Extracto
Antecedentes
Los tumores con frecuencia exhiben pérdida de genes supresores de tumores o ganancias alélicas de oncogenes activados. Una proporción significativa de loci de susceptibilidad al cáncer en el ratón muestran pérdidas somáticas o gana consistente con la presencia de una susceptibilidad tumor o alelo de resistencia. Por lo tanto, específicas de alelo ganancias o pérdidas somáticas en loci pueden demarcar la presencia de la resistencia o susceptibilidad alelos. El objetivo de este estudio fue determinar si previamente mapeado loci de susceptibilidad para el cáncer colorrectal muestran evidencia de eventos somáticos específicos de alelo en los tumores de colon.
Métodos
Se realizó la genotipificación cuantitativa de 16 polimorfismos de nucleótido único (SNPs) que muestra una asociación estadísticamente significativa con el cáncer colorrectal en estudios de asociación de genoma completo publicados (GWAS). Estamos genotipo 194 muestras de ADN tumoral colorrectal normal y pareadas y 296 pares de muestras de validación para investigar estos SNPs para las ganancias y pérdidas somáticos específicos de alelo. Se combinaron los análisis de nuestros datos con los datos publicados en siete de estos SNP.
Resultados
No se observó evidencia estadísticamente significativa para la selección somática específica de alelo para los polimorfismos analizados en el conjunto de descubrimiento. La
rs6983267
variante, que ha demostrado la pérdida preferencial del alelo no riesgo T y la ganancia relativa de la alelo de riesgo G en estudios anteriores, favorecido ganancia relativa del alelo G en las muestras de descubrimiento y validación combinado (corregido valor de p = 0,03). Cuando se combinaron los datos con los datos de desequilibrio alelo-específicas publicadas para este SNP, el alelo G de
rs6983267
mostró evidencia estadísticamente significativa de retención relativo (p-valor = 2,06 × 10
-4).
Conclusiones
Nuestros resultados sugieren que la mayoría de las variantes identificadas como alelos de susceptibilidad al cáncer de colon a través de GWAS no exhiben desequilibrio alelo-específicas somática en los tumores de colon. Nuestros datos confirman los resultados publicados anteriormente que muestran un desequilibrio específico de alelo para
rs6983267
. Estos resultados indican que el desequilibrio alelo-específicas de alelos de susceptibilidad al cáncer puede no ser un fenómeno común en el cáncer de colon
Visto:. Gerber MM, Hampel H, Schulz NP, Fernández S, L Wei, Zhou XP, et al . (2012) Evaluación de los cambios somáticos alelo-específicas de genoma completo Vinculación Académica susceptibilidad alelos en el cáncer colorrectal humano. PLoS ONE 7 (5): e37672. doi: 10.1371 /journal.pone.0037672
Editor: Ludmila Prokunina-Olsson, Instituto Nacional del Cáncer, de los Institutos Nacionales de Salud, Estados Unidos de América
Recibido: 17 Enero, 2012; Aceptado: April 26, 2012; Publicado: 21 de mayo de 2012
Derechos de Autor © 2012 Gerber et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue financiado en parte por el NIH /NCI (CA134461 a AET y CA67941 a ADLC) y la concesión Universidad Estatal de Ohio Centro Integral del cáncer de Core (CA16058). MMG fue financiado por una universidad de OSU de Medicina de Sistemas y Biología beca de formación integrada. NPS fue financiado por una beca de la universidad de OSU de Medicina de Investigación Médica del Estudiante. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, la decisión de publicar o preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Amanda Toland es un miembro del Consejo Editorial PLoS ONE. Esto no altera la adhesión de los autores a todos los PLoS ONE políticas sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
genes supresores de tumores y oncogenes han sido reconocidos para demostrar las pérdidas y ganancias en el número de copias tumores, respectivamente [1], [2]. Clásicamente, el alelo de tipo salvaje de los genes supresores de tumores se pierde en los tumores mientras que el alelo mutado o no funcional muestra la retención selectiva. Del mismo modo, una mutación activado o copia activada de un oncogén se selecciona con frecuencia para ganancia o amplificación en los tumores. Estudios anteriores utilizando modelos de ratón muestran evidencia de que un subconjunto de loci de susceptibilidad para el cáncer de colon de la piel y demostrar las ganancias o pérdidas de la cepa específica en consonancia con estos tumores vivienda loci promoción de alelos o alelos supresores de tumores [3], [4]. Por ejemplo,
PTPRJ
, un gen identificado originalmente como un mapeo supresor de tumor candidato al ratón
la Scc1
locus, se demostró que perder preferentemente un alelo de resistencia sospecha en un subgrupo de adenocarcinomas colorrectales humanos heterocigotos que muestra la pérdida de heterozigosidad en
PTPRJ
[3]. ganancias específicas de alelo de un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) en
AURKA
,
rs2273535
, se han observado en varios estudios de tumores colorrectales [5], [6]. ganancias alélicas preferenciales o pérdidas en múltiples regiones del genoma se han identificado en las pantallas de todo el genoma mirando a los individuos con tumores primarios múltiples independientes [7] y en estudios de genómica de las muestras de glioblastoma a través de la comparación de la línea germinal y genotipo de datos somáticas [8].
Varios estudios de asociación del genoma han revelado alelos asociados con el riesgo de cáncer colorrectal (CCR) [9] - [16]. El SNP
rs6983267
en
8q24
se ha asociado tanto colorrectal y riesgo de cáncer prostático en un nivel de significación de todo el genoma [9], [17], [18]. Los análisis de número de copias específica de alelo mostró que el alelo G (el alelo de riesgo putativo) de esta variante muestra aumentos preferenciales en los tumores de colon y leucemia mieloide [19] - [21]. Hasta donde sabemos, no hay otros SNPs de la literatura publicada GWAS han demostrado definitivamente y reproducible desequilibrio alelo-específica en tumores colorrectales, aunque los estudios individuales han descrito alélica desequilibrio en la CRC para otros loci [7], [22]. En el presente estudio, se realizó la genotipificación cuantitativa de 16 variantes estadísticamente significativas de los GWAS publicados (incluyendo
rs6983267
) en el ADN tumoral colorrectal normal y emparejado. El objetivo de este estudio fue investigar estos SNPs para el aumento somática del alelo de susceptibilidad o la pérdida del alelo de resistencia utilizando alélica desequilibrio análisis.
Métodos
Muestras Humanos
Ética comunicado.
Este estudio fue aprobado por la Universidad Estatal de Ohio (OSU) Junta de Revisión Institucional. Todos los participantes del estudio escrito el consentimiento informado para el uso de sus tejidos en la investigación.
Descubrimiento Conjunto.
Apareado normal y (FFPE) bloques de tejidos tumorales incluidas en parafina fijadas con formalina se obtuvieron a través de la OSU Tejidos humanos Red de Investigación y la Red Cooperativa de Tejidos humanos Medio Oeste. Los tumores que mostraron una estabilidad de microsatélites y /o con tinción positiva para las proteínas síndrome de Lynch MSH2, MLH1, PMS2, MSH6 y por inmunohistoquímica (IHC) fueron priorizados para su inclusión en el estudio. Cuando microsatélites o los datos no estaban disponibles IHC, se excluyeron los tumores que mostraban características sugerentes de síndrome de Lynch como la ubicación del lado derecho, pobre diferenciación, y un alto porcentaje de mucina [23]. Después de la selección, la confirmación del diagnóstico y la extracción de ADN, 194 pares de ADN histológicamente normales /tumorales estaban disponibles para el estudio.
conjunto de validación.
Un conjunto de validación de 296 pares de muestras de ADN tumoral /no tumorales se obtuvieron a partir de dos colecciones de estudio existentes. Las muestras de 196 individuos fueron adquiridos a partir de un estudio de cohorte de base poblacional de cáncer de colon diagnosticado incidente en el área metropolitana de Columbus [24], [25]. DNA Blood estaba disponible para todos los casos. Un adicional de 100 emparejados muestras de tejidos normales y tumorales congeladas frescas se obtuvieron a través de la Red Cooperativa de Tejidos Humanos en el Centro Médico de la Universidad Estatal de Ohio. Las muestras fueron instantánea congelada poco después de la cirugía y recibieron de forma anónima, junto con un informe de anatomía patológica completa. Los 296 casos de CCR fueron clasificadas como de microsatélites probable que sea estable, el conjunto de 196 muestras fue estable por las pruebas de inestabilidad de microsatélites y los 100 tumores congelados frescos todos mostraron proteínas de reparación desajuste intactos mediante tinción inmunohistoquímica.
Extracción de ADN
Equipo de prueba.
hematoxilina y eosina de secciones normales y tumorales FFPE fueron evaluados por un patólogo para confirmar el diagnóstico y para marcar tejidos para la extracción de muestras. núcleos de tejido de 1,6 mm de diámetro se prepararon a partir regiones que consta de 70% más células tumorales o para la colección de ADN tumoral, o de regiones con histología normal para el aislamiento de DNA normal (no tumoral). ADN genómico fue extraído de núcleos de tejido como se describe anteriormente [26] y se cuantificó con un espectrofotómetro Nanodrop-1000. La mayoría de los ADN eran de buena calidad como se indica por relaciones A260 /A280 superiores a 1,8.
conjunto de validación.
Se aislaron los ADN del tumor en el estudio de Columbus area metropolitana como se describe [26] . Los ADN normales de estos individuos fueron aisladas de muestras de sangre en el banco de muestras de OSU Genética Humana mediante protocolos estándar. Los ADN de los 100 muestras de ADN /tumorales normales emparejados de la Red Cooperativa de Tejidos Humanos fueron aisladas de tejido fresco congelado por el mismo protocolo de extracción utilizado para las muestras de prueba. Los ADN normales de las tres fuentes (FFPE, sangre y tejido fresco congelado) exhibieron frecuencias similares de heterocigosidad y relaciones A260 /A280 similares, lo que sugiere la calidad del ADN comparables a través de fuentes de muestras.
Inclusión de SNPs para el estudio
para probar nuestra hipótesis de que el CRC susceptibilidad loci mostraría eventos somáticos específicos de alelo en los tumores, se realizaron búsquedas en la literatura reciente para identificar las variantes que muestran evidencia de riesgo de CCR a partir de estudios de asociación [9], [10], [13] - [ ,,,0],15], [27] - [32]. Diecisiete SNPs (
rs10411210
,
rs10936599
,
rs11169552
,
rs16892766
,
rs3802842
,
rs4444235
,
rs4779584
,
rs4925386
,
rs4939827
,
rs6687758
,
rs6691170
,
rs6983267
,
rs7014346
,
rs7136702
,
rs719725
,
rs961253
,
rs9929218
), que cumplen o se acerca el genoma de toda significación (p-valor & lt ; 10
-7) para el riesgo de CCR en estudios de asociación publicados fueron elegidos para el análisis del desequilibrio de alelo específico en el conjunto inicial de descubrimiento /pares de ADN normal tumorales (Tabla 1). Otros criterios de inclusión para el estudio incluían la identificación en poblaciones caucásicas y un alelo menor frecuencia suficientemente alta documentado (MAF & gt; 20%) para la identificación de suficientes heterocigotos para poder estadístico. El SNP
rs16892766
fue la única excepción a este criterio, ya que tiene un MAF documentado del 7%.
rs4925386
fue eliminado después de la determinación del genotipo de la muestra original set debido a una tasa de fracaso superior al 15%.
cuantitativa Genotipado
cebadores multiplexados para la amplificación por PCR y reacciones de extensión de una sola base alelo-específicas fueron diseñados utilizando el software de diseño de ensayo Sequenom® MassARRAY 3.1 y están disponibles bajo petición. Masa genotipado basado en la espectrometría de 20 ng emparejado tumoral y normal de ADN se realizó mediante Sequenom® MassARRAY IPLEX Oro (Sequenom Inc., San Diego, CA, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Cada placa de 384 pocillos Sequenom® incluye cuatro controles negativos plantilla (DH
2O), dos muestras analizadas por duplicado, y cuatro ADN de control positivo.
Verificación de la tipificación genética Técnica
Para validar el uso de Sequenom® genotipado cuantitativa por su sensibilidad para la identificación de desequilibrio alélica, que genera el diario de transformar N-ratios (N-ratio = área del pico normal de alelo 1 /normales área del pico del alelo 2) natural para las mezclas de ADN de muestras de ADN conocida homocigotos representa 0, 20, 40, las contribuciones 50, 60, 80, y 100% alélicas. No teníamos ADN homocigotos apropiadas para tres de los SNPs por lo que estos no fueron evaluadas. La mayoría de las pendientes y valores de R para estos eran muy cerca de las curvas de calibración para "datos perfecta" que sugiere un alto grado de sensibilidad de nuestro método de detección de desviaciones alélicas de un 50% (Figura S1).
Análisis de Desequilibrio
el software Sequenom® MassARRAY IPLEX cuantifica el área bajo cada uno de los picos de los alelos y asigna ya sea una llamada homocigotos o heterocigotos para el SNP mediante el cálculo de la relación de las áreas de los picos para los dos alelos. Como se ha descrito anteriormente [7], para probar todos los SNPs que anotó alélica desequilibrio preferencial mediante el cálculo de la relación R para cada par de ADN. Hemos definido la relación R como la relación de las dos áreas de los picos de alelos en el ADN normal, dividido por la relación de las dos áreas de los picos de alelos en el ADN tumoral emparejados (R-relación = Normal
(alelo 1 /alelo 2) /tumor
(alelo 1 /alelo 2)). Las muestras se puntuaron como teniendo desequilibrio, definida como la pérdida de cualquiera de la primera o segunda alelo en la muestra de tumor, si la relación R era mayor que 1,5 o menor que 0,67, respectivamente. Los umbrales de relación R utilizados para determinar desequilibrio se han descrito anteriormente [33], [34]. Una prueba de chi-cuadrado (df = 1) se utilizó para evaluar los desequilibrios observados para la desviación estadísticamente significativa de lo esperado 50:50 distribución de los desequilibrios de los alelos. En los casos en los que un tumor era heterocigoto para un SNP por genotipo, pero la muestra normal emparejado no al genotipo, un promedio de los dos alelos normales para las muestras normales heterocigotos en que SNP se utilizó en lugar de la muestra normal fallado para calcular un R- proporción. SNPs con valor de p & lt; 0,10 se consideraron indicativos de un desequilibrio alélica preferencial y por lo tanto fueron sometidos a pruebas en el conjunto de la muestra de validación para descartar falsos positivos. corrección de Bonferroni se utilizó para ajustar el número de pruebas estadísticas. Además de la determinación cualitativa de desequilibrio, que generó los diagramas de caja de la distribución de R-ratios para cada SNP para muestras que muestra la pérdida relativa de alelo 1, la pérdida relativa de alelo 2, y ningún desequilibrio (Figura S2). Las muestras fueron excluidos de las parcelas si tenían una relación R-mayor de 10 o si una relación R-no pudo ser calculado porque uno de los dos alelos en la muestra de tumor tenían un valor de área de pico alelo de 0.
los estudios de validación
Tras el análisis estadístico de desequilibrio alelo específico en el conjunto de muestras descubrimiento, tres variantes con valores de p & lt; 0,1 (
rs16892766
,
rs6983267
y
rs7136702
) se genotipo por Sequenom® MassARRAY IPLEX oro en un conjunto de muestras de replicación del ADN normal de 296 /tumorales pareadas. El mismo protocolo de genotipado cuantitativa y análisis estadísticos utilizados para el conjunto de la muestra descubrimiento se emplearon con el conjunto de la muestra de validación. corrección de Bonferroni se utilizó para ajustar el número de pruebas estadísticas (n = 3).
Recopilación de alelo específico de desequilibrio de datos de múltiples estudios
desequilibrio alelo-específicas análisis han sido realizados con anterioridad siete de los SNPs GWAS probados en el presente estudio [19], [35]. Estos estudios emplearon medición manual de picos del cromatograma de secuenciación de ADN tumorales y normales para calcular R-ratios. Ambos estudios publicados utilizan los valores de corte de relación R de & lt; 0,60 y & gt; 1,67 para el análisis de desequilibrio alelo-específicas. Para ambos estudios publicados anteriormente, el ADN del tumor fue aislado de tumores de colon fresca, congelada, y se utilizó la sangre como fuente de ADN normal [19], [35]. Con el fin de probar los siete variantes que se superponen con nuestro estudio, se combinaron los datos de los estudios publicados con nuestros resultados de desequilibrio alelo específico para
rs6983267
,
rs961253
,
rs3802842
,
rs10411210
,
rs4444235
,
rs4779584
, y
rs9929218
. Hemos combinado nuestros números de las pérdidas alélicas en relación con los números de los estudios publicados y se realizó una prueba de chi-cuadrado con corrección de Bonferroni (n = 7) para determinar la significación estadística de los desequilibrios combinados.
Análisis de correlación de alélica desequilibrios y la edad, sexo y estadio tumoral
para cada SNP evaluados de manera positiva en caso de desequilibrio alélica, se investigó la asociación entre la presencia de desequilibrio alélica y la edad del diagnóstico, el sexo y el estadio del tumor del paciente. Se utilizó la prueba estadística de Chi-cuadrado para detectar asociación entre alélica desequilibrio y el sexo. Fisher se utilizó la prueba estadística exacta para detectar asociación entre desequilibrio alélica y el estadio tumoral. Para la etapa del tumor, los tumores se clasificaron como estadio TNM I-IV de acuerdo con el tamaño del tumor disponibles, diseminación ganglionar, y la información de la metástasis. Se utilizó la prueba t para comparar la edad media de los pacientes cuyos tumores mostraron alélica desequilibrio a la de los pacientes cuyos tumores mantenido heterocigosidad. Las correlaciones con los valores de p & lt; 0,05 corregidas fueron considerados estadísticamente significativa
Resultados
Descubrimiento Conjunto Genotipado
Para determinar si alguno de los 17 SNPs asociados-CRC muestran evidencia de alelo. desequilibrio específico de, les genotipo en 194 pares de ADN normales /tumorales. Todos menos un SNP,
rs4925386
, se genotipo con éxito en más de un 85% de las muestras en el conjunto de descubrimiento. Debido a la alta tasa de fracasos de genotipado (24%),
rs4925386
se excluyó del análisis adicional. El número de los ADN normales heterocigotos identificados para cada SNP (para el que también se genotipo con éxito el ADN tumoral emparejados) varió desde 27 hasta 84 de las 194 muestras (14 a 43%; Tabla 2). La frecuencia de pérdida alelo relativo general (para los alelos de riesgo y no riesgo combinados) varió de 2% a 44%. Si bien ninguno de los SNPs alcanzó significación estadística en caso de desequilibrio alelo-específicas en α = 0,05, tres SNPs (
rs16892766, rs6983267, rs7136702
) mostraron una tendencia a que (los valores de p & lt; 0,10) alelo-específicas desequilibrio antes de corrección de Bonferroni para comparaciones múltiples (n = 16). El SNP
rs6983267
mostró frecuencias más altas de pérdida relativa del alelo T no riesgo en comparación con el alelo G del riesgo. Curiosamente,
rs16892766
y
rs7136702
tanto demostraron frecuencias más altas de pérdida relativa del alelo de riesgo en comparación con el alelo no riesgo en los tumores establecidos descubrimiento. Las variantes
rs16892766
,
rs6983267
y
rs7136702
fueron prioridad para la validación en un segundo conjunto de muestras. Además de asegurar la cualitativamente los SNPs como muestra de desequilibrio o ningún desequilibrio, la distribución de R-ratios para la pérdida relativa de la alelo de riesgo, la pérdida relativa de la alelo no riesgo y no desequilibrio se graficaron como diagramas de caja para cada SNP (Figura S2) . Las muestras para el que la relación R era mayor de 10 o para los que la relación R no se pudo calcular fueron excluidos de las parcelas.
validación del conjunto de Genotipado
Los SNP
rs16892766
,
rs6983267
y
rs7136702
, que todos mostraron evidencia de desequilibrio de alelo específico en el conjunto descubrimiento original, se pusieron a prueba aún más en el conjunto de la muestra de validación de 296 normales /tumorales pares de ADN. Al igual que con el conjunto de prueba, estos tres SNPs genotipo con éxito en más del 85% de las muestras de validación. Con el 22% de la validación del conjunto de los heterocigóticos que muestra la pérdida relativa de un alelo,
rs6983267
mostraron una frecuencia de pérdida global relativa alelo menor que la observada en el conjunto de ensayo original (30%, Tabla 3). Un menor frecuencia de heterocigotos muestras en el conjunto de validación mostró pérdida relativa de un alelo de
rs7136702 gratis (11%) en comparación con el conjunto de prueba (23%, Tabla 3). Del mismo modo, una menor frecuencia de pérdida alélica del
rs16892766
se observó en el conjunto de la muestra de validación (16%) en comparación con el conjunto original de prueba (26%, Tabla 3).
rs6983267 de
volvió a mostrar una tendencia a la significación estadística preferencial desequilibrio alélica (valor de p = 0,06), lo que favorece la pérdida relativa del alelo T no riesgo y la retención relativa del alelo de riesgo G en el conjunto de la muestra de validación. Sin embargo, ni
rs7136702
ni
rs16892766
mostró una tendencia estadísticamente significativa hacia alélica desequilibrio preferente en el conjunto de la muestra de validación (valores de p = 0,59 y 1,00, respectivamente).
Combinado Genotipado Resultados desde el descubrimiento y validación de conjuntos de muestras
Cuando se combinaron los genotipos de prueba fijo y establecido validación, 48 de 192 muestras heterocigotas (25%) mostraron una pérdida relativa de un alelo de
rs6983267
(Tabla 3). Para el SNP
rs7136702
, 31 de 208 heterocigotos combinados mostraron pérdida relativa de cualquiera de alelo (15%). Cuando genotipos desde el teléfono de prueba y validación del conjunto se combinaron para
rs16892766
, 13 de 65 heterocigotos (20%) mostraron una pérdida alélica. Por análisis combinado
rs6983267
mostraron una fuerte evidencia estadística de desequilibrio alélica preferencial (valor de p = 0,01). Después de la corrección de Bonferroni para comparaciones múltiples pruebas (n = 3),
rs6983267
mantiene un p-valor ajustado estadísticamente significativa de 0,03. Por el contrario, tanto
rs16892766
y
rs7136702
lograron mostrar alguna tendencia hacia un desbalance de alelo-específicas mediante el análisis combinado (p-valores no ajustados = 0,17 y 0,37, respectivamente).
Recopilación de datos alélica desequilibrio de múltiples estudios
Debido a que otros han publicado los datos de desequilibrio alelo-específicas en siete variantes de nuestro estudio [19], [35], se decidió realizar un análisis combinado del presente estudio y los estudios publicados anteriormente para aumentar la potencia de la identificación de SNPs que demuestran desequilibrio alelo-específicas. Cuando los desequilibrios observados en nuestras muestras a los SNPs
rs6983267
,
rs961253
,
rs3802842
,
rs10411210
,
rs4444235
,
rs4779584
, y
rs9929218
se combinaron con los publicados anteriormente [19], [35], se observó una pérdida relativa altamente significativa del alelo T no riesgo de
rs6983267
(p-valor = 2,94 × 10
-5). Después de la corrección de Bonferroni (n = 7), la pérdida relativa preferencial del alelo T de
rs6983267
mantiene un valor de p altamente significativa de 2,06 × 10
-4. Ninguna de las otras variantes mostró evidencia estadísticamente significativa de desequilibrio alélica preferencial (Tabla 4).
Análisis de correlación de desequilibrios alélicos y la edad, el sexo y la etapa del tumor
Para probar si las muestras mostrando desequilibrio alélica para el GWAS SNPs había diferentes características clínicas en comparación con las muestras no muestran un desequilibrio, se realizó un análisis de correlación de desequilibrio con la edad, el sexo y el estadio tumoral utilizando los datos de nuestra muestra descubrimiento. La presencia de desequilibrio alélica se asoció significativamente con el estadio del tumor para
rs719725 gratis (no ajustado p-valor = 0,0098), y se asocia significativamente con la edad más joven de
rs7014346 gratis (no ajustado p-valor = 0,033) . Sin embargo, después de ajustar para comparaciones múltiples (n = 16), no hubo una asociación significativa entre la presencia de desequilibrio alélica y la edad, el sexo y el estadio tumoral (ajustado los valores de p & gt; 0,05). Para cualquiera de los SNPs analizados
Discusión
En este estudio, se investigó 16 SNPs previamente asociados con el riesgo de CCR en caso de desequilibrio alelo concreto utilizando la plataforma de genotipado Sequenom® MassARRAY IPLEX oro. Mientras que 15 de los 16 probados SNPs no mostró evidencia estadísticamente significativa (p-valor & lt; 0,05) de desequilibrio alélica preferencial en nuestra muestra descubrimiento, el SNP
rs6983267
demostró una tendencia hacia la pérdida somática estadísticamente significativa de la no -Riesgo alelo T y la retención del alelo G en riesgo tanto el conjunto descubrimiento original y el conjunto de la muestra de validación (valores de p = 0,07 y 0,06, respectivamente; Tablas 2 y 3). Esto es coherente con los informes publicados previamente [19], [20]. Curiosamente, a pesar de estar en alta desequilibrio de ligamiento con
rs6983267
en 8q24 (D '= 0,99) [9], [13],
rs7014346
no mostró evidencia de desequilibrio alélica preferencial (p- valor = 0,53) en el conjunto de la muestra descubrimiento. En el mayor estudio previo para evaluar el desequilibrio alélica para
rs6983267
, 466 tumores de pacientes con CRC heterocigóticos finlandeses fueron evaluados con éxito y 101 de estas muestras heterocigotas (22%) mostraron desequilibrio alélica [19]. Entre estas 101 muestras, hubo un número significativamente (p-valor = 0,0007) más tumores que muestran pérdida relativa del alelo T (66% de los tumores) versus pérdida relativa del alelo G (34% de los tumores). A partir de nuestros conjuntos de descubrimiento y validación combinaron, se evaluaron los tumores de individuos heterocigóticos para el
rs6983267
variante, y 48 (25%) de estos heterocigotos mostraron alélica desequilibrio. Se observó un porcentaje casi idéntico de los tumores que muestran pérdida relativa del alelo T (33 de 48; 69%) en comparación con el alelo G (15 de 48; 31%). Este fue significativa incluso después de ajustar para la prueba de comparaciones múltiples (valor de p = 0,03; Tabla 3). Por lo tanto, nuestros datos apoyan la observación de desequilibrio alélica preferencial por
rs6983267
y validar nuestro método experimental. Por otra parte, cuando se combinaron los datos con los de Tuupanen et al. [19], se observó una pérdida relativa altamente significativa del alelo T y ganancia relativa del alelo G que soportó múltiples pruebas de comparaciones (p-valor = 2,06 × 10
-4; Tabla 4). Es importante destacar que el hallazgo de que el alelo de riesgo G puede ser retenido o adquirida en tumores colorrectales selectivamente es consistente con un estudio que muestra que el alelo G de
rs6983267
demuestra una mayor unión del factor de transcripción regulados por Wnt TCF4, tal vez conduzca a un aumento de la capacidad de respuesta a la señalización de Wnt en personas con el riesgo alelo G [20]. Además, estos datos confirman que el desequilibrio específico de alelo se produce por CRC loci de susceptibilidad, aunque a una frecuencia baja.
En otro estudio reciente, el desequilibrio alélica somática se investigó a las siete loci de susceptibilidad baja penetrancia CRC [35] . Los SNP loci-etiquetado
rs4779584
,
rs3802842
,
rs4444235
,
rs9929218
,
rs10411210
, y
rs961253 Windows que se genotipo en nuestro estudio estaban entre los siete variantes ensayadas para el alelo específico de desequilibrio en el estudio de Niittymäki et al. [35]. Si bien ninguno de estos SNP mostró evidencia de desequilibrio alélica preferencial en el análisis combinado con nuestros datos, uno de estos SNPs (
rs961253
) demostraron tendencias desequilibrio alélica similares a las observadas en nuestra muestra descubrimiento, con
rs961253
mostrando pérdida relativa más frecuentes del alelo a en ambos estudios (Tabla 4). Las tasas de heterocigosidad y el desequilibrio fueron muy similares entre los dos estudios con la excepción de nuestro estudio que muestra un mayor grado de desequilibrio alélica para
rs4779584
.Un análisis combinado de los datos y los datos de Niittymäki et al. [35] para las seis variantes en común no pusieron de manifiesto ninguna SNPs con evidencia de desequilibrio alelo-específicas. Una advertencia a la combinación de datos del presente estudio con el que a partir de conjuntos de datos publicados es que el porcentaje de células tumorales en las muestras, así como métodos de genotipado y puntos de corte del valor de R para determinar el desequilibrio alélica diferencia entre los estudios. Sin embargo, nuestro estudio reproduce el hallazgo de que estos seis SNPs loci-etiquetado no muestran ninguna evidencia de desequilibrio alélica preferencial en las poblaciones de estudio predominantemente de raza blanca.
Aunque sólo uno de los SNPs analizados en el presente estudio mostraron una fuerte evidencia de alélica preferencial desequilibrio, el otro SNPs puede jugar un papel en la predisposición de la línea germinal para CRC independiente de eventos somáticas en el tumor. Se ha propuesto que estos SNPs influyen en el desarrollo de neoplasias, pero no afectan la posterior progresión neoplásica somática [35]. Los SNPs funcionales en el loci identificados-GWAS pueden influir en el desarrollo neoplásico mediante la modificación de la expresión génica, la metilación, o patrones de empalme de tal manera que no se requiere la selección a nivel de ADN durante la tumorigénesis. Estos SNP también podrían afectar las células no tumorales, como las células del estroma o inmunológicos para modificar el riesgo de cáncer, pero son independientes de las mismas células cancerosas. Una vez que el mecanismo por el cual estas variantes actúan para conferir riesgo se entiende mejor, podemos ser capaces de deducir las variantes que son más propensos a mostrar la selección en los tumores.
limitaciones inherentes en el diseño de nuestro estudio podrían enmascarar aún más alélica preferencial selección. En primer lugar, es posible que las células normales se aislaron con células tumorales en los tejidos de tumor de la que se extrajo el ADN para el análisis. A pesar de la selección inicial de las regiones del tumor que contienen 70% o células tumorales mayores, algunos contaminación de ADN normal de la muestra de ADN del tumor podría sesgo de la muestra hacia mostrando ningún desequilibrio. Sin embargo, nuestro examen histológico de las muestras de tejido se debe minimizar la posibilidad de contaminación de ADN normal. Del mismo modo, nuestras muestras histológicamente normal de tejido de colon FFPE no pueden ser normales y pueden contener mutaciones somáticas similares a las del tumor, lo que podría resultar en una "undercalling" general de los tumores con desequilibrio. Siempre que sea posible se recogió el tejido de colon normal desde sitios distantes del tumor. En segundo lugar, se emplearon las prácticas de inclusión de datos conservadores descontando genotipo llamadas agresivas realizadas por el software Sequenom® MassARRAY IPLEX y al infundir puntos de corte de la razón de R & gt; 1,5 y & lt; 0,67 para la determinación del desequilibrio alélica. Nuestros requisitos rigurosos para la inclusión de los datos pueden limitar la detección de límite alélica desequilibrio significativo, particularmente en muestras de tumor que contienen células no tumorales. Por otra parte, si los tumores son heterogéneos para la pérdida alélica no puede detectar desequilibrios en esa muestra. En tercer lugar, nuestra muestra descubrimiento fue limitada a 194 pares de ADN normales /tumorales y puede haber carecido de poder estadístico para la detección de la selección de alelos en los loci preferencial que muestra los niveles más bajos de heterocigosidad o aberración genómico menos frecuentes. Sobre la base de datos del ratón muestran que alrededor del 40% de los loci de susceptibilidad demostrar alélica desequilibrio preferencial [4], que no esperaba que todos los SNPs identificados a través de estudios de asociación alélica para mostrar la selección preferencial en los tumores. Sin embargo, nuestros resultados son sorprendentes en que sólo un SNP,
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, mostraron una tendencia a la selección somática en los tumores de colon. Estos resultados pueden indicar diferencias entre las especies, las diferencias entre los tumores de colon y de la piel, o pueden ser el resultado de las limitaciones de los estudios discutidos.
En conclusión, nuestros resultados sugieren que la mayoría de las variantes identificadas como alelos de susceptibilidad al cáncer de colon a través de GWAS, que no presentan desequilibrio alelo-específicas somática en los tumores de colon. Sin embargo, nuestros datos confirman los resultados publicados anteriormente que muestra el desequilibrio específico de alelo para
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. Estos resultados indican que somática desequilibrio específica de alelo de los alelos de susceptibilidad al cáncer puede no ser un fenómeno común en el cáncer de colon, pero que para un pequeño porcentaje de loci (1 de 16, o 6%, observado en el presente estudio), la selección somática de alelos específicos podrían subyacer a la tumorigénesis.
Apoyo a la Información
Figura S1. Curvas
estándar para los SNP.