adaptador de proteínas SH2 que contiene, Shc [5]. IGF-1 se une a las subunidades alfa-de IGF-1R con una afinidad más alta que IGF-2 [6]. El acoplamiento de IGF-1R por IGFs induce la autofosforilación de los tres residuos de tirosina en el dominio quinasa de β-subunidad [7], que fosforila además otros residuos de tirosina en el dominio citoplásmico, lo que conduce al reclutamiento de IRS y Shc, con la activación subsiguiente de tanto phosphoinositide 3-quinasa (PI3K) -Akt y las vías activada por mitógenos proteína quinasa (MAPK) [8]. Los elementos estructurales mínimas de la IGF-1 sitio de unión en el IGF-1R se han determinado [9] para requiere el dominio N-terminal L1 (aa 1-150), el C-terminal del dominio rico en cisteína (aa 190- 300), y el C-terminal de la subunidad α-(aa 692-702). En comparación, se mapearon los epítopos funcionales de IGF-2 en IGF-1R [10] para implicar el dominio N-terminal L1 y el C-terminal de la subunidad α-, pero no el dominio rico en cisteína. Además de las IGFBP, la biodisponibilidad de IGF-2 también está regulada por IGF-2R, que carece de actividad quinasa intracelular y por lo tanto funciona como un receptor scavenger para IGF-2. Aunque IRB sólo reconoce la insulina, su variante de empalme, IRA, que se expresa más comúnmente por los tumores, también se une a IGF-2 [11] con alta afinidad, lo que resulta en efectos mitogénicos y aumento de la supervivencia, la motilidad y la invasión de células de cáncer [12 ]. La complejidad del sistema de IGF-señalización se complica aún más por la capacidad de IGF-2 para estimular la IRA y IRA /IRB, la capacidad de ambos IGF-1 e IGF-2 para estimular IGF-1R, IGF-1R /IRA, y IGF-1R /IRB, y la diafonía entre IGF-1R y EGFR [13] - [15], todos los cuales parece constituir vías para ciertas células cancerosas que escapan terapias dirigidas-IGF-1R, y proporcionan la racional para cotargeting IGF -1R con IR [16], [17] o EGFR /HER2 [18], [19] para mejorar la eficacia del tratamiento.
el potencial para la orientación de IGF-1R para tratar el cáncer se demostró inicialmente por la capacidad de las αIR-3, un anticuerpo monoclonal de ratón (mAb) que bloquea la unión de IGF-1R [20], para inhibir el crecimiento in vivo de la estrógeno-independiente MDA-MB-231 de xenoinjerto de cáncer de mama humano en ratones desnudos [21]. Dos estrategias principales para la terapia dirigida-IGF-1R (a saber, el bloqueo de anticuerpos anti-IGF-1R y los inhibidores de molécula pequeña de receptores de tirosina quinasa) se han buscado activamente durante la última década, resultando en varios estudios preclínicos y clínicos en diversos tipos de cáncer, que se revisaron periódicamente [22] - [36]. Además, el potencial para la inhibición dual de IGF-1 e IGF-2 con anticuerpos neutralizantes se demostró más recientemente [37].
La mayoría de mAbs desarrollados contra IGF-1R hasta la fecha se han diseñado para prescindir de IR y selectivamente inhibir la señalización de IGF-IR mediada por el bloqueo de los IGFs de la unión. También comparten una propiedad común de inducir la regulación a la baja de IGF-1R a través de la internalización y la degradación [38], lo que podría afectar de forma inadvertida la señalización de insulina debido a la regulación a la baja simultánea de los receptores de IGF-1R /IR híbridos [39]. Como se resume en la Tabla S1 en la información suplementaria
en línea en, estos mAbs, además de ser murino, humanizado o completamente humano, difieren en propiedades estructurales y funcionales que incluyen isotipo, epítopo, la potencia para inhibir uno o ambos IGFs, y afinidad por IGF-1R. Ocho de estos anticuerpos monoclonales (AVE1642, BIIB022, cixutumumab, dalotuzumab, figitumumab, ganitumumab, R1507, y robatumumab) han estado o están actualmente en ensayos clínicos en varias combinaciones. Mientras que las respuestas objetivas se informó de algunos ensayos de fase II, por ejemplo, en dos estudios [40], [41] que muestra un beneficio clínico en el cáncer no microcítico de circulación extracorpórea (NSLCL) de los pacientes tratados con figitumumab, paclitaxel y carboplatino (FPC) , dos posteriores ensayos de fase III que evalúa FPC y una combinación de figitumumab con erlotinib en pacientes no seleccionados con CPNM avanzado se han suspendido en octubre de 2009, debido a la falta de eficacia y una toxicidad mayor de lo previsto a partir de datos de fase temprana [42]. Por lo tanto, a pesar de una gran cantidad de sólidos datos preclínicos que apoyan la justificación de IGF-1R-dirigida de la terapia del cáncer, los resultados clínicos en general decepcionantes, según lo revelado por figitumumab, R1507 (desarrollo clínico suspendida en diciembre de 2009), y otros [43], han señalado a una dirección futura que se centrará en la identificación y validación de biomarcadores predictivos, así como la investigación de las combinaciones más racionales con otros agentes anticancerígenos para combatir los mecanismos de resistencia comunes desarrollados a partir de bloqueo de IGF-1R sola
.
anticuerpos multivalentes menudo aumentar la potencia de sus padres bivalentes, en parte como resultado de una mayor avidez de unión a antígenos cognados en las células diana. Uso de la base-y-Lock (DNL) plataforma [44], [45] para generar un anticuerpo hexavalente, designado Hex-HR1 de su matriz bivalente, HR1 un nuevo anticuerpo humanizado (IgG1,
kappa
) que se dirige a IGF-1R, pero no IR, exploramos la posibilidad de comparar las diversas actividades biológicas mostradas por Hex-hR1 y hR1 en diversas líneas celulares de cáncer, así como su eficacia in vivo en un modelo de xenoinjerto de rabdomiosarcoma humano (RH -30) en ratones desnudos, con o sin la adición de rapamicina. Se presenta en el presente documento que hR1 une a una región de IGF-1R se encuentra en la primera mitad del medio del dominio rico en cisteína (aa 185 -222), que es distinto de los epítopos reportados para un número de anti-IGF-1R mAbs [46, 47, y en la Tabla S1]. La disimilitud de hR1 a los mAbs anti-IGF-1R en desarrollo clínico también incluye su incapacidad para bloquear la unión de cualquiera de IGF-1 o IGF-2 a IGF-1R, y un comportamiento intrigante para inducir la fosforilación de IGF-1R y aguas abajo señalización sin estimular notablemente el crecimiento celular. Por otro lado, hR1 es similar a otros anticuerpos anti-IGF-1R en su capacidad para regular a la baja de IGF-1R y de inhibir la proliferación, la formación de colonias, o invasión de líneas celulares seleccionadas in vitro, así como para retardar el crecimiento de la RH -30 xenoinjerto en ratones desnudos cuando se combina con el inhibidor de mTOR, la rapamicina. Hex-hR1 y hR1 son generalmente comparables en sus actividades biológicas en las condiciones investigadas, aunque hex-hR1 mostró una mayor potencia que hR1 en la regulación negativa de IGF-1R y en la inhibición de la proliferación de ciertas líneas celulares de cáncer de respuesta.
Materiales Métodos y
líneas celulares, anticuerpos y reactivos
Todas las líneas celulares se adquirieron de ATCC, a excepción de HR-30, que se obtuvo de DSMZ. Los anticuerpos humanizados, incluyendo hR1, hPAM4 (anti-mucina), hA20 (anti-CD20), hRS7 (anti-Trop-2), hLL2 (anti-CD22), y hMN-15 (anti-CEACAM6), fueron proporcionados por Immunomedics . IGF-1R humano recombinante (rhIGF-1R), IGF-1 humana recombinante, IGF-2 humana recombinante, y el ratón IGF-1R anti-humano mAb (MAB391) se obtuvieron de R & amp; D Systems. anticuerpos IGF-1R anti-humanos adicionales se obtuvieron de Calbiochem para Ab-1 (clon αIR3), Ab-3 (Clone 33255.111), y Ab-4 (clon 24 a 31); de Santa Cruz Biotechnology para 2C8, 1H7, 3B7, y C-20; de Millipore por 24-57 y 24-31; y de Invitrogen para 17-69, 24-60, y 1-2. fosfato anticuerpos específicos y otros anticuerpos primarios fueron adquiridos de Señalización Celular o Santa Cruz Biotechnology. peroxidasa de rábano picante (HRP) conjugado con anticuerpo secundario y ensayo de proliferación celular One Solution (MTS) se obtuvieron de Promega. FITC o anticuerpos secundarios conjugados TRITC-eran de Jackson ImmunoResearch Laboratories. tampón de reactivo de extracción PhosphoSafe y RIPA utilizado para la lisis de las células se obtuvieron a partir de EMD Biosciences y la señalización celular, respectivamente. medios de cultivo celular, suplementos, y transferrina bovina (holo forma) se compraron de Invitrogen. La rapamicina (Sigma-Aldrich) se disolvió en DMSO, se dividió en alícuotas y se almacenó a -20 ° C hasta su uso. Ensayo de proteínas del tinte reactivo concentrado era de Bio-Rad. Todos los demás productos químicos fueron adquiridos de Sigma.
Cell Cultura y
líneas de células malignas se mantuvieron rutinariamente a 37
o C en 5% de CO
2 en RPMI 1640 suplementado con 10 % inactivado por calor suero fetal bovino (FBS), 1% Glutamax I, 1% HEPES, aminoácidos no esenciales al 1% y piruvato de sodio 1% (referidas como 10% RPMI). Para Capan-1, se utilizó 20% de FBS (20% RPMI). El medio de cultivo se cambió al menos una vez por semana y sólo las células con menos de 50 pasajes fueron utilizados para experimentos.
i.p. generación de R1
Tres ratones BALB /c fueron inmunizados cada uno con 15 g de rhIGF-1R (Met1Asn932), que comprende una mezcla de ambos dominio extracelular procesados y no procesados de IGF-1R, en adyuvante completo de Freund. inmunizaciones adicionales en adyuvante incompleto de Freund se realizaron 14, 21, y 28 días después de la inmunización inicial. Los hibridomas se generan por fusión de las células de bazo de los ratones inmunizados con células de mieloma P3 x 63Ag8.653. Un clon de hibridoma (C-11), cuyo sobrenadante exhibió actividad de unión de IGF-1R, pero no IR, fue aislado y ampliado en cultivos para obtener el anticuerpo de ratón designado R1 o mR1.
Generación de CR1
quimerización de R1 para obtener CR1 se realizó como sigue. El V
H y V
K genes de R1 se clonaron por 5'-RACE. Las secuencias de ADN de los V
H y V
genes K clonados se determinaron con la autenticidad confirmada por secuenciación N-terminal de proteína que mostró una coincidencia exacta de los primeros aminoácidos 15 N-terminal con los correspondientes aminoácidos deducidas a partir de secuencias de ADN (Tabla S2). El V clonada
H y V
K genes se insertaron en el
pdHL2 Gráficos vectoriales para generar
cR1pdHL2
, que se utilizó para transfectar células SPE-26, una variante ofSp2 /0-Ag14 desarrollado internamente. Los transfectantes se seleccionaron con 0,075 M de metotrexato (MTX), y se criban por ELISA para actividades de unión de Fc humanos. Más altos que producen clones se ampliaron aún más para obtener los dos mejores clones (709.2D2 y 710.2G2), de los cuales CR1 fue producida en cultivos discontinuos y se purifica mediante cromatografía de Proteína A.
Generación de hR1
Humanización [48] de CR1 a hR1 se logró mediante el injerto de las CDR en las regiones marco humanas de hMN-14. Para ciertas posiciones de la estructura, los residuos murinos de R1 fueron retenidos, lo que resulta en las secuencias de aminoácidos de hR1 V
H (Figura S1A) y hR1 V
K (Figura S1B). genes sintéticos que codifican hR1 V
H y hR1 Vk fueron diseñados en
pdHL2
para obtener
hR1pdHL2
, el vector de expresión para hR1. Los esfuerzos posteriores para asegurar el clon de producción (711.3C11) para hR1 fueron similares a los descritos anteriormente para CR1, excepto que se seleccionaron los clones positivos para las actividades de unión a ambos Fab humana y rhIGF-1R.
Generación de Hex -hR1 por DNL
C
H1-DDD2-Fab-hR1 y C
H3-AD2-IgG-hR1 se produjeron como proteínas de fusión en células SpESF [49] transfectadas con los vectores respectivos como descrito para C
H1-DDD2-Fab-hA20 y C
H3-AD2-IgG-hA20 [50]. Hex-hR1 se obtuvo como sigue. C
H1-DDD2-Fab-hR1 se mezcló con C
H3-AD2-IgG-hR1 en solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4, con EDTA 1 mM, en una relación molar de 4,2 para efectuar la conjugación de la mayoría, si no todos, C
H3-AD2-IgG-hR1 a C
H1-DDD2-Fab-hR1, reduciendo así el potencial de co-purificación de C
H3-AD2-IgG hR1 con el producto final a cromatografía en columna de proteína A. La reacción DNL se inició mediante la adición de glutatión reducido (GSH) a 1 mM, seguido de la adición de glutatión oxidado (GSSH) a 2 mM en el día siguiente, y después de una incubación adicional durante la noche, Hex-hR1 fue purificado de la solución resultante por la proteína una cromatografía.
Pureza, Tamaño y análisis de masas
cromatografía líquida de alta resolución de exclusión por tamaño (sE-HPLC) se realizó en un modelo de oro Beckman System 116 con un Biosep-SEC-s3000 columna (300 x 7,80 mm) de Phenomenex utilizando 0,04 M PBS (pH 6,8) más EDTA 1 mM como fase móvil para determinar la integridad y pureza del producto molecular de mAbs y HexAbs. Los diámetros hidrodinámicos promedio de hR1 y Hex-hR1 se determinaron mediante dispersión dinámica de luz (DLS) con un contrato para Microtrac. tiempo de ionización por electrospray de vuelo (ESI-TOF) cromatografía líquida /espectrometría de masas (LC-MS) se realizó en un HPLC 1200 de la serie, junto con un TOF MS 6210 (Agilent Technologies). Brevemente, hR1 o Hex-hR1 se redujo con tris 50 mM (2-carboxietil) fosfina para 30 min y se resolvieron por HPLC de fase inversa (RP-HPLC), utilizando un gradiente de 20 min de 30 a 80% de acetonitrilo en 0,1% acuosa ácido fórmico con una columna C4 Jupiter 5μ (Phenomenex). Para el TOF MS, las tensiones capilares y fragmentador se establecieron para 5500 y 250 V, respectivamente.
Competencia Estudios de unión
homogéneos perlas de microesferas de poliestireno recubiertas con rhIGF-1R para servir como sustitutos de las células que expresa IGF-1R se utilizaron en todos los estudios de unión de competencia. Para comparar la afinidad de unión, variando las concentraciones de no marcado mR1, CR1, y hR1 se mezclaron con una cantidad constante de CR1 marcado con Alexa Fluor 532 (532-CR1). Las perlas recubiertas se añaden a una densidad final de 2 × 10
5 partículas /ml y las mezclas se incubaron a temperatura ambiente (RT) durante 1 h con agitación suave. El límite 532-CR1 se determinó midiendo la intensidad de fluorescencia media (MFI) de 2.000 granos en un sistema PCA Guava (Millipore)
.
Para determinar si CR1 puede bloquear la unión de IGF-1 o IGF-2 a IGF-1R, concentraciones variables (0 a 670 nM) de CR1, IGF-1, o IGF-2 se mezclaron con una cantidad constante de
125I-IGF-1 o
125I-IGF-2. Después se añadieron las perlas recubiertas, se incubaron a TA durante 1 h con agitación suave, se lavó, y se contó la radiactividad.
para sondear la región de unión de hR1 en IGF-1R, un panel de disponible en el mercado anti-IGF mAbs -1R, con sus epítopos a IGF-1R mapeados (excepto MAB391), se evaluaron como competidores para bloquear hR1 de la unión a las perlas recubiertas con rhIGF-1R. En estos experimentos, R1, CR1, HR1, MAB391, 24-60, y αIR-3 fueron cada uno marcado con R-ficoeritrina (PE) y se incubaron con un anticuerpo sin marcar de interés a concentraciones variables.
La unión a Superficie celular IGF-1R
Cada muestra se preparó por duplicado para contener 2 × 10
5 células y 10 mg /ml de un anticuerpo de ensayo en un volumen final de 200 mL. Después de incubación a 4 ° C durante 45 min, las muestras se lavaron dos veces con PBS-1% BSA, seguido de la adición de FITC-GAH IgG, (H + L), y de una incubación adicional a 4 ° C durante 45 min en el oscuro. a continuación, las muestras se lavaron dos veces con PBS-1% BSA, se resuspendieron en 500 l de formalina tamponada con PBS, y se analizaron en FACScan.
Ensayo de proliferación celular
Todas las incubaciones de células se realizaron a 37 ° C en un humidificado 5% de CO
2 incubadora. Las células fueron separadas con tripsina, se lavaron tres veces con PBS para eliminar cualquier rastro de suero, y se resuspendieron en un medio libre de suero que contiene 10 mg /ml de transferrina bovina (SFM-Trf). Las células se sembraron a 1,0 x 10
3 células /50 l /pocillo y se incubaron durante la noche. En el día después de cada artículo de prueba en SFM-Trf era 5 veces diluyeron en serie de 400 nM a 0,001 nM y 50 l de cada concentración se añadieron por triplicado a los pocillos de tal manera que las concentraciones finales del artículo de ensayo oscilan desde 200 nM a 0,0005 nm. Las células de control no tratados recibieron sólo 50 l de SFM-TRF. Después de incubación durante 1 h, los pocillos designados recibieron 100 l de cada artículo de prueba a la misma concentración en SFM-Trf que contiene 50 ng /ml de IGF-1. Las placas se incubaron a continuación durante un período de tiempo tal como se indica y se determinó el número de células viables en cada pocillo usando el ensayo de MTS por el protocolo del fabricante.
Colonia ensayo de formación de las células cultivadas en monocapa Cultura
DU 145 células se separaron con tripsina y se sembraron en placas de 60 mm (1 × 10
3 células) en 10% RPMI suplementado con 1% de penicilina /estreptomicina (P /S). se añadieron artículos de ensayo y de medio que contiene los artículos de prueba fue sustituido cada cuatro días, Después de 14 días, las células se fijaron en 4% para-formaldehído y se tiñeron con solución Giemsa al 5%. Colonias mayores de 50 células se enumeraron bajo un microscopio. En un experimento separado, artículos de prueba no se añadieron al medio posterior.
formación de colonias ensayo de células cultivadas en agar blando
agar basal (0,5%) se preparó mezclando 1% de agar ( a 40 ° C) con un volumen igual de 2 × 10% RPMI y se añadió a cada pocillo (0,5 ml) en una placa de 24 pocillos. Las células en 2 × 10% RPMI se mezclaron con un volumen igual de 0,7% de agarosa y se añadieron (0,5 ml) a la parte superior de la base de agar para el recuento final de células de 1.250 por pocillo en 0,35% de agarosa. Las células se alimentaron con 0,5 ml de 10% RPMI a cada pocillo semanal. pocillos tratados contenían los artículos de prueba en la capa de agarosa /célula en el comienzo y en alimentaciones posteriores. Una vez que las colonias eran claramente visibles por microscopía en pocillos de control no tratados, se retiró el medio y las colonias se tiñeron con cristal violeta. Se contaron las colonias con un microscopio y se determinó el número promedio de los cinco campos de vista diferentes dentro del pozo.
inmunotransferencia Análisis
A menos que se indique lo contrario, las células se mueren de inanición en medio libre de suero durante 24 h, se trató, y se lisaron a temperatura enfriada con hielo en un tampón como se especifica. Las concentraciones de proteína se determinaron por la proteína Bio-Rad de ensayo y las muestras (de 15 a 30 g cargados en cada carril) se separaron en 4-20% de geles de Tris-glicina, se transfirieron a membranas de nitrocelulosa o de PDVF, se bloquearon con tampón TBST (Tris 50 pH 8,0, NaCl 150 mM, 0,1% de Tween 20) que contiene 5% de leche sin grasa, se lavó con tampón de TBST y se incubaron durante la noche a 4 ° C con anticuerpos primarios. Las membranas se lavaron en TBST cuatro veces (una vez para 15 min y tres más de 5 min cada uno), se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con HRP durante 1 h a TA, se lavaron en tampón de TBST cuatro veces como se describió anteriormente, a continuación, se detecta con Super señal West Dura ampliada Duración Substrato (Thermo Scientific) de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante. Las señales de inmunotransferencia se visualizaron con un sistema de quimioluminiscencia (Thermo Scientific). Las imágenes digitales fueron procesadas por Carestream (Carestream Molecular Imaging).
La regulación por disminución del IGF-IR
Las células en RPMI 10% fueron sembradas a 1 × 10
6 por 100 mm y plato cultivaron durante la noche para la fijación. En el día siguiente, el medio se sustituyó con RPMI 10% que contiene un artículo de prueba de interés a concentraciones y las células indicadas se incubaron adicionalmente durante 24 h o un tiempo predeterminado. Para el análisis por Western blot, las células tratadas se lavaron con PBS frío, rasparon de los platos, recogieron y se centrifugaron a 4 ° C a 2.000 rpm durante 5 min. Células sedimentos se lisaron durante 10 min en hielo en tampón RIPA o un tampón consistente en Tris 25 mM (pH 8), NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, 1% de Triton y 1 x completo, libre de EDTA inhibidor de la proteasa Cocktail (Roche Diagnostics ). Los lisados se clarificaron por centrifugación, se ensayó la concentración de proteína, y se analizaron por inmunotransferencia. Para el análisis por citometría de flujo, las células tratadas se lavaron en PBS dos veces, se incubaron con marcado con PE 1H7 durante 1 h, se lavaron dos veces con PBS, se resuspendieron en 500 l de PBS, y se analizaron en FACScan.
La fosforilación de IGF -IR y Akt
Las células (5 × 10
5 por pocillo) se cultivaron en RPMI 10% en placas de 6 pocillos durante la noche para la unión. Después de dos lavados con medio libre de suero, se incubaron las células durante 4 h en medio libre de suero y se trataron con artículos de prueba a las concentraciones indicadas durante un tiempo especificado. Las células fueron entonces estimuladas con IGF-I durante 10 min, se lavaron con PBS, se lisaron con 200 l de tampón RIPA durante 5 min a RT, y se procesaron para análisis de inmunotransferencia.
Matrigel Invasion Ensayo
el protocolo del fabricante en BD BioCoat ™ Matrigel Cámara Invasion ™ (BD Biosciences) se siguió, utilizando el formato de 24 pocillos, que proporciona 12 inserciones, cada uno con una membrana de tamaño de poro de 8 m con una capa delgada de MATRIGEL membrana basal Matrix. Antes de uso, el conjunto de 24 pocillos fue retirado de almacenamiento a -20 ° C y se dejó calentar a TA. El interior de los insertos y el fondo de los pocillos se rehidrata con agua caliente (37 ° C) medio de cultivo a base de bicarbonato de 2 h, y cuidadosamente eliminado. Las células (0,5 ml en 5 × 10
4 /ml) en medio libre de suero se colocaron en la pieza de inserción (cámara superior) y el pozo (cámara inferior) se llenó con 0,5 ml de 10% RPMI. Después de 2 h, se añadieron artículos de ensayo a las células en la cámara superior y la incubación continuó durante 20 h, momento en el que las células de tiempo que permanecieron en el Matrigel o unidos a la parte superior de la membrana se retiraron con puntas de algodón. Las células en el lado inferior de la membrana se fijaron en metanol, se tiñeron con cualquiera de tinción de Wright-Giemsa o Hoechst 33258, y se examinan bajo un microscopio de fluorescencia.
microscopía de inmunofluorescencia
células cultivadas en cubreobjetos se se lavó, se fijaron con formalina al 4%, se lavaron, se incubaron con anticuerpos primarios durante 1 h a TA, se lavaron con PBS, y se hicieron reaccionar con FITC o TRITC-anticuerpos secundarios conjugados a TA durante 40 min. Después del lavado, las muestras se tiñeron con Hoechst 33258, montados, y se examinan bajo un microscopio de fluorescencia.
Eficacia in vivo
Femenino 8 semanas de edad, los ratones SCID (Taconic Farms) se utilizaron. Cada ratón se inyectó s.c. con 5 × 10
6 RH-30 células. Una vez los tumores alcanzaron aproximadamente 0,2 cm
3 de tamaño, los animales se dividieron en seis grupos de 10 ratones cada uno y se inyectaron i.p. dos veces por semana durante cuatro semanas con hR1 (1 mg), Hex-hR1 (0,82 mg), rapamicina (5 mg /kg), hR1 (1 mg), además de la rapamicina (5 mg /kg), Hex-hR1 (0,82 mg) más rapamicina (5 mg /kg), y solución salina (que contiene 2% de DMSO), respectivamente. Una solución madre de la rapamicina se preparó en solución salina (que contiene 2% de DMSO) a 1 mg /ml y 100 l se administraron a cada ratón por inyección. Los tumores se midieron y pesaron los ratones dos veces por semana. Los animales fueron sacrificados cuando los tumores alcanzaron 2 cm
3. Un segundo estudio para comparar la eficacia de hR1 y Hex-hR1 dado a dosis equivalentes molares (0,33 mg vs. 0,82 mg) también se realizó. Los protocolos para los estudios con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales y el empleo CMMI Institucional.
Análisis estadístico
Para los estudios in vitro, la diferencia estadística entre dos poblaciones se determinó por el estudiante de
t
-test. El análisis estadístico para los datos de crecimiento del tumor se basa en el área bajo la curva (AUC) y la mediana de supervivencia utilizando una de dos colas
t
-test para evaluar la significación entre los diversos grupos de tratamiento y los controles, excepto la solución salina control, por lo que una de una cola
se utilizó t-test
. Las curvas de supervivencia se analizaron mediante gráficos de Kaplan-Meier (análisis de log-rank), utilizando el paquete de software GraphPad Prism (v4.03; Advanced Graphics Software, Inc.). Un valor de
P Hotel & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Resultados
Propiedades notables de R1, CR1 y hR1
El R1 parental se muestra. para inhibir parcialmente la unión de
marcado con 125I IGF-1 (
125I-IGF-1) a la línea humana de células de cáncer de mama MCF-7L (una sublínea de MCF7) comparable a MAB391 (Tabla S3). Quimerización de R1 pareció mejorar la afinidad de R1 para rhIGF-1R inmovilizado sobre perlas de poliestireno, como se muestra mediante un ensayo de competición en la que la unión de R1 marcado con una sonda fluorescente (Alexa 532) se midió por citometría de flujo en presencia de la variación concentraciones de CR1 o R1 (figura S2). Los anticuerpos producidos por los dos clones de CR1 mostraron la misma afinidad de 0,1 nM (Figura S3) y eran específicos para inmovilizada rhIGF-1R pero no inmovilizados Rhir (figura S4). Sin embargo, CR1 no pudo bloquear la unión de IGF-1 o IGF-2 a inmovilizada rhIGF-1R en el ensayo de talón (Figura S5), al contrario de la observación anterior de que su homólogo murino podría inhibir parcialmente la unión de
125I IGF-1 a las células MCF-7L. humanización éxito fue demostrado por la potencia equivalente de hR1 y CR1 para competir con 532-CR1 para la unión a perlas inmovilizadas-1R-rhIGF (Figura S6). Por otra parte, el ensayo de bolas también mostró hR1 fue ineficaz en la inhibición de la unión de
125I-IGF-1 a la inmovilizada rhIGF-1R (Figura S7). Basándose en los resultados de los experimentos de bloqueo cruzado (Tablas 1 y 2), el epítopo de hR1 se dedujo a residir entre el restos de aminoácidos 185 y 222 en la primera mitad del medio del dominio rico en cisteína. Curiosamente, aunque MAB391 no tuvo ningún efecto sobre la unión de R1 marcado con PE para inmovilizado rhIGF-1R (Figura S8A), R1 reducido sustancialmente la unión de MAB391 marcado con PE (Figura S8B), lo que sugiere que R1 puede inhibir la unión de MAB391 a inmovilizada rhIGF-1R alostérica.
Caracterización molecular de hR1 y Hex-hR1
Los perfiles SE-HPLC y DLS de hR1 y Hex-hR1 mostradas en la Fig. 1A y 1B, respectivamente, indican su alto grado de homogeneidad. Para hR1, se observó un solo pico a 8,51 min. Hex-hR1, que comprende un par de dímeros estabilizadas de hR1 Fab adjuntas a un hR1 IgG completo en los extremos carboxilo de las dos cadenas pesadas, también muestra sólo un pico principal a 7,43 min. Los tamaños de partícula de hR1 y Hex-hR1 eran en gran parte monodispersa, con los diámetros hidrodinámicos promedio de 10.34 y 15.83 nm nm, respectivamente.
Como se muestra en la Tabla 3, la masa de cada uno de los polipéptidos que comprenden hR1 y Hex-hR1 determinados por LC /MS era consistente con la masa calculada a partir de su secuencia de aminoácidos deducida y predijo modificaciones postraduccionales, incluyendo glicosilación ligada a N y piroglutamato amino-terminal de la cadena pesada de hR1 y Hex-hR1, y la cadena Fd-DDD2 de Hex-hR1. Por tanto hR1 y Hex-hR1, la
kappa
cadena, que no se altera, dio una masa casi idéntica observada dentro de 20 ppm de la masa predicha. Para hR1, la cadena pesada se detectó como varias isoformas, incluyendo los de las variantes de lisina carboxilo-terminal y diversas glicoformas. Para Hex-HR1 la cadena pesada AD2 fusionados estaba intacta, con predominantemente G0F y G1F glicoformas. El componente hR1-FD-DDD2 de Hex-hR1 también coincidió con el de la masa prevista de 0,1 ppm, sin necesidad de modificaciones postraduccionales adicionales además del piroglutamato amino-terminal.
La expresión de IGF 1R en cáncer diversas líneas celulares
vinculante por hR1 y Hex-hR1 positiva se demostró en MCF7 (cáncer de mama), DU 145 (cáncer de próstata), ME-180 (cáncer cervical) y RH-30 (rabdomiosarcoma) mediante citometría de flujo (Tabla 4). Basado en la intensidad de fluorescencia mediana observado (MFI), los niveles de expresión de IGF-1R variaron entre estas cuatro líneas celulares, con la abundancia relativa del receptor en RH-30 aumentaron casi 2 veces en DU 145 o ME-180, y alrededor de 3 veces en MCF7. En vista de la cantidad de superficie de IGF-1R por célula que las indicadas para RH-30 [51] y MCF7 [52] para ser 20.600 y 43.000, respectivamente, habría un aumento de 2,3 veces en MCF7 en comparación con RH-30 , lo que concuerda bien con el aumento de 3 veces estimada a partir de los datos de las IFM. Higo. Como se muestra en la Fig. Como se muestra en la Fig. Como se muestra en la Fig.