Extracto
pancreático ductal adenocarcinomas son desmoplásico y hipóxico, los cuales están asociados con un mal pronóstico. profármacos activados por hipoxia (HAP) se activan específicamente en ambientes de hipoxia para liberar citotóxicos o citostáticos efectores. TH-302 es un HAP que actualmente está siendo evaluado en un ensayo clínico de fase III en el cáncer de páncreas. El uso de modelos animales, se demuestra que la hipoxia tumoral puede ser exacerbada usando un vasodilatador, hidralazina, la mejora de TH-302 eficacia. Hidralazina reduce el flujo sanguíneo del tumor a través del fenómeno de "robar", en el que atonal vasculatura tumoral inmadura no dilatar en coordinación con la vasculatura normal. Se demuestra que la MIA Paca-2 tumores exhiben un efecto de "robar" en respuesta a la hidralazina, lo que resulta en una disminución del flujo sanguíneo del tumor y la posterior reducción del pH del tumor. El efecto no se observa en SU.86.86 tumores con la vasculatura del tumor madura, medida por CD31 y tinción inmunohistoquímica actina de músculo liso (SMA). La terapia de combinación de hidralazina y TH-302 dio lugar a una reducción de la MIA PaCa-2 de crecimiento del volumen del tumor después de 18 días de tratamiento. Estos estudios apoyan un mecanismo de combinación de acción para TH-302 con un vasodilatador que aumenta transitoriamente la hipoxia tumoral
Visto:. Bailey KM, Cornnell HH, Ibrahim Hashim-A, Wojtkowiak JW, Hart CP, Zhang X, et Alabama. (2014) Evaluación del fenómeno de "robar" sobre la eficacia de la hipoxia Activado profármaco TH-302 en el cáncer de páncreas. PLoS ONE 9 (12): e113586. doi: 10.1371 /journal.pone.0113586
Editor: Pankaj K. Singh, Universidad de Nebraska Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 30 de junio de 2014; Aceptado: 26 Octubre 2014; Publicado: December 22, 2014
Derechos de Autor © 2014 Bailey et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del papel
Financiación:. Este estudio fue apoyado por becas R01CA125627-02; R01CA077575-10; P30CA076292-16 (Robert J. Gillies) y P30CA023074-35 (Amanda F. Baker). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores han leído la política de la revista y los autores de este manuscrito han de competir el siguiente intereses: Charles P. Hart es un empleado de Threshold Pharmaceuticals. Esto no altera la adhesión de los autores a PLoS ONE políticas en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
adenocarcinomas ductales pancreáticas (PDAC) de los pacientes tienen un pronóstico extremadamente pobre, con una tasa de supervivencia a 5 años de aproximadamente 6%. La supervivencia sigue siendo baja debido tanto a la falta de detección precoz de la PDAC localizada e ineficacia de las quimioterapias tradicionales para controlar la progresión de la PDAC. Estas bajas tasas de supervivencia demuestran la necesidad de desarrollar nuevas estrategias de tratamiento. Patológicamente, tumores PDAC son extremadamente heterogéneos y contienen un compartimiento del estroma desmoplásico dinámica, los cuales contribuyen a la progresión del tumor y la quimioterapia resistencia [1], [2]. Además de ser una barrera mecánica para la penetración del fármaco, estroma desmoplásico contribuye a la hipoxia tumoral; un rasgo fisiológico común de tumores PDAC que también se asocia con la resistencia a la quimioterapia y la radioterapia [3] - [5]. resistencia a la quimioterapia por hipoxia asociada puede estar mediada por: una falta de suministro de fármaco en el tumor debido a la mala perfusión [4]; resistencia inducida por hipoxia a la apoptosis [6]; y disminución de la proliferación celular de las fracciones de células hipóxicas [7]. Además, se ha demostrado que los tejidos tumorales hipóxicas haber aumentado potencial metastásico [8] y la mayoría de los tumores PDAC presente como enfermedad en etapa tardía metastásico [9].
Recientemente, los esfuerzos se dirigen a los compartimentos terapéuticamente hipóxicas de tumores que se hayan interpuesto mediante el uso de profármacos de hipoxia-activado (HAP). HAPs son relativamente inerte en los tejidos con oxigenación normal (pO
2), pero se reducen en selectos oxidorreductasas de un electrón en condiciones de hipoxia para liberar ojivas citotóxicos. Una primera generación de HAP, tirapazamina, mostró un beneficio terapéutico potencial en combinación con las terapias estándar [10] - [12], y demostró un éxito moderado en la Fase I - II de ensayos clínicos [13], [14]. la penetración incompleta del tumor y una vida media corta, han estimulado los esfuerzos para diseñar análogos de tirapazamina mejorados con mejor solubilidad, la citotoxicidad, la selectividad y la penetración en los tejidos [15] - [17]. Un segundo HAP generación, TH-302, está montado sobre un disparador sensibles a la hipoxia 2-nitro-imidazol y se activa de forma selectiva en condiciones de hipoxia extrema (& lt; 0,5% O
2) la liberación de bromo-isofosforamida, un efector citotóxico ADN de reticulación [18]. TH-302 es muy eficaz en modelos de tumores de xenoinjerto preclínicos [19], y está siendo investigado clínicamente para varios tipos de cáncer, incluyendo PDAC. Una fase I /II de prueba mostró que el TH-302, en combinación con gemcitabina, aumento de la supervivencia libre de progresión a los 2 meses para los pacientes PDAC [20], y esta combinación ha avanzado a la fase III (NCT01746979, EMD Serono).
preclínicos TH-302
in vitro
y
in vitro
estudios de monoterapia identificados líneas de cáncer de páncreas sensibles y resistentes se parece mucho a la respuesta clínica en pacientes PDAC [21], [22]. Como no se requiere la hipoxia tumoral para la actividad TH-302, y porque TH-302 exhibe un efecto espectador al matar las células en los tejidos de normoxia adyacentes [22], la hipótesis de que TH-302 eficacia se podría mejorar mediante el aumento de transitoriamente la fracción hipóxica en tumores sólidos . En modelos in silico y pruebas experimentales muestran que el enfoque más eficaz para disminuir el tumor pO
2 es aumentar la respiración celular [23]. Esto fue demostrado previamente en la línea celular de carcinoma de colon, RKO, en el que la inhibición farmacológica de HIF-1α con equinomicina aumentó el consumo de oxígeno, la disminución de tumor pO
2 y el aumento de la actividad de la HAP, la tirapazamina [24]. Este tratamiento resultó en un ambiente hipóxico crónicamente que podría conducir a una mayor adaptación hipóxica de las células tumorales y los efectos secundarios HAP. En contraste, proponemos que la exacerbación transitoria y aguda de la hipoxia, en combinación con TH-302, sería más eficaz con menos efectos secundarios. El trabajo previo ha observado también que el piruvato exógeno aumenta la fracción hipóxica en el carcinoma de células escamosas (SCC), los tumores [25] a través de un aumento transitorio en el consumo de oxígeno [26]. También hemos observado que el piruvato exógeno aumentó la eficacia de TH-302 en SCC preclínica y modelos PDAC [26], [27]. Para explorar métodos farmacológicos alternativos para exacerbar la hipoxia transitoria y por lo tanto mejorar las propiedades antitumorales de TH-302, que en este documento investigar el fenómeno de "robar". El fenómeno de "robar" se produce cuando vasodilatadores, tales como hidralazina, hacen que los vasos sanguíneos se dilaten sanos que conduce a la disminución de la presión arterial sistémica. vasculatura del tumor a menudo es inmaduro y atonal, que carecen de la capacidad de contraerse o dilatarse. Por lo tanto, durante la vasodilatación sistémica, hay una reducción fisiológica de la presión arterial que no puede ser igualado por el microambiente tumoral y la vasculatura. La diferencia de presión resultante crea una disminución transitoria en la perfusión del tumor, afectando a la fisiología del tumor y resulta en una mayor hipoxia y acidosis [28] - [33]
En este estudio la hipótesis de que la hidralazina se podría utilizar de forma aguda para reducir la perfusión. y aumentar la hipoxia dentro del microambiente del tumor, aumentando así la eficacia de TH-302. Elegimos tres modelos humanos pancreáticas línea celular de cáncer de xenoinjertos, que había sido previamente demostrado ser variable sensible a TH-302 monoterapia [18], [21], [22]. Tumor pH se midió antes y después de la administración de la hidralazina como un biomarcador para la perfusión reducida. Los cambios en el flujo de sangre después del tratamiento hidralazina se midieron cuantitativamente usando ultrasonido Doppler para confirmar una reducción de la perfusión del tumor y para diseñar regímenes de dosificación para maximizar el efecto del fenómeno de "robar". La terapia de combinación de hidralazina y TH-302 se evaluó con la hipótesis de que el tratamiento con hidralazina aumentaría TH-302 eficacia en "robar" líneas -sensibles. Los resultados indicaron que la hidralazina mejorada TH-302 eficacia, aunque el tamaño del efecto fue pequeño y sólo fue moderadamente significativa en los tumores (MIA Paca-2) que muestran sensibilidad intermedia a TH-302 como monoterapia.
Materiales y Métodos
Cell Culture
SU.86.86 y se obtuvieron células Hs766T de Threshold Pharmaceuticals (South San Francisco, CA) y las células MIA Paca-2 se obtuvieron de la colección American Type Cell (ATCC, Manassas, VIRGINIA). Las células se mantuvieron de acuerdo con las directrices de la ATCC. Las células se incubaron en medio RPMI 1640 suplementado con 10% FBS (Hs766T y SU.86.86) o DMEM suplementado con 10% FBS (MIA PaCa-2), y se mantuvieron a 37 ° C en 5% de CO
2. Mycoplasma y la línea celular se realizaron autenticidad (cariotipo) pruebas.
Los estudios en animales
Todos los procedimientos fueron realizados de conformidad con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de Recursos (1996), Consejo Superior de Investigaciones Científicas, y aprobado por el Cuidado de Animales institucional y el empleo de la Universidad de Florida del Sur bajo el protocolo aprobado R4033. ratones inmunodeficientes fueron alojados en una instalación limpia, con condiciones especiales que incluyen filtrado HEPA sistemas de jaulas ventiladas, ropa de cama en autoclave, la vivienda, el agua tratada en autoclave autoclave, irradiado procedimientos especiales de la jaula cambiando la Alimentación. Los ratones fueron sacrificados por CO
2 inhalación si los tumores contribuyeron a una ganancia de & gt; 20% en el peso corporal en comparación con los controles en el mismo punto en el tiempo, o ratones experimentaron a & gt; 10% de pérdida en el peso corporal, un tumor mide más grande de 2000 mm
3, o ratones muestran signos de enfermedad diseminada como la metástasis pulmonar indicado por respiración dificultosa. Todos los animales fueron alojados en cualquiera de la USF Vivarium dentro de Moffitt Cancer Center o dentro de las instalaciones del Centro de Cáncer de Arizona
ratones hembra SCID-beige (Harlan Laboratories, Indianapolis, IN) se inocularon con 5 -. 10 × 10
6 células en 1: 1 de Matrigel (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ): PBS solución por vía subcutánea en el flanco derecho. El crecimiento tumoral se monitorizó dos veces por semana con calibradores electrónicos durante toda la duración de los experimentos. Los volúmenes tumorales se calcularon usando: volumen = (
l
×
w
2) /2, donde
l
= longitud más larga y
w
= longitud más corta. Ortotópico modelo de tumor de páncreas: ratones machos desnudos (n = 3) fueron inyectados con 1 x 10
6/20 l de MIA PaCa-2 células en PBS. Los ratones fueron anestesiados con 3% de isoflurano y se mantienen con 1,5% de isoflurano durante todo el procedimiento. Tras incisión lateral, el bazo y el páncreas distal se movilizaron y las células se inyecta directamente en el páncreas. La pared interna del abdomen y se suturó la incisión de la piel exterior se cerró con grapas. Analgesia se administró a la zona quirúrgica para el alivio del dolor. Los ratones se controlaron diariamente hasta que las grapas se eliminaron, aproximadamente una semana. El volumen del tumor se controló semanalmente por ultrasonido.
Electrodo de pH
Las mediciones de pH se obtuvieron utilizando un medidor de pH FE20 vida es mi vida (Mettler-Toledo, Columbus, OH). Todos los animales fueron sedados con isoflurano (3,5%), y se mantuvieron bajo anestesia (1.5 a 3.5% de isoflurano) durante la duración del experimento. Un electrodo de referencia y el pH (MI-401F y MI-408B, respectivamente, microelectrodos Inc., Bedford, NH) se utiliza para medir el pH mediante la inserción primero el electrodo de referencia (OD 1 mm) debajo de la piel del ratón cerca del tumor (flanco). A continuación, se inserta el electrodo de pH (OD 0,8 mm) hasta 1,3 cm en el centro de cada tumor subcutáneo. Los electrodos se calibran antes y después de cada serie de mediciones. Dos mediciones fueron tomadas en cada punto de tiempo y se promedian. Después de las mediciones iniciales de pH, los animales se les administró inyección intraperitoneal de 100 l (ip) de 10 mg /kg hidralazina (Sigma Aldrich, St. Louis, MO). El pH se midió cada 30 minutos hasta tres horas después de la inyección ip, y se tuvo cuidado para medir el pH en aproximadamente el mismo lugar en el tumor en cada momento. Después de la medición del pH final, los animales se sacrificaron y los tumores se cosecharon para histología.
Los datos se procesaron tomando el promedio de los dos valores de pH medidos en cada punto de tiempo. El cambio en el pH, o delta (Δ (
t
), donde
t
es el tiempo después de la inyección de solución salina o hidralazina, en minutos) se mide como la diferencia entre el primer punto de tiempo pH y cada subsecuente pH punto de tiempo. Para cada tipo de tumor, el delta medio (
Promedio
Δ) es el delta media para todos los animales de ese tipo de tumor:
Donde
t
es el tiempo, que va desde 30 a 180 minutos después de la inyección,
Un
es el animal,
n
t
se los puntos de tiempo medido número, y
n
Un
es la número de animales con ese tipo de tumor. Se identificó el máximo cambio de pH en cualquier momento después de la inyección para cada animal individual. El máximo promedio a través de cada tipo de tumor se calculó, y también se identificó el mayor cambio de cualquier animal en cada grupo. El número de animales mide variar según el tipo de tumor: Hs766T, n = 3; MIA PaCa-2 n = 4; y SU.86.86, n = 7.
OxyLite
niveles de oxigenación de los tumores se controlará mediante OxyLab (Oxford Optronics, Oxford, Reino Unido) sondas de fibra óptica de la serie E de parámetros de triple que se insertaron en todos los tumores. Estos microsondas hipoxia precalibrados se basan en la extinción de luminiscencia y la medición de pO2 se basa en el tiempo de vida se inactivó en oxígeno de colorante luminiscente. Las señales de la sonda OxyLab fueron adquiridos utilizando los sistemas de monitoreo OxyLab pO2 E y OxyLab LDF conectados a un PC. señales de datos de salida de estos monitores se convirtieron en valores de pO2 (mmHg) y se registran en tiempo real utilizando un sistema de adquisición de datos multicanal (PowerLab 8SP, ADInstruments, Australia) que se ejecuta bajo Gráfico para Windows (Ver.5.02, ADInstruments, Australia) . ratones anestesiados (isoflurano, 100% de O
2) fueron restringidos en una plataforma personalizada inmovilización para evitar el movimiento y reequipar con una almohadilla térmica para mantener la temperatura corporal. Se tomaron precauciones adicionales para evitar cualquier movimiento de las sondas de la hipoxia, así como limitar la interferencia de fuentes externas de luz eliminando así artefacto. Microsondas (OD ~450 micras) se insertan en el tumor y se fijaron en posición utilizando métodos estereotácticos. Entrada en cada uno de los tumores se realizó con un 19 g aguja de la jeringa y microsondas se alimentaron en el tumor en ~ 3 mm de la superficie del tumor y la aguja fue retraída. Microsondas fueron cuidadosamente marcados con gradaciones con el fin de alcanzar la misma profundidad en todos los tumores. los niveles de pO2 tumorales se monitorizaron hasta que se observó una línea de base estable. Se tomaron mediciones en tiempo real durante 10 minutos a la línea de base y de forma continua durante 60 minutos después de una inyección de 100 l intraperitoneal (ip) de 10 mg /kg hidralazina. los niveles de oxigenación tumoral pre y se compararon las inyecciones posteriores a la hidralazina. El número de animales medido: MIA Paca-2 n = 4.
las imágenes por ultrasonido
Las imágenes por ultrasonido se realizó en el Vevo2100 con el transductor MS550D 22-55 MHz (VisualSonics, Toronto, Ontario, Canadá). Ratones portadores de MIA PaCa-2 tumores (n = 4) fueron sedados (como se describe anteriormente) a través de la duración de la formación de imágenes. Se tomaron imágenes en color Doppler para establecer la ubicación de un vaso sanguíneo importante dentro del tumor. Una vez que un vaso sanguíneo suficientemente grande se encuentra, una onda pulsada (PW) Doppler fue tomada para la cuantificación de flujo. El animal recibió una inyección de 100 l de 10 mg /kg hidralazina, y el flujo en el mismo vaso sanguíneo se midió cada 5 minutos durante 30 minutos. Para Mia Paca-2 tumores ortotópico, el flujo sanguíneo se midió durante 180 minutos.
tratamientos farmacológicos y el crecimiento tumoral Cinética Monitoreo
Los animales fueron apareados mediante el volumen tumoral (según se calcula mediante calibradores electrónicos) cuando tumores alcanzaron ~ 200 mm
3. Los animales se separaron en cuatro grupos de tratamiento de drogas (n = 9 animales por grupo de tratamiento para Hs766T y SU.86.86, números enumerados para MIA PaCa-2): i) TH-302 (n = 9), ii) La hidralazina (n = 7 ), iii) TH-302 + hidralazina (n = 7) y iv) solución salina (control, n = 10). Los tratamientos se administraron como inyecciones ip a los animales un-anestesiados. Las dosis fueron de 50 mg /kg TH-302 en 200 l de solución salina para cada animal en los grupos I y III, 10 mg /kg hidralazina en 100 l de solución salina por animal [29] en los grupos II y III, y 200 l de solución salina para iv grupo . Grupo III recibió la hidralazina 30 minutos antes de la administración de TH-302. Durante la administración simultánea de hidralazina y TH-302, hidralazina se inyectó ip inmediatamente antes de TH-302. Todos los planes de tratamiento se administraron qdx5 durante dos semanas concurrentes. Los volúmenes de los tumores se midieron dos veces por semana usando calibradores electrónicos durante la duración del experimento.
Producción de tejidos e inmunohistoquímica
A la finalización de los
in vivo
estudios, los animales fueron sacrificados y se extirparon los tumores. Los tumores se fijaron en formalina y embebidos en parafina para su posterior procesamiento. La tinción de hematoxilina y eosina (H & amp; E) se realizó en 4 micras rodajas. Inmunohistoquímica (IHC) tinción se efectuará directamente en el núcleo de tejido Moffitt mediante Res IHC Omni0UltraMap HRP XT XT Descubrimiento módulo de tinción (Ventana Medical Systems Inc.). IHC análisis se completó para CD31 (Abcam ab28364) y actina del músculo liso [SMA (Abcam ab32575)]. Las láminas fueron escaneados con el Aperio ScanScope XT (Vista, CA), y el análisis positivo de píxeles se realizó utilizando el software Genie Aperio v1. En pocas palabras, la intensidad de la tinción algoritmo de medida a través de toda el área del tumor y clasificado el número de píxeles que contienen tejido manchado. Los resultados se presentan como porcentaje de positividad, que se calculó como el número de píxeles positivos dividido por el número total de píxeles multiplicados por 100.
Data Analysis
Los datos se analizaron usando GraphPad Prism v6. 02 (GraphPad Software Inc.). Las estadísticas se realizaron mediante la prueba t de Student no apareado un 2-cola con corrección de Welch. Los datos se presentan como media ± SEM.
Declaración de Ética
Todos los procedimientos fueron realizados de conformidad con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de Recursos (1996), Consejo Superior de Investigaciones Científicas, y aprobados por el Comité de Cuidado y uso de Animales Institucional de la Universidad de Florida del Sur bajo el protocolo aprobado R4033. ratones inmunodeficientes fueron alojados en una instalación limpia, con condiciones especiales que incluyen filtrado HEPA sistemas de jaulas ventiladas, ropa de cama en autoclave, la vivienda, el agua tratada en autoclave autoclave, irradiado procedimientos especiales de la jaula cambiando la Alimentación. Los ratones fueron sacrificados por CO
2 inhalación si los tumores contribuyeron a una ganancia de & gt; 20% en el peso corporal en comparación con los controles en el mismo punto en el tiempo, o ratones experimentaron a & gt; 10% de pérdida en el peso corporal, un tumor mide más grande de 2000 mm
3, o ratones muestran signos de enfermedad diseminada como la metástasis pulmonar indicado por respiración dificultosa difícil.
resultados
Los estudios previos han mostrado una respuesta variable de tres líneas celulares PDAC , Hs766T, MIA Paca-2 y SU.86.86, a M-302 monoterapia tanto
in vitro
y
in vivo
. El tratamiento de células cultivadas en condiciones anóxicas con TH-302 muestran que MIA PaCa-2 células son las más sensibles (IC
50 = 2,1 ± 0,7 mmol /L); SU.86.86 responder moderadamente (IC
50 = 12 ± 1,2 mmol /L); y Hs766T la menos sensible (IC
50 = 60 ± 7,5 mmol /L) [21]. Curiosamente
in vivo
, modelos de xenoinjertos de tumores utilizando las mismas líneas celulares muestran diferentes respuestas de TH-302 monoterapia. Hs766T respondió más favorablemente a TH-302 de tratamiento [22], con una inhibición completa del crecimiento del tumor, mientras que MIA PaCa-2 tumores fueron moderadamente sensibles [34] y SU.86.86 tumores resistentes a TH-302 monoterapia [33]. La respuesta diferencial de las células PDAC
in vitro
y
in vivo
hace hincapié en la importancia de la fracción hipóxica dentro de un tumor de máxima eficacia TH-302
in vivo
, como la UB .86.86 tumores son altamente vascularizado y bien oxigenada, mientras que los tumores Hs766T tienen grandes fracciones de hipoxia [19] y una mutación en el gen FANCG reparación del ADN dependiente de homología (HDR) que los hace más sensibles al efector Br-MIP [35].
hidralazina y los "robar" efecto
Dado que el tratamiento de hidralazina ha demostrado previamente para reducir el flujo sanguíneo del tumor
in vivo
[28], la hipótesis de que la hidralazina podría utilizarse para aumentar transitoriamente la fracción hipóxica en tumores y aumentar TH-302 eficacia. La hidralazina también se ha demostrado que aumenta la acidosis tumor [29], que puede ser un método efectivo para identificar tumores que exhiben un efecto de "robar" que sería más sensible a la terapia de combinación. Para probar nuestra hipótesis, los ratones portadores de SU.86.86 subcutánea, tumores MIA PaCa-2 o Hs766T fueron anestesiados y pH tumor se midió usando un microelectrodo de pH. Para medir los cambios de pH resultantes de los cambios de flujo de sangre, los ratones se les administró 10 mg /kg intraperitoneal inyección hidralazina a través de (ip). Las mediciones de pH de los tumores se obtuvieron cada 30 minutos después del tratamiento hidralazina durante tres horas. La hipótesis de que los tumores que muestran el efecto de "robar" experimentarán la acidificación del tumor después del tratamiento con hidralazina. Los tumores Hs766T sensible TH-302 (n = 3) no mostraron cambio en el pH promedio después del tratamiento con hidralazina (Fig. 1). TH-302 tumores SU.86.86 resistentes (n = 7), sin embargo, la experiencia de un pequeño aumento paradójico de pH (+0,05 unidades de pH) después del tratamiento con hidralazina (Fig. 1). MIA paca-2 tumores (n = 4), que son moderadamente sensibles a TH-302, mostraron consistentemente un verdadero efecto de "robar" después del tratamiento hidralazina, experimentando una reducción significativa en el pH (- 0,12 unidades de pH) con relación a SU.86.86 (
p Hotel & lt; 0,007) y Hs766T (
p
. & lt; 0,05) (figura 1). Aunque había heterogeneidad entre las muestras tumorales, cada muestra ensayada respondió de manera similar a los otros tumores dentro de sus cohortes, como se evidencia mediante la observación del cambio de animales única máxima, la media de la respuesta máxima de cada animal durante el experimento y el cambio medio en pH para cada animales para cada punto de tiempo medido (Fig. 1). Estos resultados indican que la administración de hidralazina condujo a una disminución de la perfusión en MIA Paca-2 tumores, pero no afectó a la perfusión, ya sea en tumores Hs766T o SU.86.86.
Los ratones con SU.86.86 subcutánea (n = 7), Hs766T (n = 3) o MIA PaCa-2 (n = 4) tumores en los flancos se anestesiaron y se obtuvieron mediciones de pH tumor. Un electrodo de referencia se inserta bajo la piel del ratón en un sitio no tumoral, mientras que el electrodo de pH se insertó hasta 1,3 cm en el centro de cada tumor. Dos mediciones fueron tomadas en cada punto de tiempo y se promedian. Después de las mediciones iniciales de pH, los ratones se les administró 10 mg kg hidralazina a través de inyección /IP. pH del tumor se midió durante 3 horas después del tratamiento. informó datos representa el cambio máximo medio en cada cohorte, el cambio de pH promedio para cada cohorte y el solo animal máximo cambio de pH para cada cohorte. Los datos se presentan como media cambio en el pH ± SEM. *
P Hotel & lt; 0,05; **
P
. & Lt; 0,007
Para profundizar en los efectos de la hidralazina en tumores que mostraron el efecto de "robar", que utiliza el ultrasonido Doppler para medir el flujo sanguíneo del tumor tras tratamiento de hidralazina en MIA Paca-2 tumores. Antes del tratamiento hidralazina, imágenes Doppler en color se obtuvieron a través de MIA PaCa-2 tumores (n = 4) para identificar importante la vasculatura del tumor (Fig. 2A, panel izquierdo). El uso de un Doppler de onda pulsada (PW), el flujo de sangre a través de la vasculatura del tumor se midió durante 30 minutos después de la administración ip hidralazina (Fig. 2A, panel derecho). Se ha observado una reducción del flujo sanguíneo dentro de los 15 minutos de la inyección hidralazina (Fig. 2A, panel derecho). La cuantificación de estos datos confirmó una reducción del flujo sanguíneo del tumor a partir de 15 minutos después de la inyección de hidralazina con un descenso continuado a través de 30 minutos (Fig. 2B). El efecto de la hidralazina en el flujo sanguíneo puede persistir durante más de 30 minutos. Para explorar esta posibilidad, el flujo sanguíneo en Mia PaCa-2 tumores de páncreas ortotópico (N = 3), un modelo de tumor que es fisiológicamente más relevantes, se controlaron mediante ultrasonido Doppler durante 180 minutos. El flujo sanguíneo reducido a niveles mínimos en 30 minutos, apoyando las observaciones de tumores subcutáneos, pero en los tumores ortotópico, el flujo sanguíneo se mantuvo a este nivel durante 90 minutos con la recuperación que se produce entre 90 y 120 minutos. Debido a las similitudes en el flujo sanguíneo entre Mia Paca-2 tumores subcutáneos y ortotópico, estábamos seguros de que la monitorización de la oxigenación del tumor (70 minutos), utilizando electrodos de oxígeno en los tumores subcutáneos (N = 5) sería una representación exacta. De manera similar a los datos de los electrodos de pH, los niveles de oxígeno del tumor se redujo el plazo de 5 minutos después de la hidralazina, pero no vuelven a su nivel dentro del plazo de este estudio. La heterogeneidad se observa como el grado de disminución de oxígeno variado (Fig. 2D).
ratones portadores de MIA PaCa-2 tumores se analizaron por Doppler de ultrasonido para cuantificar el flujo de sangre del tumor. A)
Panel izquierdo:
Los tumores fueron escaneados utilizando imágenes Doppler color para identificar los principales vasos del tumor antes del tratamiento. El rojo representa el flujo sanguíneo en la vasculatura del tumor. Marcas de flecha blanca vasculatura elegido para el análisis.
Panel derecho:
Después de la administración de hidralazina, onda pulsada (PW) Doppler se utilizó cada 5 minutos durante 30 minutos para cuantificar el flujo sanguíneo a través de la vasculatura del tumor. diagramas representativos que muestran una disminución en el flujo sanguíneo del tumor después del tratamiento hidralazina. B) Cuantificación de los cambios de flujo sanguíneo del tumor en MIA PaCa-2 tumores subcutáneos (n = 4) después del tratamiento hidralazina. Los datos se presentan como velocidad media (mm /s) ± SEM. C) Cuantificación de los cambios de flujo sanguíneo del tumor en Mia PaCa-2 tumores de páncreas ortotópico (n = 3) después del tratamiento hidralazina. Los datos se presentan como velocidad media (mm /s) ± SEM. D) la oxigenación del tumor se midió antes y después de hidralazina usando OxyLite (oxígeno) en los electrodos de aguja subcutáneos Mia Paca-2 tumores (N = 5). Las mediciones se recogieron en el tiempo en un solo sitio dentro del tumor. Completar datos experimentales se pueden encontrar en la sección de métodos. Los datos se presentan como pO2 (mmHg). La flecha en t = 10 minutos designa I.P. inyección de hidralazina.
La evaluación histológica del PDAC vasculatura
Las muestras tumorales de cada línea celular se analizaron histológicamente para caracterizar la vasculatura. CD31 y actina de músculo liso (SMA) son dos tumor frecuente vasculatura inmunohistoquímica (IHC) los marcadores que identifican la presencia (CD31), y la madurez y el tono (SMA) de la vasculatura. no se espera que los tumores con vasculatura significativo que son tonal a exhibir el fenómeno de "robar", como la vasculatura del tumor sería dilatar en coordinación con los efectos sistémicos de tratamiento hidralazina. Utilizando el análisis positivo de píxeles, se cuantificó el porcentaje de Hs766T, SU.86.86 y MIA Paca-2 tumores que contenía CD31 y tinción de SMA. En consonancia con los resultados anteriores, SU.86.86 tumores tenían significativamente más CD31 (
p
& lt; 0,05) (Fig. 3A-B) tinción que cualquiera Hs766T o MIA PaCa-2, y significativamente más SMA (
p
. & lt; 0,005) de MIA PaCa-2 tumor muestras (Fig 3A, C). Estos datos indican que los tumores SU.86.86 son bien vascularizado con vasos maduros que se esperaría para dilatar en respuesta al tratamiento hidralazina. tumores MIA Paca-2 y Hs766T tenían cantidades similares de CD31 tinción (Fig. 3A-B). MIA PaCa-2 tumores tenían la menor cantidad de SMA tinción entre los tres tumores ensayados (Fig. 3A, C). Estos datos indican que MIA PaCa-2 vasculatura es inmaduro y atonal. Como MIA Paca-2 tumores muestran una disminución del flujo de tumores de sangre (Fig. 2) y una posterior disminución en el pH del tumor (Fig. 1), llegamos a la conclusión de que MIA Paca-2 tumores exhiben el efecto de "robar" debido a la vasculatura tumoral inmadura.
Hs766T, MIA PACA-2 y SU.86.86 tumores se fijaron y se incluyeron en parafina en la preparación para la tinción IHC para los marcadores de la vasculatura del tumor, CD31 y SMA. A) Imágenes representativas de tumores teñidos con CD31 y SMA. Las barras de escala representan 100 micras. análisis positivo pixel de B) CD31 y C) la tinción de SMA a través de todo el área de un tumor. Los datos se presentan como% de positividad [(píxeles positivos /píxeles totales) x 100] ± SEM. *
P Hotel & lt; 0,05; **
P
. & Lt; 0,005
hidralazina mejora TH-302 la actividad in vivo
Para probar TH-302 monoterapia y terapia de combinación con hidralazina para cada celda línea de xenoinjerto, los ratones se implantaron con Hs766T subcutánea, SU.86.86 o MIA PaCa-2 tumores en los flancos, y un par de concordancia en cuatro cohortes: sin tratamiento (solución salina), TH-302 por sí solo (50 mg /kg ip), solo la hidralazina (10 mg /kg ip) y la terapia de combinación /hidralazina TH-302. En la terapia de combinación, TH-302 se administró 30 minutos después de la administración de hidralazina como este parece ser el tiempo de efecto máximo sobre la perfusión post-hidralazina. Todas las cohortes fueron tratados durante dos ciclos de 5 tratamientos consecutivos, seguido de 2 días de descanso, y volúmenes de los tumores se monitorizaron con calibradores electrónicos durante el curso del estudio. se consideró el control de volumen del tumor por monoterapia o terapia combinada TH-302 perdido cuando los tumores alcanzaron 1.000 mm
3, que se detalla en las curvas de Kaplan Meier. Como se preveía, el crecimiento del tumor Hs766T se inhibió completamente con TH-302 monoterapia (Fig. 4A-B), el crecimiento del tumor no fue afectado por SU.86.86 TH-302 monoterapia (Fig. 4C-D) y MIA PaCa-2 tumores respondieron a moderadamente tratamiento (Fig. 4E-F). La terapia de combinación de hidralazina seguido por la administración de TH-302 no tuvo ningún efecto beneficioso sobre el control del volumen del tumor en ratones portadores de tumores Hs766T o SU.86.86 relativos a las cohortes tratadas con TH-302 monoterapia. Es importante destacar que, ninguno de estos modelos de tumor exhibieron el efecto de "robar" después de la administración de hidralazina (Fig. 1). MIA Paca-2 tumores responden moderadamente a TH-302 monoterapia (Fig. 4E-F) y experimentaron un aumento de la acidosis tumor debido a la reducción del flujo sanguíneo del tumor después del tratamiento con hidralazina (Fig. 1). Los ratones con MIA PaCa-2 tumores experimentaron una modesta reducción adicional en el crecimiento del volumen del tumor cuando son tratados con terapia de combinación /hidralazina-302 TH en comparación con TH-302 monoterapia (Fig. 4E-F). A pesar de una tendencia a la reducción en el crecimiento del tumor entre TH-302 terapia de combinación /hidralazina y la monoterapia TH-302, los análisis estadísticos de las curvas de crecimiento indican que las diferencias no alcanzaron significación estadística (
p
& lt; 0,08). Este experimento se repitió dos veces más con resultados similares (datos no mostrados). En todos los casos, MIA PaCa-2 tumores tratados con la terapia de combinación habían reducido el crecimiento, pero no fue significativamente menor (p = 0,08) que la del grupo de monoterapia TH-302.