Extracto
El cáncer y los tratamientos pueden inducir alteraciones cognitivas en pacientes con cáncer, y la relación de causalidad entre la quimioterapia y los trastornos cognitivos fue validado recientemente en modelos animales. Nuevas terapias dirigidas contra el cáncer se han utilizado ampliamente, y su impacto en las funciones del cerebro y la calidad de vida, hay que explorar. Se evaluó el impacto de everolimus, un agente contra el cáncer dirigidas a la vía mTOR, de las funciones cognitivas, el metabolismo cerebral, y la proliferación de células del hipocampo densidad /vascular en ratones. Los ratones adultos recibieron everolimus al día durante 2 semanas, y las pruebas de comportamiento se realizaron a partir de 1 semana después del último tratamiento. ratones tratados con everolimus muestran una marcada reducción en la ganancia de peso desde el último día del período de tratamiento.
Análisis ex vivo
mostró alterado la actividad citocromo oxidasa en regiones cerebrales involucradas selectivos en el balance energético, la ingesta de alimentos, la recompensa, el aprendizaje y la modulación de la memoria, la regulación del ciclo sueño /vigilia y excitación. Como la quimioterapia, everolimus no alteró actuaciones de reactividad, el aprendizaje y la memoria emocional, pero a diferencia de la quimioterapia, no afectó a la flexibilidad del comportamiento o la reactividad a la novedad.
In vivo
proliferación de las células neuronales del hipocampo y la densidad vascular también se mantuvieron sin cambios después de los tratamientos de everolimus. En conclusión, el tratamiento de everolimus dos semanas diariamente a la dosis clínica no provocó alteración del rendimiento cognitivo evaluados en tareas hippocampal- y la corteza prefrontal dependiente que persistir en una a cuatro semanas después del final de la finalización del tratamiento. Sin embargo, el tratamiento everolimus aguda causada modificaciones CO selectivos sin alterar la quinasa mTOR efector p70S6 en las regiones cerebrales implicadas en el comportamiento de alimentación y /o el ciclo de sueño /vigilia, al menos en parte bajo el control del núcleo solitario y la región parasubthalamic del hipotálamo. Por lo tanto, esta área puede representar un objetivo clave para modificaciones periféricas everolimus mediación, que ha sido previamente asociados con síntomas tales como pérdida de peso y fatiga
Visto:. Dubois M, Le Joncour V, MC Tonon, Anouar Y , Proust F, Morin F, et al. (2014) Evaluación del impacto de la terapia del cáncer Everolimus en el sistema nervioso central en los ratones. PLoS ONE 9 (12): e113533. doi: 10.1371 /journal.pone.0113533
Editor: David L. McCormick, IIT Research Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 17 Abril, 2014; Aceptado: 24 Octubre 2014; Publicado: Diciembre 1, 2014
Derechos de Autor © 2014 Dubois et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Universidad de Roue, Inserm y el centro Baclesse recibir una subvención por Novartis (Novartis) 071160-001141-05. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores han leído la política de la revista y tienen el siguiente conflicto: la subvención a la Centro baclesse de Caen, Francia, por Novartis (Novartis 071160-31 001141-05) fue una beca de formación general y se utilizó para apoyar un post-doc que dirige la investigación sobre everolimus. Además, los autores recibieron everolimus y la microemulsión a través de un MTA con Novartis. Pr Florencia Joly es un miembro de una junta científica consulta de Novartis. No hay más patentes, productos en desarrollo o los productos comercializados para declarar. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
A pesar de la aparición de potentes agentes contra el cáncer ha mejorado la supervivencia del paciente, existe una creciente evidencia de que el cáncer y sus tratamientos pueden inducir disfunciones cognitivas que afectan la calidad de la vida diaria. Los pacientes que reciben atención informe de la quimioterapia y alteraciones de concentración, déficit de memoria visual y verbal, y la ralentización del procesamiento psicomotora (referidos como "chemofog" o "quimiocerebro") que puede persistir durante varios años después de la finalización del tratamiento [1]. En los últimos años, agentes dirigidos se han utilizado cada vez más en el tratamiento del cáncer, y los informes anteriores sugieren que algunos de ellos pueden permear la barrera sangre-cerebro y actuar directamente en el cerebro, que afecta a la angiogénesis cerebral y el funcionamiento [2]. Consistente con esta hipótesis, la administración de bevacizumab en pacientes con cáncer colorrectal metastásico y sunitinib en pacientes con cáncer renal metastásico se presentaron varios casos de leucoencefalopatía posterior comunicado [3], [4]. Por otra parte, una fatiga inexplicable o astenia, asociado con los tratamientos de cáncer específicos, que no puede ser contrarrestado por el descanso o el sueño pueden afectar gravemente tanto la función cognitiva y calidad de vida [5].
El fosfatidilinositol-3-quinasa (PI3K ) /AKT /objetivo mamífero de la rapamicina (mTOR) cascada de señalización es una diana molecular clave para el tratamiento del cáncer [6]. componentes de señalización mTOR se expresan en niveles altos en varias áreas del cerebro [7], [8], y se conoce la vía de mTOR estar implicado en diversos procesos neurobiológicos, incluyendo el crecimiento de neuritas [9], axón de regeneración [10], la mielinización [11], y el metabolismo celular [12]. En particular, mTOR se ha demostrado que es un regulador central de crecimiento de las células y es controlado por un gran número de señales incluyendo nutrientes tales como glucosa y aminoácidos, y factores de crecimiento tales como la insulina y el IGF-1. activación de mTOR también estimula la síntesis de proteínas y la hipertrofia celular en diferentes células y órganos. Además, la activación de mTOR está implicado en la plasticidad sináptica del hipocampo y de aprendizaje y memoria procesos
a través de
síntesis de proteínas [13]. Por ejemplo, la inhibición de la actividad de mTOR por la rapamicina se ha demostrado que el bloque de evitación inhibitoria memoria a largo plazo [14] y para deteriorar auditiva [15], el miedo [16], [17], y la consolidación de la memoria espacial [18]. Por otra parte, los defectos genéticos en Ras /ERK /PI3K /mTOR vías de señalización pueden estar vinculados causalmente a varios trastornos genéticos humanos clasificados como síndromes neuro-cardio-facial-cutáneas y hamartoma, y por lo tanto puede ser responsable de los deterioros cognitivos [19]. Por lo tanto, se puede proponer que la administración a largo plazo de los inhibidores de mTOR se producen en el tratamiento del cáncer podría afectar a las funciones del cerebro implicadas en la cognición y /o el metabolismo.
El everolimus (Afinitor, Novartis, Basilea, Suiza), un administró por vía oral derivado de rapamicina, bloquea directamente la actividad quinasa del complejo raptor /mTOR (mTORC1)
vía
unión a la FKBP-12 y formando así un complejo inhibidor de mTOR con [20]. Este tipo de inhibidor de mTOR está bien caracterizado por propiedades antineoplásicas,
es decir
inducir disminución del crecimiento de células tumorales, la proliferación y la angiogénesis
in vitro
y
in vivo [
,,,0],21] - [23]. Sin embargo, los efectos secundarios generales como fatiga, edema, astenia, pirexia, inflamación de la mucosa, anorexia, pérdida de peso y dolor se ha informado [24] - [27]. Más específicamente, se han descrito también en el sistema nervioso central (SNC) efectos secundarios como dolor de cabeza /migraña o disgeusia, [26].
El objetivo del estudio fue evaluar el potencial de funcionamiento cognitivo deterioro probabilidades de ser inducidos por las terapias dirigidas, como everolimus mediante el uso de un modelo de comportamiento del ratón validado [28]. En particular ganado la atención en la dosis utilizada con el fin de ser tanto como sea posible en las condiciones de tratamiento de pacientes con cáncer. De hecho, basado en farmacocinéticos /estudios dinámicos [29] - [31] el más adaptado y se indica la dosis de la hormona avanzado positivo para el receptor, el cáncer HER2 negativo de mama, tumores neuroendocrinos avanzados de origen pancreático, el carcinoma de células renales avanzado, angiomiolipoma renal con esclerosis tuberosa compleja (TSC) es 10 mg /día, pero en el caso de la toxicidad, la dosis sugerida es de 5 mg /día. Además, un número de estudios se llevaron a cabo en modelos animales con este 5 mg /administración diaria [22], [32], [33] y los estudios demostraron que esta dosis everolimus es activo por vía oral en ratones y que el estado de equilibrio alcanzado dentro de dos semanas con dosificación diaria [22]. Este 5 mg /kg /d cronograma parece ser la concentración mínima para la dosis máxima eficiencia sin toxicidad aparente.
Los posibles efectos a largo plazo del tratamiento con everolimus en ratones cognición y los procesos neurobiológicos se evaluaron utilizando hippocampal- y la corteza frontal dependiente de tareas conductuales y en la proliferación de células del hipocampo, o la densidad de nicho vascular respectivamente. Se investigó sus efectos agudos sobre la actividad de las células neuronales
ex vivo a través de
evaluación de la actividad del citocromo oxidasa cerebral regional.
Material y Métodos
Animales y declaraciones éticas
ratones macho C57BL /6J Rj (Janvier, Le Genest-Saint-Isle, Francia) 7 semanas de edad fueron alojados en condiciones ambientales controladas estándar: 22 ± 1 ° C; 5 animales por jaula; 12 horas /12 horas de luz /oscuridad ciclo (luz encendida: 00:00); agua y comida disponible
ad libitum
. Durante el período de 2 semanas de adaptación, los animales se manejan a diario para el control de peso. la administración del tratamiento comenzó cuando los ratones eran de 9 semanas de edad. Los ratones se pesaron diariamente desde el día de la primera ingestión de tratamiento al día 36a después de la última administración. El peso de los animales antes de la primera inyección (D0) se utilizó como el valor base para el cálculo de la ganancia de peso durante todo el experimento. Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con el Comité de Ética francés, así como las directrices de la Directiva del Parlamento Europeo 2010/63 /UE y el Consejo para la Protección de los animales utilizados para fines científicos. Este proyecto fue aprobado por el CENOMEXA "Comité d'Ethique Normandie en Materia de Experimentación Animale" en el marco del Comité Nacional de Experimentación Animal, y recibió el siguiente número N /11.12.12 /35 /11-17. manipulaciones con animales se llevaron a cabo bajo la supervisión de un investigador autorizado (H. Castel;. la autorización no 76.98 del Ministère de l'Alimentation, de l'Agriculture et de la Pêche)
La administración del fármaco
.
Una microemulsión de everolimus formulada a 2% (w /v), proporcionado por Novartis (Rueil-Malmaison, Francia), se disolvió en 0,9% de NaCl y se administró diariamente por sonda oral (5 ml /kg)
vía
una aguja de alimentación (Herramientas de Bellas Ciencia, Heidelberg, Alemania) a 5 mg /kg durante 14 días consecutivos [34].
actividad citocromo oxidasa y el metabolismo cerebral
Los ratones que recibieron vehículo (
n
= 8) o everolimus (
n
= 9) durante 2 semanas fueron sacrificados inmediatamente después del último día de tratamiento para estudiar la actividad citocromo oxidasa en varias regiones cerebrales. Los ratones fueron anestesiados utilizando isofluorano, decapitados, y sus cerebros se extrajeron rápidamente 24 horas después del último día de tratamiento, se congelaron en 2-metilbutano (Sigma-Aldrich, San Quintín Fallavier, Francia) a -30 ° C y almacenadas a -80 ° C hasta su uso. secciones de criostato, cada 30 micras de espesor, se cortaron de bregma +3.20 mm a -6,48 mm y se almacenaron a -20 ° C hasta su procesamiento. Para cada animal, se tomaron 8 lotes de 41 cortes consecutivos, tal como en una diapositiva 2 secciones fueron separados por 240 m.
Todos los cortes de cerebro de un lote por animal fueron procesados simultáneamente en las mismas condiciones. El protocolo fue adaptada de publicaciones anteriores [35], [36]. Las secciones se incubaron en la oscuridad (37 ° C, 50 minutos) en solución salina 0,1 M tamponada con fosfato (PBS) que contiene 120 mg de caballos corazón citocromo c, 24 g de sacarosa, 300 mg DAB-4-HCl, y 108 mg de catalasa ( Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, Francia) por 540 ml. Las rebanadas se lavaron (5 min) con tampón frío (10% de sacarosa en PBS), se sumerge durante 30 minutos en una solución de formalina /tampón 10%, y se lavaron dos veces (5 minutos) en tampón antes de la deshidratación. Las secciones fueron encubrimiento deslizaron con Eukitt (VWR International, Estrasburgo, Francia) y se examinaron microscópicamente.
El producto de la reacción histoquímica (DAB oxidado) era visible con el microscopio óptico. En cada área de interés, la intensidad de la tinción se midió mediante análisis densitométrico por medio de una estación de trabajo de análisis de imagen asistido por ordenador (SAMBA Technologies, Meylan, Francia) [37]. Para cada área de estudio, se utilizó un mínimo de 2 rebanadas por animal, dependiendo de la longitud anteroposterior de la región, con las mediciones realizadas de forma bilateral cuando sea posible. El fondo se sustrajo de cada diapositiva. Las diferentes regiones cerebrales fueron identificados por medio de los [38] atlas del cerebro del ratón y Franklin Paxinos.
Pruebas de comportamiento
En total, 14 ratones recibieron tratamiento everolimus y 12 ratones recibieron sólo el disolvente (vehículo grupo) durante 2 semanas. las pruebas de comportamiento comenzó 7 días después de la última administración del tratamiento y duró 23 días (Fig. s3a). Todos los experimentos se llevaron a cabo 13:00-18:00, durante el inicio de la fase activa de los animales.
Las funciones cognitivas se evaluaron utilizando el laberinto de agua de Morris, en la que se requieren los ratones para escapar de un depósito de agua mediante la búsqueda de una plataforma colocada en la piscina [39]. Un tanque cilíndrico (diámetro 93 cm, altura 45 cm) se llenó con agua (mantenido a 23 ± 1 ° C) a una altura de 40 cm, que estaba cubierta con, emulsión blanca inerte, acrílica acuosa (Accusol OP 301, Punto de vista, Francia ). El depósito se colocó en una habitación iluminada (50 lux en la superficie central de la piscina) con señales extra-laberinto en las paredes. El laberinto de agua se divide en cuatro cuadrantes virtuales: noroeste (NW), noreste, sureste, y al sur-oeste, y animales comportamientos fueron rastreados vídeo. El día 1, los animales se familiarizaron con la piscina y su motivación y habilidades viso-motoras evaluados. Una plataforma de escape (diámetro 9,7 cm) se colocó en el centro del tanque, emergiendo 1 cm por encima de la superficie del agua y con una pequeña bola negro fijo en él con el fin de facilitar su visualización por parte de los animales. Los ratones fueron colocados en la plataforma durante 20 segundos. Inmediatamente después, que comprende de 1 sesión de cuatro ensayos de 60 segundos (intervalo entre ensayos: 30 minutos) se llevó a cabo. Los animales fueron colocados cara a la pared, a la 1 de 4 ubicaciones de partida (norte, sur, este u oeste) y se dejaron nadar hasta la plataforma visible durante un máximo de 60 segundos. Los ratones no encontrar la plataforma se colocan manualmente sobre ella durante 20 segundos. En los días 2-5, habilidades de aprendizaje espacial se evaluaron en una fase de entrenamiento de 4 pruebas diarias, máximo de 60 segundos cada uno, en el que se colocó la plataforma de escape en el cuadrante NW, inmerso 1 cm por debajo de la superficie del agua. 2 horas después de la prueba final del último día del período de entrenamiento, una prueba de la sonda se llevó a cabo mediante la eliminación de la plataforma y permitir que los animales nadar durante 60 segundos, con el tiempo pasado en el cuadrante previamente correcta (NO) medido. capacidades de memoria espacial se evaluaron en una fase de recuperación en el día 10, usando una sola sesión de 4 ensayos en las mismas condiciones que la fase de entrenamiento. plasticidad aprendizaje se evaluó en una fase de transferencia de más de 4 días sucesivos (4 ensayos /día, máximo de 60 segundos cada uno), cambiando la ubicación diaria plataforma oculta. Distancia cruzó y escapar de latencia se midieron.
proliferación de las células del hipocampo, la densidad vascular y fosforilada de la quinasa p70S6 immunolabeling
5-bromo-2-desoxiuridina (BrdU) marcado con células dentro y fuera de la zona subgranular del hipocampo (SGZ) fueron contados. Para marcar las células generadas por los adultos en el giro dentado del hipocampo, 6 inyecciones intraperitoneales (50 mg /kg) de BrdU (Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, Francia) se administraron durante los últimos días del período de tratamiento en ratones no en proceso de evaluación del comportamiento (Fig. S3C). Al día siguiente de la última sonda, y 3 horas después de la inyección-BrdU, los ratones fueron anestesiados utilizando isofluorano, decapitado, y sus cerebros rápidamente removido, congelado en 2-metilbutano (Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, Francia) a -30 ° C y se almacena a -80 ° C hasta su uso. Los cerebros se cortaron con un criostato en secciones coronales seriadas (espesor de 20 micras) de la parte anterior del hipocampo dorsal (anteroposterior, 1,20 mm de la bregma -1,44 mm). Cada sección 12, cada uno separado por 240 m, se montaron en portaobjetos recubiertos con gelatina alumbre-cromo y almacenadas a -20 ° C hasta su procesamiento
.
Seis secciones de hipocampo de cada uno de 4 animales por grupo fueron teñidas simultáneamente para la visualización de BrdU. cortes de cerebro se fijaron (paraformaldehído al 4% en PBS, se lavaron 3 x 5 minutos con PBS pH 7,4, y se incubaron (2 N HCl; 45 ° C; 45 minutos) para desnaturalizar el ADN y luego las secciones se lavaron (PBS, 3 x 5 minutos). , se incubaron durante 1 hora en una solución que contiene suero normal de burro 01:50, 1% de albúmina de suero bovino y 0,3% de Triton X-100 (VWR International, Estrasburgo, Francia) en PBS, el bloqueo y se incubaron durante la noche a 4 ° C con anti ovejas -BrdU inmunoglobulina G. (IgG; Abcam, París, Francia) a 1:400 en solución de bloqueo Posteriormente, las secciones se lavaron (PBS, 4 x 5 minutos) y se incubaron (2 horas, temperatura ambiente) con Alexa contra burro conjugado 488 -sheep IgG (Invitrogen, Boulogne-Billancourt, Francia) a 1:400 en PBS. se enjuagan las secciones de cubierta se deslizaron con Mowiol. Las secciones se examinaron en un microscopio Nikon Eclipse E600 (Nikon Instrumento, Champigny-sur-Marne, Francia) interconectado con el software de Mercator (ExploraNova, la Rochelle, Francia). Un método modificado imparcial estereológicos se utiliza para contar las células BrdU-positivas en la SGZ del giro dentado y en el área exterior de la SGZ [40], [41]. El número de células teñidas en 6 secciones se contó bilateralmente, y, como se usa cada sección 12, este número se multiplicó por 12. Todos los recuentos se realizaron por un investigador ciego al grupo de tratamiento.
Para la investigación de hipocampo densidad nicho vascular, secciones de cerebro se fijaron, se lavaron y se incubaron como se describe anteriormente. El anticuerpo primario fue de conejo anti-IQGAP1 (H-109) (Santa Cruz Biotechnology, Inc., tebu-bio, Le-Perray-en-Yvelines, Francia) diluido en solución de bloqueo 1:400, y el anticuerpo secundario fue Alexa 488 conjugado con burro anti-IgG de conejo a 1:400 en PBS. Las secciones se contratiñeron con DAPI marcador nuclear (1 mg /ml). La inmunofluorescencia se observó con un microscopio confocal y estructuras marcadas con IQGAP1 en la SGZ evaluado en 3 secciones separadas por 240 micras (entre bregma -1,68 mm y -2.16 mm).
Para investigar las formas activas (fosforilada) de p70S6 quinasa (p-p70S6K), las secciones del cerebro de vehículo y los ratones de everolimus tratados se fijaron, se lava, y la expresión de P-p70S6K se midió por medio del anticuerpo primario anti-p-p70S6K (Abcam ab60948, Paris, Francia) diluidas 1:200 en solución de bloqueo, y el anticuerpo secundario fue Alexa burro 488 conjugado con IgG anti-conejo en 1:400 en solución de bloqueo. estructuras marcadas con P-p70s6k se evaluaron en 2 o 3 secciones separadas por 240 micras (entre bregma -0,98 mm y -1.70 mm de arco, Re, Rh, submed, VM; entre -1.22 y -1.94 mm mm para PE, etc. y PRH;. entre -2.06 y -2.54 mm mm para PSTH) con Nikon Eclipse E600 microscopio Nikon (Instrumento, Champigny-sur-Marne, Francia) interconectados con el software de imágenes NIS-Elements
Cultura de la madre neurales células endoteliales y células
Para el cultivo de células madre neurales (NSC), el cerebro de ratones recién nacidos C57BL /6J Rj se lavaron en tripsina. La suspensión de células se centrifugó a 100 g durante 4 minutos, y las células se colocaron en medio libre de suero fresco. Este medio consistía en Neurobasal (100 ml, Gibco, Saint-Aubin, Francia) suplementado con tampón HEPES 5 mM (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Francia), 1 ml B27 y 1 suplemento de crecimiento ml N2 (Gibco), 20 l factor de crecimiento epidérmico (20 ng /mL; Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Francia), 10 l de factor de crecimiento de fibroblastos básico (10 ng /mL; Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Francia), y 7,32 l de heparina (Sigma Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Francia) y se añadió con glucosa 33 mM. Las células se sembraron a una densidad de 100 células por microlitro viables en este medio y se cultivaron en 25 cm
2 frascos a 37 ° C en un 5% de CO
2-95% de aire humidificado incubadora. En el día 7, se recogieron neuroesferas bien desarrollados y se digirieron en tripsina durante 10 minutos a 37 ° C. neuroesferas secundarios (p
1) y posteriores pasajes fueron generados por disociación mecánica y enzimática de neuroesferas primarias. Las células fueron incubadas en ausencia o en presencia de vehículo o everolimus durante 24 a 48 horas. El uso de un objetivo de una Nikon (Nikon Eclipse TS100, Kingston, Inglaterra) microscopio invertido 4 ×, se midió el diámetro medio de 20 neuroesferas elegidos al azar por pocillo (& gt; 40 micras de diámetro) en el campo visual en 4 diferentes áreas de 3 pocillos de placas de cultivo de 24 pocillos.
Para el cultivo de las células endoteliales, se utilizó el antígeno del tumor de tamaño medio poliomavirus (mT) de cerebro de ratón línea celular endotelial capilar-transformado (bEnd.3, obtenido del Dr. D. Gorecki de la Universidad de Portsmouth, Inglaterra). Las células fueron cultivadas en glucosa alta (4,5 g /L) que contienen de Dulbecco modificado medio de Eagle suplementado con bicarbonato de 1,5 g /L de sodio, 100 U /ml de penicilina, 100 mg /ml de estreptomicina y suero bovino fetal al 10% (FBS) al 37 ° C con 5% de CO
2. Para determinar la supervivencia y la proliferación celular, las células se sembraron por triplicado en múltiples conjuntos de placas de cultivo de 12 pocillos. La incubación ± vehículo /everolimus durante 24-48 horas estaba en medio de FBS-libre. La proliferación celular se cuantificó contando el número de células por vía electrónica (Z2, Beckman Coulter, Villepinte, Francia).
El análisis estadístico
actuaciones
ganancia de peso corporal y el aprendizaje espacial fueron analizados por ANOVA de 3 vías con repitió mediciones seguidas por la mínima diferencia significativa (LSD) análisis post hoc cuando eran necesarios. Para la prueba de la sonda del laberinto acuático de Morris, el tiempo pasado en el cuadrante donde se encuentra la plataforma se comparó con la predicha por casualidad a través de χ
2 pruebas. Otros datos sobre el comportamiento, inmunohistoquímica y datos de actividad del citocromo oxidasa se analizaron con el estudiante
t
pruebas. Estos datos se analizaron con Statistica 5.1 ©. Los datos de la proliferación de células del hipocampo y los datos de los estudios de cultivo fueron analizados con el no paramétrico de Mann-Whitney U-test y ANOVA de Kruskal-Wallis seguido de pruebas de Dunn con GraphPad Prism 5. Para todas las pruebas estadísticas, el umbral de significación se fijó en
p
≤.05.
resultados
Everolimus inducida por alteraciones de aumento de peso
en primer lugar, evaluamos las consecuencias de una inhibición de mTOR crónica sobre el peso corporal en ratones. La administración de everolimus (5 mg /kg) diariamente a ratones jóvenes mediante sonda durante 2 semanas no produjo morbilidad y /o mortalidad aparente. Mientras que el grupo de control (emulsión) continuó ganando peso en el transcurso del experimento, los ratones tratados con everolimus había reducido peso (tratamiento × interacción día: F
23552 = 8,29,
p & lt ;.
001) desde el día 17rd después de la introducción del inhibidor de mTOR, y continuaron a pesar menos a lo largo del siguiente período experimental (LSD post hoc
p Hotel & lt; 0,01;. Fig. 1)
el peso corporal de los ratones tratados con vehículo y everolimus se evaluó a largo plazo después del final del período de tratamiento (barra gris). Los ratones recibieron vehículo o everolimus una vez al día durante 14 días continuos. Las barras representan el error estándar de la media. ANOVA, la interacción tratamiento x día
p Hotel & lt; 0,001, seguido de LSD post hoc: **
p Hotel & lt; 0,01, ***
p & lt ;.
001.
efectos a corto plazo de everolimus en la actividad de la citocromo oxidasa cerebral y p70S6 quinasa phosphotylated forma
con el fin de evaluar el impacto del inhibidor de mTOR en el metabolismo de las células cerebrales, un histoquímica análisis revela actividad de la oxidasa del citocromo se ha realizado en rodajas de cerebro de ratones control y tratados (Tabla 1). En los ratones tratados con everolimus, 4 días después del final del período de tratamiento, una disminución significativa (
p
& lt; 0,05) de la actividad de la citocromo oxidasa estaba presente en la parte de la carcasa del núcleo accumbens (t
13 = 2,52), la corteza prelimbic (t
15 = 2,20), el área preóptica lateral (t
14 = 2,33) y el núcleo trigeminal motor (t
13 = 2,38). Además, el tratamiento everolimus produjo un aumento de la actividad metabólica en la corteza ectorhinal (t
14 = -2,61), el núcleo entopeduncular (t
13 = -2,27), el núcleo parasubthalamic del hipotálamo (t
14 = -2,91), el núcleo solitario (t
13 = -2.49), y en las reuniens del tálamo (t
14 = -2.48), romboide (t
14 = -2,31), submedius (t
14 = -2.30) y ventromedial (t
14 = -2.56) núcleos (todo el
p Hotel & lt; 0,05) (figura 2A y en la Tabla 1).. Con el fin de investigar el potencial de inhibición directa o indirecta de mTOR en estas áreas del cerebro, la actividad de un efector aguas abajo de la vía de mTOR se evaluó por los niveles de immunostained de la fosfo-p70S6 quinasa (p-p70S6K) en varias zonas del cerebro que exhibe o no CO cambios metabólicos. El tratamiento no modificó significativamente etiquetado p70S6K-positiva en la corteza ectorhinal, núcleo entopeduncular, reuniens, romboide, núcleos talámicos ventromedial y submedial y el núcleo parasubthalamic exhibiendo actividades CO modificados, así como en la corteza perirrinal y arqueada núcleo hipotalámico que no muestran cambios en actividades CO (Fig. 2B y C).
(a) la actividad de CO en áreas del cerebro de ratones tratados con vehículo y everolimus selectivos. (B) Imágenes representativas de fosfo-p70s6k (p-p70s6k) immunolabeling en la corteza, el núcleo entopeduncular, el tálamo y el hipotálamo de los ratones vehículo o everolimus tratados. (C) Media ciento de la superficie marcada con P-p70S6K (normalizado al vehículo) (+ SEM) en las diferentes áreas del cerebro. Arco: núcleo arqueado; Ect: corteza ectorhinal; EP: núcleo entopeduncular; PRH: corteza perirrinal; PSTH: parasubthalamic núcleo; Re: reuniens núcleo talámico; Rh: el núcleo talámico romboidal; Submed: núcleo talámico submedial; VM:. Ventromedial nuleus talámico
No alteración emocional y cognitiva después del tratamiento everolimus
El comportamiento emocional
Siete días después del final del período de tratamiento. , el porcentaje de entradas de mano abierta en el laberinto elevado en cruz (ver material y Métodos S1) no fue significativamente diferente entre los 2 grupos de tratamiento, lo que sugiere que el everolimus no afectó el comportamiento similar a la ansiedad (t
24 = 1,66,
p Hotel & gt; 0,05; Fig. S1 A). En la prueba de natación forzada, la duración de la inmovilidad no fue estadísticamente diferente entre los grupos, lo que indica que el everolimus no modificó el comportamiento de tipo depresivo (t
24 = 0,65,
p Hotel & gt; 0,05; Fig. S1B ).
aprendizaje espacial y la memoria.
Durante la fase de familiarización de la prueba del laberinto acuático de Morris, la velocidad de nado (t
24 = -0.69,
p & gt
; 0,05; no se muestra), la distancia atravesada (t
24 = 0,49,
p Hotel & gt; 0,05; no se muestra) y el tiempo necesario para encontrar la plataforma surgido (t
24 = 0,93 ,
p Hotel & gt; 0,05; Fig. 3A) no se modificaron significativamente por el tratamiento, lo que indica que la motivación y la capacidad viso-motor no se vieron afectados por el everolimus. Durante la fase de adquisición, everolimus no alteró el rendimiento del aprendizaje espacial de 15 días después del final del período de tratamiento, ya que la latencia de escape (F
1,24 = 0,94,
p Hotel & gt; 0,05; figura . 3B) y la distancia cruzados (F
1,24 = 0,32,
p Hotel & gt; 0,05; Fig. 3C) no fueron significativamente diferentes entre los grupos. Actuaciones mejoraron significativamente a medida que se repitió la prueba (latencia escapar F
3,72 = 18,38,
p Hotel & lt; 0,001 y la distancia cruzaron F
3,72 = 19,51,
p
& lt; 0,001). Durante la prueba de la sonda, todos los ratones pasaron significativamente más tiempo en el cuadrante previamente correcta de lo previsto por el azar (vehículo: X
2
11 = 117.67,
p Hotel & gt; 0,001; everolimus: X
2
13 = 231,80,
p Hotel & lt; 0,001; Fig. 3D). Durante la fase de recuperación, los ratones tratados con everolimus no mostró deterioro rendimiento de la memoria espacial, como su latencia de escape (t
24 = 0,49,
p Hotel & gt; 0,05; Fig. 3B) y la distancia cruzados ( t
24 = 0,40,
p Hotel & gt; 0,05; Fig. 3C) no difirió significativamente de los de los ratones de vehículos
() La motivación y las habilidades viso-motoras a después. vehículo o el tratamiento de everolimus (Estudiante
t
prueba,
p Hotel & gt; 0,05). (B y C) Durante el entrenamiento y la recuperación de las fases (R), la latencia (B) y la distancia cruzados (C) después de vehículo o el tratamiento de everolimus (ANOVA efecto, Día ***
p Hotel & lt; 0,001) . (D) Durante la prueba de sondeo, el tiempo dedicado por los animales de ambos grupos en el cuadrante donde se encuentra la plataforma durante la fase de entrenamiento (χ
2, ***
p Hotel & lt; 001
vs
azar). Durante la fase de transferencia, escapar de latencia (E), la distancia atravesada (F), y la velocidad de nado (G) en ratones con vehículo o tratadas everolimus (ANOVA efecto, Tratamiento *
p Hotel & lt; 0,05, prueba *** efecto
p Hotel & lt; 0,001, seguido de LSD post hoc
##
p Hotel & lt; 0,01). (H) Durante el 1er día de la fase de transferencia, el tiempo pasado en el cuadrante noroeste previamente correcta después de tratamiento con vehículo o everolimus (Estudiante
t
prueba,
p Hotel & gt; 0,05). Los datos son medias ± SEM
Durante la fase de transferencia de la prueba del laberinto acuático de Morris, los animales mejoraron sus actuaciones entre los ensayos (latencia de escape:. F
3,72 = 9,76,
p Hotel & lt; 0,001; cruzaron la distancia F
3,72 = 14,99,
p Hotel & lt; 0,001;. figuras 3E y 3F). Aprender plasticidad, evaluada por modificación diaria de la localización de la plataforma, no se vio afectada por el tratamiento; escapar de latencia antes de encontrar la plataforma oculta fue similar entre los grupos (F
1,24 = 3,36,
p Hotel & gt; 0,05; Fig. 3E). Sin embargo, la distancia recorrida por los ratones tratados con everolimus se incrementó significativamente en comparación con los ratones vehículo (F
1,24 = 6,08,
p Hotel & lt; 0,05; Fig. 3F). evaluación ANOVA reveló un tratamiento significativo × interacción juicio en términos de velocidad de nado (F
3,72 = 3,69,
p Hotel & lt; 0,05). LSD análisis post hoc indicaron que los ratones tratados con everolimus-nadó más rápido que los ratones de los vehículos durante el primer y tercer ensayos (
p Hotel & lt; 0,01; Fig. 3G). Durante el día 1 de la fase de transferencia, everolimus no alteró el tiempo empleado en el cuadrante que era correcto durante la fase de entrenamiento (T
24 = -0.39,
p Hotel & gt; 0,05; Fig. 3H ), lo que sugiere la ausencia de perseveración de comportamiento.
la actividad espontánea y la memoria de reconocimiento.
el everolimus no modificó locomotora espontánea y actividades verticales. La distancia cruzado y el número que se inclina no fueron significativamente diferentes entre los grupos de tratamiento (T
24 = 0,63,
p Hotel & gt; 0,05 y t
24 = 0,39,
p
& gt; 0,05, respectivamente;. S1C figuras y S1D). En la prueba de reconocimiento de objetos, animales de ambos grupos detectados novedad, con duraciones más largas de exploración de la novela objeto
vs
los familiares (vehículo: t
11 = -2,90,
p
& lt; 0,05; everolimus: t
13 = -4,51,
p Hotel & lt; 0,001; Fig S1E).. Como se muestra en la Fig. Higo.