Extracto
Los modelos de ratón han sido desarrollados para investigar la etiología del cáncer colorrectal y evaluar nuevas terapias contra el cáncer. Mientras ingeniería genética y modelos de ratón inducidos por carcinógenos han proporcionado información importante con respecto a los mecanismos que subyacen en el proceso oncogénico, modelos de xenoinjertos de tumores siguen siendo el estándar para la evaluación de nuevos fármacos quimioterapéuticos dirigidos tratamientos farmacológicos para el uso clínico. Sin embargo, no queda claro en qué medida explante de tejidos tumorales de colon conservan características patológicas inherentes en el tiempo. En este estudio, hemos generado un panel de 27 explantes derivados del paciente de cáncer colorrectal (PDCCEs) por trasplante directo de los tejidos de cáncer colorrectal humano en ratones NOD-SCID. El uso de este panel, se realizó una comparación de la histología, la expresión génica y el estado de mutación entre PDCCEs y los tejidos humanos originales de los que se derivaron. Nuestros hallazgos demuestran que PDCCEs mantienen características histológicas clave, patrones de expresión génica básica y
KRAS
/
BRAF
estado de la mutación a través de múltiples pasajes. En conjunto, estos hallazgos sugieren que PDCCEs mantienen similitud con el tumor del paciente de los que se derivan y pueden tener el potencial de servir como un modelo preclínico fiable que se puede incorporar en las estrategias futuras para optimizar la terapia individual para los pacientes con cáncer colorrectal.
Visto: Uronis fue JM, Osada T, S McCall, Yang XY, Mantyh C, Morse MA, et al. (2012) histológico y molecular Evaluación de cáncer colorrectal explantes-derivados de los pacientes. PLoS ONE 7 (6): e38422. doi: 10.1371 /journal.pone.0038422
Editor: L. Alana Welm, Instituto de Cáncer Huntsman, Universidad de Utah, Estados Unidos de América
Recibido: 8 de Marzo, 2012; Aceptado: 9 Mayo 2012; Publicado: 4 Junio 2012
Derechos de Autor © 2012 Uronis fue et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de la Mentored becarios de investigación Grant (119824-MRSG-10-195-01-TBG), de la Sociedad Americana del cáncer (www.cancer.org). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) es el tercer cáncer más común y la segunda causa principal de muerte por cáncer en los Estados Unidos. En 2010, aproximadamente 142.000 personas fueron diagnosticadas con CRC, y alrededor del 40% de estos pacientes presentan con enfermedad avanzada [1]. El tratamiento para el CCR avanzado con quimioterapia está destinado normalmente para el control de la enfermedad y la paliación de los síntomas solamente, y como resultado, no resecable CRC sigue siendo una enfermedad incurable. Con el fin de mejorar los resultados clínicos y desarrollar nuevos enfoques terapéuticos, se requiere el desarrollo de un modelo preclínico fiable para estudiar la biología y la CRC drogas sensibilidades.
Los modelos de ratón de CRC siguen siendo una de las herramientas más útiles para descifrar lo biológico mecanismos que subyacen al proceso oncogénico. Hasta la fecha, se han establecido una variedad de modelos de ingeniería genética, inducidos por carcinógenos y de ratón de xenoinjertos [2], [3] y en general se acordó que ningún modelo es suficiente para dilucidar todos los aspectos de la CRC etiología.
ratón genéticamente modificado (GEM) modelos han sido de gran valor para establecer el papel de muchos diferentes mutaciones genéticas y los patrones de transducción de señales que contribuyen al proceso oncogénico y permitir la investigación en el contexto de un sistema inmune activo [2], [3]. Sin embargo, muchos de estos modelos GEM, sobre todo las relacionadas con la mutación de la
APC
gen supresor de tumores, desarrollar tumores en el intestino delgado en lugar de los dos puntos. Esto hace que los estudios de progresión de la enfermedad longitudinal difícil además de carecer de la complejidad genética observada en los cánceres humanos [2], [3].
Otros modelos ampliamente usados ratón de CRC se basa en el uso de agentes carcinógenos para inducir el desarrollo del tumor colorrectal . Tal vez el modelo basado en el carcinógeno más ampliamente utilizado es el modelo azoximetano (AOM). Aquí, el desarrollo del tumor colorrectal se inicia por AOM, a, carcinógeno potente específico de colon a través de la formación de aductos de ADN [4]. tumores colorrectales derivados usando este modelo recapitulan las características patológicas humanos clave observados en los seres humanos y permiten la investigación de las primeras etapas de CRC. Sin embargo la iniciación del tumor y el desarrollo es un proceso que lleva tiempo, a menudo tomar hasta 6 meses con el número de tumores y penetrancia dependiendo en gran medida de la cepa de ratón [2], [5], [6].
Mientras que el IPG y el agente carcinógeno modelos basados han mejorado significativamente nuestro conocimiento de la genética y la etiología de la CRC, estos modelos no permiten para la prueba exacta de la terapéutica del cáncer para ser utilizado en el entorno clínico [7]. El
in vivo
modelo más ampliamente utilizado para la prueba de eficacia de los medicamentos contra el cáncer y combinaciones es el modelo de xenoinjerto. Históricamente, los xenoinjertos se han establecido a través de la inyección subcutánea de líneas de células derivadas de seres humanos genéticamente definidas en ratones desnudos inmunocomprometidos [8]. Sin embargo, hasta la fecha, la mayoría de estos modelos de xenoinjertos basados en la línea celular no han logrado generar datos de sensibilidad a los fármacos que se traduce en información clínicamente relevante [7]. Además, informes recientes sugieren que las interacciones tumor-estroma no se presentan en xenoinjertos basados en líneas celulares pueden representar un componente integral en respuesta potencial oncogénico y el tumor de drogas [9], [10]. Por lo tanto, más recientemente, los explantes de todo el tejido derivado de cánceres humanos incluyendo cáncer de mama [11], de pulmón [12], de próstata [13] y el cáncer de colon [14] - [16] se han establecido en un intento de generar clínicamente más precisa y modelos de xenoinjerto fiables. Sin embargo, estos estudios examinaron los explantes de paso principalmente al comienzo (& lt; 5 generaciones) de los tumores predominantemente primarios y, por tanto, sigue existiendo la necesidad de caracterizar mejor estos modelos y evaluar lo bien que se conservan importantes características del tumor humano original, especialmente en la enfermedad metastásica
H & amp; e manchadas secciones de dos adenocarcinomas bien diferenciados independientes (CRC039 y CRC075) muestran que la arquitectura del tumor sigue siendo similar después de 11 pasajes en ratones NOD /SCID. Las imágenes mostradas son a 20 × magnificación.
A. PDCCE Representante (CRC039) conserva la expresión de CDX2 nuclear después de 11 generaciones en ratones. Las imágenes mostradas son a 20 × magnificación. B. PDCCEs principios de paso conservan la morfología de sello del anillo observado en el tumor colorrectal original del paciente. Las imágenes mostradas son a 40 aumentos. C. xenoinjertos generados a partir de líneas de células WiDr y HT29 CRC carecen histológico características consistentes con la explantes derivados del paciente incluyendo la presencia de estroma y la formación de glándulas. Las imágenes mostradas son a 20 × magnificación.
En este estudio, hemos realizado un análisis molecular e histológica más completa de un panel de 27 explantes emparejados derivados de pacientes con cáncer colorrectal (PDCCEs) tanto de primaria y sitios de metástasis como una extensión de nuestro trabajo previo [17] en el que se comparó el perfil de expresión génica de 14 PDCCEs emparejados y sus tumores humanos correspondientes. Ahora demuestran que PDCCEs conservan los patrones globales de expresión génica, estado de mutación del oncogén y parámetros histológicos presentes en los cánceres humanos originales. En total, estos resultados sugieren que PDCCEs tienen el potencial de servir como un modelo preclínico fiable que se puede utilizar para desarrollar y caracterizar nuevas dianas terapéuticas para los pacientes con CCR.
Materiales y Métodos
Las muestras tumorales /Declaración de ética
se obtuvieron un total de 27 muestras humanas para el análisis genómico e histológica. Todos los pacientes dieron su consentimiento por escrito para el tejido tienen almacenados y utilizados para la investigación. Las muestras utilizadas para el análisis en el laboratorio fueron sin identificación, no vinculados con cualquier información personal de salud (PHI). Todas las partes de este estudio fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional de Duke. Se realizaron todos los estudios en animales en virtud de un Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Duke (IACUC) aprobó el protocolo.
análisis de agrupamiento no supervisado de 27 pacientes de tumores PDCCE igualada pares muestran que 22 pares (81%) cayeron dentro de la misma cluster y 18 PDCCE emparejado (66%) agrupado en pares directamente con el tumor original del paciente (cajas grises). nombres de las muestras que contienen un PDCCE X denote (xenoinjertos) muestras. El número inmediatamente después de la X indica el número de generación /aprobación de esa muestra particular.
Generación de cáncer colorrectal explantes-derivados de los pacientes (PDCCEs)
Los tumores colorrectales (tanto primarios como metastásicos ) en el momento de la cirugía fueron recogidos bajo un protocolo aprobado Duke IRB (Pro00002435). Los tejidos se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y después se desmenuzaron en trozos aproximadamente ~ 2 mm de tamaño y se inyectaron en los flancos de NOD.CB17-PrkdcSCID-J ratones 4 semanas de edad, obtenidos de Jackson Laboratories bajo un Duke IACUC aprobados protocolo. Los ratones se observaron y midieron los tumores con calibradores vernier hasta que el volumen del tumor ((V = L x 2W × 0,52 (L = diámetro más largo, W = diámetro más corto)) alcanzado ~1,000 mm
3. Los tumores se recogieron a continuación, picada y re-implantados como se ha descrito anteriormente hasta que se establecieron PDCCEs estables. en cada generación, los tumores se cosecharon y, o bien fijo en 10% formalina tamponada neutra (NBF), se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido o se congelan en la temperatura óptima de corte (OCT) medio en hielo seco para su posterior análisis
Preparación histológica y examen
incluido en parafina se seccionaron tejidos PDCCE en intervalos de 6 micras y se tiñeron con hematoxilina y eosina (H & amp; e).. Cada muestra . fue evaluada por un patólogo entrenado durante los siguientes criterios histológicos: tipo histológico, CDX-2 positividad, y el porcentaje relativo de tumor, necrosis, estroma, la formación de tumor de la glándula y CDX-2 núcleos positivos Todos los tejidos fueron examinadas usando & gt; 10 de alto se evaluaron los campos impulsados por sección. núcleos tumorales para CDX-2 tinción utilizando una escala cuantitativa estándar de 0, 1+, 2+ y 3+. La tinción de los núcleos tumorales en 2+ y 3+ se consideró positiva y todos los casos considerados positivos exhibió al menos el 20% de los núcleos tumorales con tinción.
Oncogene análisis de mutaciones
ADN genómico se aisló de complemento PDCCE tejidos congelados utilizando un kit de aislamiento de ADN genómico de Qiagen. Las muestras se diluyeron a 10 ng /l y PCR se realizó utilizando los siguientes cebadores para
KRAS
: delantero 5 'GTGTGACATGTTCTAATATAGTCA 3'; revertir 5 'GAATGGTCCTGCACCAGTAA 3' y
BRAF
: delantero 5 'TCATAATGCTTGCTCTGATAGGA 3'; revertir 5 'GGCCAAAAATTTAATCAGTGGA 3'. Los amplicones se secuenciaron mediante métodos convencionales usando los cebadores directos.
Análisis Microarray
Se aisló ARN de tejidos PDCCE snap-congelados utilizando un kit Qiagen RNA /DNA Allprep, convierten a ADNc y se marcaron por uno IVT ciclo. IVT etiquetado ADNc se prepararon según las instrucciones del fabricante, y los objetivos se hibridaron a la U133A humano 2,0 GeneChip y se leyeron en un escáner de matriz de Affymetrix. Los datos en bruto se convirtió en. CEL archivos y RMA normalizaron. CEL archivos (GSE35144) están disponibles en el repositorio de datos Gene Expression Omnibus (GEO) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). Para comprobar si hay valores extremos de la muestra y los efectos de lote, se realizó un análisis de componentes principales 3D de la expresión génica global. efectos lotes se normalizaron utilizando el algoritmo de combate (http://jlab.byu.edu/ComBat/) [18]. Sin supervisión agrupación jerárquica de los tumores humanos y PDCCEs búsqueda se realizó en el 20% de los genes con el mayor coeficiente de variación. racimos aglomerativas se generaron utilizando el coeficiente de correlación de Pearson y la vinculación completa con el programa de I (La Fundación de R estadística).
Software utilizado para el análisis
El paquete de software estadístico R está disponible en www .R-project.org. El paquete Bioconductor R está disponible en www.bioconductor.org. Combat está disponible como una secuencia de comandos de R en http://jlab.byu.edu/ComBat/. GraphPad Prism es un producto de software GraphPad (La Jolla, CA, EE.UU.) y está disponible en www.graphpad.com/prism/prism.htm.
Resultados
La evaluación histológica de PDCCEs
Un panel de 27 explantes de cáncer colorrectal derivados del paciente (PDCCEs) por trasplante directo de cáncer colorrectal humano (CRC) tejidos en ratones NOD-SCID se ha creado en este estudio. La Tabla 1 muestra el origen del tumor del paciente y un total de 5 PDCCEs primarios y metastásicos 22 PDCCEs se generaron. Para evaluar el grado en que
in vivo
modelos de los pacientes derivados de explantes de cáncer colorrectal (PDCEEs) recapitulan con precisión y por lo tanto pueden servir como un modelo de la condición humana, se investigó si PDCCEs conservan las características biológicas fundamentales inherentes a la persona cánceres colorrectales humanos (CRC) en el tiempo. En primer lugar, para evaluar el grado en el que se conservan los parámetros histológicos después del xenotrasplante, dos PDCCEs independientes se hicieron pasar a través de & gt; 10 generaciones y evaluados histológicamente. Ambos PDCCEs examinados mostraron características patológicas notablemente consistente con el tumor del paciente original a través de 11 generaciones (Figura 1). A continuación, una evaluación histológica completa realiza en un sub-grupo de 15 PDCCEs emparejados y tejidos en bancos originales revelaron que 15/15 PDCCEs conservan características patológicas similares a los observados en el tumor humano emparejado y se caracterizaron como histológicamente idéntico a su estado original emparejado peraltadas muestra (Tabla 2). Incluso después de 11 generaciones, PDCCEs conservan la capacidad de formar glándulas y contenían CDX-2 núcleos positivos comparables a los PDCCEs primera generación (Figura 2). Estos datos demuestran que las características histológicas presentes en el cáncer colorrectal, incluyendo la formación de glándulas y la presencia de los componentes del estroma se conservan incluso en explantes de paso de finales de los años, lo que sugiere que a diferencia de las células CRC xenoinjertos derivado de la línea, el modelo PDCCE nos proporciona una herramienta de investigación que recapitula la condición humana generalmente no se observa en otros modelos.
PDCCEs conservan la expresión génica global básico Perfiles inherente a los cánceres colorrectal humano
a continuación, para evaluar más a fondo la medida en que PDCCEs representan a sus contrapartes humanas primarias , se analizaron 27 tumores de pacientes emparejados y PDCCEs por el análisis de microarrays. los datos de expresión de genes tumorales del paciente y PDCCE se normalizó utilizando primero de combate para minimizar los efectos de lote. Seguidamente se realizó un análisis de agrupación jerárquica sin supervisión en el conjunto de datos normalizados y reveló tres grupos distintos (Figura 3). De los 27 emparejado tumor y del paciente PDCCEs, 22 pares (81%) estaban comprendidos en el mismo clúster basado en el dendrograma y 18 PDCCEs (66%) agrupadas directamente con la muestra de tumor original. En conjunto, estos datos sugieren que los patrones de expresión de genes globales básicos se conservan entre PDCCEs y sus homólogos humanos originales.
Oncogene mutación de estado se retiene en PDCCEs
Para los pacientes con cáncer colorrectal avanzado, la prueba del estado de mutación de oncogenes tales como
KRAS
se requiere para guiar la terapia. En concreto, los pacientes con
KRAS
mutaciones no muestran ningún beneficio del tratamiento con inhibidores de EGFR, como cetuximab o panitumumab, mientras que los pacientes cuyos tumores son
KRAS WT
obtienen beneficios de las terapias anti-EGFR basados en [19] , [20]. Para determinar si estos parámetros genómicos clínicamente significativos se mantienen en PDCCEs, 27 PDCCEs emparejados y las muestras originales de los pacientes se analizaron para
KRAS
y
BRAF
estado de la mutación. De los 27 pares emparejados evaluados, 13 se presentaron con la activación de
KRAS mutaciones
(codón 12 = 11; Codón 13 = 2) (Tabla 3). De estos 27 pares emparejados, 26/27 PDCCEs (96%) corresponden a su contraparte humana original que sugiere que los tejidos de cáncer colorrectal humano mantenidos como PDCCEs ratón son genéticamente estables y conservan el estado de mutación oncogénica crítica para CRC fisiopatología. Todas las muestras fueron negativas para los
BRAF
mutaciones. En conjunto, estos datos sugieren que PDCCEs mantienen las histológico, la expresión génica y de base de mutación biológicamente complejas características observadas en los CRC humanos.
Discusión
Hasta la fecha, se han establecido una serie de modelos de xenoinjertos de ratón CRC para investigar la etiología y el tratamiento. En gran medida, estos modelos se han generado utilizando líneas celulares finales de paso derivados de CRCs humanos y mientras que las respuestas significativas de tumores inducidos por el tratamiento se han observado en estos modelos, rara vez son predictivos de la respuesta del tumor en pacientes humanos [7]. Esto es probablemente debido en estos modelos, al menos en parte, a la inherente falta de estroma en líneas de células epiteliales derivadas del tumor. La evidencia creciente indica que la señalización paracrina y componentes de matriz extracelular suministrados por las células del estroma vecinos desempeñan un papel importante en el potencial oncogénico de carcinoma colorrectal y que la modulación de estas interacciones estroma afectar directamente a la eficacia de la quimioterapia en la respuesta del tumor [9], [10].
Los recientes intentos se han hecho para generar modelos de xenoinjertos de ratón de la Convención a cargo trasplante directo de los tumores de colon humano en ratones inmunodeprimidos [14] - [16], [21]. Poupon y compañeros de trabajo informó de que el paso de los tejidos de cáncer de colon humanos por medio de una etapa de xenoinjertos mejora de forma significativa la tasa de éxito de la derivación línea de células de metástasis de CCR humanos [15]. Más recientemente, Hohenadl y compañeros de trabajo informó de que las características histológicas y los niveles de expresión de oncogenes se conservan a principios de paso CRC xenoinjertos [21] mientras Fichtner et al., Y Messersmith y otros, paneles utilizados de 15- y 10 explantes CRC humanos respectivamente para evaluar la sensibilidad de drogas [14], [16]. Además, estos estudios utilizaron explantes derivados del paciente, principalmente desde el sitio primario y como tumores metastásicos tienden a ser más agresivo y es más probable que diferenciar, no queda claro si PDCCEs generados a partir de sitios metastásicos mantendrían similitud con el tumor original. Si bien estos estudios han comenzado a subrayar el valor de los modelos de explantes en la investigación CRC, se necesita un análisis histológico y molecular más completa en un panel más grande de los explantes CRC humanos para justificar su uso como un modelo preclínico para llevar a cabo el análisis de la eficacia del fármaco precisa y biomarcador predictivo identificación.
en este estudio, hemos demostrado que PDCCEs generados a partir de los adenocarcinomas humanos con diferentes características histológicas cada conservan los parámetros del tumor del que se derivaron en el histológico, la expresión del ARN global y los niveles de mutación del oncogén. A pesar de la existencia de diferencias en el porcentaje de estroma tumoral presente entre los tejidos humanos originales y los xenoinjerto en ratones, nuestro estudio se centra en las células epiteliales malignos. En primer lugar, la arquitectura histológica inherente a adenocarcinoma colorrectal, principalmente la capacidad de formar glándulas displásicas, así como la presencia de CDX-2 núcleos positivos se mantiene en las PDCCEs largo de varios pasajes (& gt; 10). A continuación, se compararon los perfiles de expresión génica entre PDCCEs emparejados y su correspondiente tumor del paciente y observamos que 18/27 (66%) de las muestras agrupadas directamente entre sí y 22/27 (81%) agrupados dentro del gran grupo como se define por el dendrograma .
los autores especulan que las 9 muestras PDCCE que no se agrupan directamente con su correspondiente tumor original puede haber sido debido a la propia naturaleza heterogénea de CRC. Es plausible que las muestras tumorales CRC originales correspondientes a estos 9 PDCCEs albergaban pequeñas subpoblaciones que llevan eventos oncogénicos adicionales. Esto a su vez conferir una ventaja de crecimiento a estas poblaciones después de ser trasplantado en el ratón, haciendo que el PDCCE tener una composición genética diferente que el tejido original del que se deriva. En apoyo de esta noción, parece que la mayoría de la variación entre el tumor primario y su PDCCE ocurren en pasajes PDCCE primeros y que menos variación se produce a través del proceso de pases. Por ejemplo, PDCCE CRC105 agrupado con la muestra original paciente en PDCCE pasos 1 y 11, mientras que PDCCE CRC149 no clúster con la muestra original, ya sea en el paso 1 ó 5 que sugiere que los cambios genéticos ocurren predominantemente en los primeros pasajes y se mantienen a través de pasos posteriores. También es posible, que en estos 9 muestras, que puede haber habido una contaminación mayor del estroma que resulta en una diferencia en su patrón de agrupamiento. Estos resultados sugieren que existen diferencias intrínsecas entre el tumor del paciente y adaptado PDCCE y extrapolaciones extraídas de estos modelos debe ser hecho con cuidado. Sin embargo, en general nuestros resultados sugieren que el modelo PDCCE tiene el potencial de ser utilizado en la investigación de nuevos agentes terapéuticos que se dirigen tanto a la arquitectura epitelial maligno tumor y /o el componente del estroma y que PDCCEs se pueden mantener durante 10 o más generaciones al tiempo que conserva clave parámetros histológicos.
Por último, se evaluó la
KRAS
y
BRAF
estado de mutación de los PDCCEs y demostraron que el estado de todas menos una de las mutaciones del oncogen se retuvo. Hemos observado un caso (CRC020) en el que un
KRAS
la activación de la mutación estaba presente en el PDCCE pero no se detectó en las muestras originales de los pacientes a pesar de que estas muestras agrupados por análisis de agrupamiento no supervisado. Es más probable que una pequeña población, indetectable de
KRAS
células mutantes estaba presente en el tumor pacientes en el momento de la resección quirúrgica y que el crecimiento ventaja conferida por
permitió KRAS
de activación para la posterior expansión de
KRAS
células mutantes durante pasajes PDCCE temprana.
a pesar de que ningún modelo de ratón nunca se hará una recapitulación de los resultados reales plenamente en los pacientes, el uso de modelos preclínicos es necesario y práctico para el desarrollo de la terapéutica los agentes y de biomarcadores y un primer paso crucial en traer estos agentes a la clínica. Nos damos cuenta de las limitaciones de nuestro modelo y que cualquier hallazgo que someterse a rigurosas pruebas para evaluar su exactitud, fiabilidad y reproducibilidad y también debe ser validado de forma retroactiva de múltiples muestras de pacientes. Sin embargo, creemos que nuestro modelo de ratón preclínico tiene el potencial de ser utilizado para identificar y probar nuevas combinaciones de agentes terapéuticos y desarrollar también ambos biomarcadores predictivos y pronósticos, que luego se pueden introducir de forma sistemática adelante en el ámbito clínico.
Reconocimientos
los autores desean dar las gracias a la instalación de centrales de microarrays de Duke para la recogida de los datos de microarrays.