Extracto
El objetivo de este estudio fue evaluar la capacidad de EVO para disminuir la viabilidad celular y la promoción de la detención del ciclo celular y la apoptosis en células de cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC). El cáncer de pulmón tiene las mayores tasas de incidencia y mortalidad entre todos los tipos de cáncer. La quimioterapia es el tratamiento primario para el CPCP; sin embargo, los fármacos que se utilizan actualmente para SCLC son menos eficaces que los utilizados para el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). Por lo tanto, es necesario desarrollar nuevos fármacos para tratar SCLC. En este estudio, los efectos de Evodiamina (EVO) sobre el crecimiento celular, la detención del ciclo celular y la apoptosis se investigaron en las líneas celulares de SCLC humanas NCI-H446 y NCI-H1688. Los resultados representan el primer informe que EVO puede inhibir significativamente la viabilidad de ambas células H446 y H1688 de maneras dosis y tiempo dependiente. EVO inducida por la detención del ciclo celular en la fase G2 /M, la apoptosis inducida por hasta la regulación de la expresión de la caspasa-12 y la proteína del citocromo C, y se indujo la expresión de Bax mRNA y por abajo de la regulación de la expresión de Bcl-2 mRNA en tanto células H446 y H1688. Sin embargo, no hubo efecto sobre la expresión de la proteína de la caspasa-8. Tomados en conjunto, los efectos inhibidores de EVO en el crecimiento de células H446 y H1688 pueden ser atribuibles a G2 /M detención y posterior apoptosis, a través de vías de estrés inducido por las mitocondrias dependientes y retículo endoplásmico (vías intrínseca dependiente de caspasa), pero no a través de la vía inducida por receptores de muerte (vía extrínseca de la caspasa-dependiente). Nuestros hallazgos sugieren que EVO es una novela prometedora y candidato potente fármaco antitumoral para el CPCP. Por otra parte, el ciclo celular, las mitocondrias y las vías de estrés ER son objetivos racionales para el futuro desarrollo de un sistema de suministro de EVO para el tratamiento de CPCP
Visto:. Colmillo C, Zhang J, D Qi, Fan X, Luo J, Liu L, et al. (2014) Evodiamine induce G2 /M detención y la apoptosis a través de la mitocondria y el retículo endoplasmático Rutas en H446 y H1688 humano de células pequeñas de cáncer de pulmón de células. PLoS ONE 9 (12): e115204. doi: 10.1371 /journal.pone.0115204
Editor: Irina Lebedeva V., Universidad de Columbia, Estados Unidos de América
Recibido: May 7, 2014; Aceptado: 19 Noviembre 2014; Publicado: 15 de diciembre 2014
Derechos de Autor © 2014 de Fang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del papel
Financiación:. Este estudio fue apoyado por el CSTC2012JJB10027 subvención del Comité de Tecnología de Chongqing Ciencia y, Chongqing, República Popular de China. La fuente de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es la forma más común de cáncer, que representan el 12,5% de todos los casos anuales de cáncer recién diagnosticados en todo el mundo. Además de una alta prevalencia, el cáncer de pulmón tiene la tasa de mortalidad más alta entre todos los tipos de cáncer [1]. El cáncer de pulmón puede ser clasificada en el cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC) y el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) en base a las características histopatológicas de la enfermedad. Aproximadamente 10% a 15% de todos los cánceres de pulmón son SCLC [2]. Clínicamente, SCLC se distingue de NSCLC por rápido crecimiento del tumor y la metástasis generalizada. De acuerdo con las directrices de la Sociedad Americana del Cáncer [2], la quimioterapia es el tratamiento principal para el CPCP, y cisplatino, etopósido, carboplatino e irinotecán son los fármacos más frecuentemente utilizados. efectos secundarios graves Sin embargo, estos fármacos sólo han limitado la eficacia y causar [3]. De hecho, la tasa de supervivencia de cinco años para el CPCP es más bien baja (3~8%) en comparación con la tasa de supervivencia de cinco años para todas las formas de cáncer de pulmón (& lt; 15%) [4]. Se necesitan con urgencia medicamentos nuevos y antitumorales eficaces con menos y menos graves efectos secundarios para mejorar los resultados clínicos
.
Evodiamine (EVO), un importante alcaloide quinazolinecarboline en
Evodia rutaecarpa
, tiene efectos citotóxicos sobre diferentes tipos de células cancerosas humanas, tales como células de glioblastoma [5], células de cáncer gástrico [6], las células de cáncer de mama [7], las células de cáncer de vejiga [8] y las células de cáncer de pulmón. Específicamente, EVO exhibe efectos citotóxicos sobre las diferentes líneas celulares de cáncer, incluyendo células de adenocarcinoma de pulmón A549 [9], las células H1299 [10], células CL1 [11] y las células de carcinoma de pulmón de células grandes H460 [12], [13]. En contraste con los efectos citotóxicos de EVO en diversas células del cáncer [14], EVO tiene poco efecto sobre células de sangre periférica humanos normales o en el peso corporal de los ratones portadores de tumores en su dosis efectiva [15].
por otra parte, algunos fármacos que tienen efectos citotóxicos sobre NSCLC también tienen efectos evidentes en SCLC, como wentilactone a, que es citotóxica para ambos H460 y H446 [16], y la glucosamina, que es citotóxica para las células A549 y H446 [17 ]. Por lo tanto, aunque no ha habido ningún informe de los efectos de EVO en SCLC hasta la fecha, EVO puede ser un potencial candidato a fármaco nuevo para el tratamiento del SCLC.
En este estudio, los efectos de EVO sobre la viabilidad celular, el ciclo celular y la apoptosis en las líneas celulares de SCLC humanas NCI-H446 y NCI-H1688 fueron investigados, y los mecanismos subyacentes se siguió examinando. Nuestros resultados indican que los efectos inhibidores de EVO en el crecimiento de células H446 y H1688 eran atribuibles a G2 /M detención y posterior apoptosis a través de la mitocondria dependiente y el retículo endoplásmico (ER) vías de activación de caspasa inducidas por el estrés (vías intrínseca dependiente de caspasa ), pero no a través de la vía de la activación de caspasa inducida por el receptor de muerte (dependiente de caspasa vía extrínseca). Hasta ahora, ningún fármaco ha sido informado de inducir la apoptosis en células de SCLC a través de la vía estrés ER. Nuestros resultados representan el primer informe que EVO induce la apoptosis en las líneas celulares H446 y H1688 SCLC través de la vía estrés ER. Además, no ha habido ningún informe anterior de un medicamento que induce simultáneamente la detención del ciclo celular y la apoptosis en las células de SCLC a través de vías mitocondrias mediada y de estrés ER. Se presenta por primera vez que indujo EVO G2 /M detención y la apoptosis a través de las vías tanto mitocondrias y mediada por estrés ER en las líneas celulares H446 y H1688 SCLC.
Materiales y Métodos
2.1 compuesto
Evodiamine (EVO) se adquirió de Yuancheng Technology Development Co., Ltd. (Wuhan, china), la pureza 99,13%. EVO se disolvió en dimetilsulfóxido (DMSO) para preparar una mM solución al 40 acciones, que se diluyó con Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 (Grand Island Biological Company, Grand Island, NY, EE.UU.) que contenía suero bovino fetal al 10% (FBS ) antes de cada experimento. La concentración final de DMSO no era más de 0,025% en este estudio.
Cultura
2.2 célula
El humano NCI-H446 y NCI-H1688 CEP líneas celulares fueron comprados de la Academia China de Ciencias Médicas (Pekín, china) y la Academia de Ciencias de china (Shanghai, china), respectivamente. células H446 y H1688 se cultivaron en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de SFB, 100 UI /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina (Gibco Co., Grand Island, NY, EE.UU.). Las células fueron incubadas a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO
2.
2.3 Ensayos de viabilidad celular
El H446 o H1688 células se sembraron a una densidad de 2 × 10
3 células /pocillo en microplacas de 96 pocillos (Corning Incorporated, Nueva York, EE.UU.). Las células se cultivaron durante 12 h, y el medio se reemplazó con medio RPMI 1640 que contienen diferentes concentraciones de EVO (1,25, 2,5, 5, 10 y 20 m). Después del final del período de incubación especificado (24 h, 48 h y 72 h), el medio se intercambió con medio fresco que contiene 20 l de tiazolilo solución de tetrazolio (MTT) 5 mg /ml de metilo (Sigma). Después de la incubación durante 4 h, la solución de MTT se eliminó y se reemplazó con 150 l de DMSO, y las microplacas se agitaron durante 5 min. La absorbancia se midió a 490 nm con un Multiskan GO microplacas espectrofotómetro (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, EE.UU.). La viabilidad celular se calcula como sigue: La viabilidad celular (%) = OD
grupo de prueba /OD
grupo de control x 100%, donde OD
grupo de prueba fue la densidad óptica (DO) de la EVO o DMSO grupo de tratamiento y el grupo de OD
control fue la densidad óptica del grupo de control negativo. H446 sin tratar o las células H1688 se utilizaron como grupo de control negativo. El IC
50 valor se refiere a la concentración de fármaco requerida para matar el 50% de las células [18]. Las viabilidades de células de diferentes concentraciones EVO se analizaron por software OriginPro 7 (OriginLab Corporation, Northampton, MA, EE.UU.), y luego se obtuvieron los IC
50 valores. Las morfologías de células incubadas con H446 EVO durante 24 h se visualizaron en un microscopio de fluorescencia invertido (ECLIPSE Ti-S, Nikon Instruments Inc., Tokio, Japón).
Ciclo
2.4 Análisis Celular y Apoptosis
Las células H446 o H1688 se cultivaron en 25 cm
2 frascos y se trató con 10 M EVO para 24 h. Las células fueron cosechadas por centrifugación y trypsinzation, y luego se fijaron con 70% de etanol a 4 ° C durante 12 h. Después de enjuagar dos veces con solución tamponada con fosfato (PBS), las células se resuspendieron en una solución de tinción de ADN que contiene 40 mg /ml de yoduro de propidio (PI) y 0,1 mg /ml de RNasa a 25 ° C en la oscuridad durante 30 min. Las células se analizaron con un citómetro de flujo FACSVantage (Becton-Dickinson, San Jose, CA, EE.UU.) equipado con el software CellQuest [18]. A continuación, se determinó y analizó la distribución del ciclo celular.
Se determinó la cuantificación de células
apoptótica usando un V-FITC /PI kit de detección de apoptosis anexina (Instituto de Biotecnología Beyotime, Shanghai, China). Se detectó la inducción de apoptosis en H446 o H1688 células después de 24 h de tratamiento con 10 mM EVO de acuerdo con el método de Anexina V-FITC /PI tinción. Se observaron las células H446 bajo un microscopio de fluorescencia Nikon Eclipse Ti invertida.
2.5 especies reactivas del oxígeno (ROS), el calcio libre intracelular (Ca
2 +), y el potencial de membrana mitocondrial (ψ
m )
ROS, Ca
2 + y ψ
m niveles se determinaron con un flujo FACSVantage citómetro utilizando los siguientes tres fluorocromos: 2 ', 7'-diacetato de diclorofluoresceína (DCF-DA) (Beyotime Instituto de Biotecnología, de Haimen, Jiangshu, china), Fluo-3 /AM (Instituto de Biotecnología Beyotime, Shanghai, china), y JC-1 (Instituto de Biotecnología Beyotime, Jiangshu, china), respectivamente [19]. En pocas palabras, H446 o H1688 células se sembraron a una densidad de 1 × 10
6 células /pocillo en placas de 6 pocillos (Corning Incorporación, Nueva York, EE.UU.) fueron tratados con 10 M EVO durante 24 h. Las células se recogieron, se centrifugaron y se resuspendieron en una solución de tinción que contiene 10 mM DCF-DA (5 M Fluo-3 /AM o 5 mg /ml JC-1) a 37 ° C durante 30 min (45 min o 20 min) y después se analizó utilizando un citómetro de flujo FACSVantage.
2.6 caspasa-3, 8 y 9. ensayo de actividad
El uso de ensayo de actividad de caspasa-3, -8 y -9 se midieron los niveles de actividad kits (Instituto de Biotecnología Beyotime, Haimen, Jiangsu, china). Brevemente, se recogieron H446 o H1688 células después de ser tratado con 10 M EVO durante 24 h (48 h o 72 h). Entonces, las células se lavaron con PBS frío, se volvieron a suspender en tampón de lisis (100 l por 2 x 10
6 células), dejó en hielo durante 15 min y después se centrifugaron a 18.000 ×
g
en 4 ° C durante 10 min. Los ensayos se realizaron en placas de microtitulación de 96 pocillos mediante la incubación de una mezcla compuesta por 10 l de lisado celular, 80 l de tampón de reacción y 10 l de la caspasa-3 (-8 o -9) sustrato (Ac-DEVD-pNA) a 37 ° C durante 4 h. La actividad de la caspasa-3 (-9 -8 o) en las muestras se cuantificó usando un espectrofotómetro Multiskan GO microplacas (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, EE.UU.) a una absorbancia de 405 nm.
2.7 Análisis de transferencia Western
El citocromo C (Cit C), caspasa-12, -8, -9 y -3, factor de suicidio asociado (Fas) y la necrosis del tumor inductor de apoptosis relacionado con el factor ligando (Trail) se midieron a el nivel de proteínas mediante inmunotransferencia de tipo Western. Se recogieron y se incubaron en el ensayo de inmunoprecipitación de radio células H446 tratadas con 10 M EVO durante 48 h (RIPA) de tampón de lisis (Beyotime Instituto de Biotecnología, de Haimen, Jiangshu, China) durante 60 minutos en hielo. Los lisados celulares se centrifugaron a 13.000 g durante 15 min, y las concentraciones de proteína en los lisados se determinó utilizando el ensayo de proteínas Bio-Rad tinte (Bradford) Reactivo (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE.UU.). Igual cantidad de proteínas se resolvieron por electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) y se transfirieron a membranas de transferencia Immobilon-P (Millipore Corporation, Bedford, MA, EE.UU.).
Las membranas se bloquearon con 5% sin grasa leche en tampón TBST (20 mM Tris-HCl, NaCl 150 mM y 0,05% de Tween 20). Cyt C, caspasa-12, -8, -9 y -3, Fas y Trail se detectaron utilizando anticuerpos primarios (de conejo anti-cyt C, caspasa-12, -8, -9 y -3, Fas y Trail) y secundaria anticuerpos (IgG de cabra anti-conejo (H + L), peroxidasa de rábano conjugada). Todos los anticuerpos fueron adquiridos de Beijing Biosíntesis Biotecnología Co., LTD., Beijing, China y se diluyeron con TBST 1:200 5% de leche desnatada (Sigma) antes de su uso. La concentración final de los anticuerpos fue de 20 mg /ml. Del mismo modo, Cyt C y la caspasa-12 y -8 se midieron en H1688 células tratadas con EVO durante 48 h mediante transferencia Western.
2,8 transcripción reversa de la polimerasa reacción en cadena (RT-PCR)
Total El ARN celular a partir de células H446 recién aisladas se aisló utilizando reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). El cDNA se sintetizó usando transcriptasa inversa (Genecopoeia Inc., Rockville, MD, EE.UU.). El producto del gen específico se amplificó mediante PCR con Taq ADN polimerasa (Fermentas, Waltham, MA, EE.UU.). Los conjuntos de cebadores para la PCR fueron las siguientes:
Bax sentido hebra: 5'-TTTGCTTCAGGGTTTCATCCA-3 ';
Bax cadena antisentido: 5'-CCAGCCTTGAGCACCAGTTT-3'.
Bcl-2 de cadena sentido: 5'-ACTTCGCCGAGATGTCCAGC-3 ';
Bcl-2 hebra antisentido: 5'-GCACCTACCCAGCCTCCGTTAT-3';
2.9 Análisis estadístico
cada experimento en este estudio se repitió 3 veces. Todos los datos se muestran como la media ± desviación estándar (SD) a menos que se indique lo contrario. Los análisis se realizaron con el paquete estadístico para las Ciencias Sociales (versión 13.0, SPSS Inc., Chicago, IL, EE.UU.). Se utilizó la prueba t de Student para determinar la significación estadística de las diferencias entre los grupos experimentales. La significación estadística se estableció en
P
. & lt; 0,05
Resultados
3.1 Los efectos inhibitorios de Evodiamine sobre el crecimiento de células
Los efectos inhibidores de EVO en crecimientos celulares de SCLC H446 y H1688 humanos fueron evaluados utilizando ensayos de citotoxicidad MTT. Como se muestra en la Fig. 1A, EVO inhibió el crecimiento SCLC H446 humano de una manera dosis-y dependiente del tiempo. La tasa de viabilidad de las células tratadas con H446 10 M EVO durante 24 h (~66%) se redujo en aproximadamente 16% comparado con el de las células tratadas con 1,25 M EVO (~82%). La tasa de viabilidad de las células tratadas con H446 10 M EVO durante 72 h (~ 35%) disminuyó en $ ~ $ 22% comparado con el de las células tratadas con 1,25 M EVO (~57%). El IC
50 valores para H446 células tratadas con EVO durante 24 h, 48 h y 72 h fueron & gt; 20 M, 18,07 M y 1,80 M, respectivamente
La viabilidad celular se midió por el ensayo MTT. . Las células se fotografiaron usando el microscopio. Cada experimento se repitió 3 veces. Datos presentados como media ± desviación estándar (n = 3). *
P Hotel & lt; 0,05 mostraron diferencias significativas entre los dos grupos. H446 sin tratar o las células H1688 se utilizaron como grupo de control negativo. El grupo 0 M EVO contenía 0,025% de DMSO. El DMSO 0,025% se usó para preparar 20 M EVO (la concentración máxima de la solución de EVO en el estudio). *
P
& lt; 0,05 en comparación con el EVO correspondiente grupo tratado en 24 h.
#
P Hotel & lt;.. 0,05 en comparación con el grupo tratado con EVO correspondiente a las 48 h
EVO inhibe el crecimiento de células SCLC H1688 humana de una manera ligeramente diferente (figura 1B ): (1) EVO inhibió el crecimiento celular H1688 SCLC humano de una manera dependiente de la dosis dentro de las 72 h. Las tasas de viabilidad de las células tratadas con H1688 10 M EVO (~49% a las 24 h, ~ 33% a las 48 h, y ~ 30% a las 72 h, respectivamente) se redujeron en ~19%, 19% y 21% en comparación con el tratado con 1,25 M EVO (~68% durante 24 h, ~52% durante 48 h y ~51% durante 72 h, respectivamente). (2) EVO inhibida H1688 crecimiento de una manera dependiente del tiempo en concentraciones que van de 1,25 M a 10 M dentro de las 48 h y a una concentración de 20 micras dentro de 72 h. (3) Las tasas de inhibición después del tratamiento de 48 h eran casi los mismos que los después de 72 h de tratamiento con EVO en concentraciones que van de 1,25 M a 10 M. (4) La IC
50 valores de EVO en H1688 células disminuyeron de 8,14 m (a las 24 h) a 2,08 mM (a 48 h) o 1,37 mM (a 72 h).
Después del tratamiento con 10 M EVO, las tasas de viabilidad de las células H446 o H1688 fueron ~66% o ~49% (24 h), ~56% o ~ 33% (48 h), y 35% o ~ 30% (72 h), respectivamente . Debido al efecto inhibidor evidente de 10 M EVO en H446 o H1688 células, la dosis intermedia de EVO (es decir, 10 mM) fue seleccionado para ser utilizado en todos los ensayos siguientes a menos que se indique lo contrario.
Fig. 1C indica que la morfología de las células H446 tratadas con diferentes concentraciones de EVO durante 24 h se alteraron sustancialmente. Cuando la concentración aumentó EVO, más células H446 se convirtieron en redondo y separadas de la placa de cultivo como su pseudópodos retraída gradualmente. EVO inhibió el crecimiento celular H446 de una manera dependiente de la dosis, excepto que las células H446 tratadas con EVO en 5 mM, 10 mM o 20 mM durante 24 h tuvieron efectos de citotoxicidad similares.
En conjunto, el componente de base de hierbas naturales EVO inhibió significativamente las viabilidades de las células H446 y H1688 SCLC de maneras dosis y tiempo dependiente.
3.2 Efectos de la Evodiamine en el ciclo celular y la apoptosis
para examinar la interrupción del ciclo celular fue el responsable de la inhibición del crecimiento celular mediada por EVO, se estudió la distribución del ciclo celular. Como se muestra en la Fig. 2A y 2B, EVO detenido selectivamente el ciclo celular en fase G2 /M (fase es decir, la pre-mitótico /mitótico). Después del tratamiento con 10 mM EVO durante 24 h, el número de tratados con EVO H446 o H1688 células en G2 /M (~63% o ~ 50%) fue aproximadamente 5 veces o 2,5 veces la de las células no tratadas (control blanco , ~13% o 20%). Mientras tanto, los números (~31% o ~29%) de EVO-tratados H446 o H1688 células en fase S (síntesis de la fase durante la cual se replican los cromosomas) eran casi los mismos que los de las células no tratadas (~ 30% o ~29%).
ciclo celular se detectó mediante un ensayo de PI. La apoptosis se detectó utilizando un ensayo de doble tinción con anexina V /PI. Se observaron las células H446 teñidas con anexina V /PI bajo un microscopio de fluorescencia invertido. Cada experimento se repitió 3 veces. Datos presentados como media ± desviación estándar (n = 3). *
P
& lt; 0,05 en comparación con el correspondiente grupo de control. Se utilizaron sin tratar o H446 H1688 células como grupo de control negativo.
La apoptosis también se conoce como el suicidio celular o muerte celular programada. Para determinar si la apoptosis inducida por EVO en SCLC H446 y H1688 células, las tasas de apoptosis fueron detectados por Anexina V-FITC /PI tinción doble. Después del tratamiento con EVO durante 24 h, como se indica en la figura. 2C y 2D, la tasa de apoptosis de H446 tratadas con EVO (~ 15%) o H1688 (~ 11%) de las células fue mucho mayor que la de las células no tratadas (control en blanco, ~ 5% o ~ 4%); como se muestra en la Fig. 2E, características típicas de la apoptosis, como la condensación de la cromatina y la marginación, la segmentación nuclear y formación de cuerpos apoptóticos, se observaron en las células tratadas H446-EVO. En resumen, EVO induce significativamente la apoptosis en las células H446 y H1688. Cabe señalar que en nuestros experimentos preliminares, se evaluó los efectos apoptóticos de dosis más bajas de EVO (como 1,25 M y 2,5 M). Las tasas de apoptosis de las células SCLC H446 tratados con 1,25 M EVO o 2,5 M EVO eran casi los mismos que los de los controles en blanco correspondientes (datos no mostrados).
3.3 Efectos de Evodiamine sobre ROS, Ca
2+ y ψ
m niveles
el ROS, Ca
2 + y ψ
m niveles eran factores críticos que indican la posible activación de las vías de apoptosis. La mayoría de las ROS son radicales libres que causan ADN, la proteína y el daño biomembrana [18]. El calcio intracelular es un importante factor de señalización intracelular. Ψ
m es un indicador clave de la salud de las células, ya que se relaciona con la capacidad de generación de ATP células. En este estudio, el ROS, Ca
2 + y ψ
m se midieron con sondas fluorescentes utilizando un flujo FACSVantage citómetro de [18]. Después del tratamiento con EVO durante 24 h, en comparación con los grupos de control, (1) los niveles de ROS en células de SCLC H446 tratadas con EVO aumentó en más de un cuarto (~28%) y, en H1688 células, los niveles de ROS más de duplicado (~104%) (Fig 3A y 3B.); (2) la intracelular de Ca
2 + niveles tanto en las células H446 y H1688 aumentó en un medio (~51% o ~48%) (figura 3C y 3D.); (3) el ψ
m niveles se redujeron en casi un tercio (~32%) y en un séptimo (~ 14%) en el H446 y H1688 células, respectivamente (Fig. 3E y 3F). Los resultados sugieren que EVO aumentó los niveles de ROS en células de SCLC. El exceso de ROS no sólo daña el ADN, sino que también daña la membrana mitocondrial y el aumento de permeabilidad de la membrana mitocondrial. Más de calcio fue liberado de la mitocondria y entró en el citoplasma. La concentración de calcio intracelular incrementa, y el potencial de membrana mitocondrial se despolariza parcialmente. EVO indujo apoptosis en las células SCLC H446 y H1688 a través de la vía mitocondrial mediada por ROS.
ROS, Ca
2 + y ψ
m se detectaron por separado por el DCF-DA, Fluo-3 /AM y JC-1 ensayos. Cada experimento se repitió 3 veces. Datos presentados como media ± desviación estándar (n = 3). H446 sin tratar o las células H1688 se utilizaron como grupo de control negativo. * P
. & Lt; 0,05 en comparación con el grupo control correspondiente
3.4 Efectos de Evodiamine en la caspasa-8, -9 y -3 Ensayo de actividad
Las caspasas son enzimas proteolíticas que son mediadores críticos de la apoptosis. Las actividades de la caspasa-8, -9 y -3 se determinaron por espectrofotometría. En comparación con los grupos de control correspondientes, aumentos significativos en la actividad de la caspasa-8, -9 y -3 se encontraron en células H446 tratadas con 10 mM EVO durante 24 h, 48 h y 72 h, con la excepción del aumento de la caspasa -8 actividad en las células EVO-tratada después de 24 h, que no fue estadísticamente significativa. Los niveles más altos de la caspasa-8 (~213%, Fig. 4A) y la actividad de caspasa-9 (~240%, Fig. 4B) se observaron después del tratamiento con EVO durante 48 h, mientras que el más alto nivel de actividad de la caspasa-3 ( ~564%) se observó a las 24 h (Fig. 4C). Sin embargo, las actividades más altas de caspasa-8 y -9 siguen siendo inferiores a la actividad de la caspasa-3 (~278%) en las células tratadas-EVO a las 48 h. Estos resultados sugieren que la apoptosis a través de vías EVO dependiente de caspasa inducida.
Los lisados celulares se analizaron mediante un ensayo colorimétrico de Ac-DEVD-pNA. Cada experimento se repitió 3 veces. Datos presentados como media ± desviación estándar (n = 3). actividades de caspasa se dan como unidades arbitrarias (UA) por miligramo de proteína. Se utilizaron células H446 sin tratar como un grupo de control negativo. *
P
& lt; 0,05 en comparación con el grupo de control correspondiente.
#
P Hotel & lt; 0,05 en comparación con el grupo tratado con EVO correspondiente a las 24 h.
P
. & Lt; 0,05 en comparación con el grupo tratado con EVO correspondiente a las 48 h
3.5 Efectos de Evodiamine en la expresión de la proteína Cyt C, caspasa-12, - 8, -9 y -3, Fas y Trail
Cyt C es una proteína mitocondrial implicada en la iniciación de la apoptosis mediada por mitocondrias. Las caspasas son proteasas de ácido aspártico en cisteína que son esenciales para la apoptosis. Caspasa-12 se localiza en el RE y implicado en la apoptosis mediada por ER. Caspasa-8 media la transducción de la señal aguas abajo de los receptores de muerte (DR), situados en la membrana plasmática y, por tanto implicadas en la apoptosis mediada por DR. La interacción de DR con sus ligandos naturales (tales como FasL y TRAIL) induce la activación de la caspasa-8. La caspasa-9 es una proteasa de ácido aspártico específico. Caspasa-3 es una caspasa ejecutor responsable de la condensación de cromatina y fragmentación del ADN en la apoptosis. Cyt C y la caspasa-12 y -8 desencadenar la activación de la caspasa 9 (caspasa iniciadora) y la caspasa-3 (caspasa efectora) antes de que finalmente indujo la apoptosis.
Para EVO-H446 tratadas o células H1688, en comparación con sus grupos de control correspondientes (el nivel se estableció como 100% en cada uno de los controles), (1) la proteína de los niveles de expresión de Cyt C aumentaron significativamente por ~220% y ~367% (véase la Fig. 5A y 5B), respectivamente , (2) la expresión de la proteína niveles de caspasa-12 aumentaron significativamente por ~248% y ~190% (véase la Fig. 5C y 5D), respectivamente, y (3) la expresión de la proteína niveles de caspasa-8 eran casi sin cambios ( ~94% y ~112%, respectivamente) (véase la Fig. 5E y 5F). La investigación adicional de las células H446 tratadas con EVO reveló que la marcada elevación del nivel de Cyt C produjo un aumento de la caspasa-9 y -3 expresión por ~275% y 204%, respectivamente (véase la Fig. 5G y 5H). Además, FasL y Trail, que son activadores de la caspasa 8, no se mantuvieron sin cambios (~102% y ~105%, respectivamente) (ver Fig. 5I y 5J). Los resultados sugirieron que Western Blot EVO aumentó el Cyt C y la caspasa-12 niveles en ambas células H446 y H1688 SCLC, por lo tanto EVO indujo la apoptosis a través tanto del mitochondria- y rutas mediadas por ER. Además, la expresión de la proteína elevada de la caspasa-9 y -3 indicó que EVO induce apoptosis a través de una vía de la caspasa-3-dependiente. Por el contrario, EVO no tuvo efecto sobre la expresión de la proteína de la caspasa-8 en las células, ya sea H446 o H1688 SCLC, lo que sugiere que no indujo la apoptosis a través de una vía mediada-DR.
Los lisados celulares se analizaron mediante transferencia Western . Cada experimento se repitió 3 veces. Datos presentados como media ± desviación estándar (n = 3). H446 sin tratar o las células H1688 se utilizaron como grupo de control negativo. *
P
& lt; 0,05 en comparación con el correspondiente grupo de control. Fas: factor de suicidio asociado; inductor de la apoptosis ligando relacionado con el factor de necrosis tumoral;: Rastro Cyt C: citocromo C
3.6 Efectos de Evodiamine sobre la expresión del ARNm de Bax y Bcl-2
BAX también se conoce como Bcl-2 como la proteína Bcl-4 o X-2 asociada; Bcl-2 significa linfoma de células B 2. Bax promueve la apoptosis antagonizando Bcl-2, que se considera específicamente una importante proteína anti-apoptótica. Al mismo tiempo, BAX y Bcl-2 se codifican por separado por los genes BAX y Bcl-2. Aquí, los niveles de expresión de la Bax y Bcl-2 genes fueron determinados por RT-PCR. En comparación con sus controles correspondientes, (1) el mRNA niveles de expresión de Bax en H446 o H1688 células tratadas con EVO se incrementaron significativamente por ~215% o ~135% (a 24 h), ~397% o ~172% (a 48 h) y ~514% o ~185% (a 72 h), respectivamente (Fig. 6A y 6B). (2) Por el contrario, los niveles de expresión del ARNm de Bcl-2 en EVO-H446 tratadas o células H1688 se redujeron significativamente por ~ 10 ~ 11% o% (a las 24 h), ~ 60% o ~28% (a los 48 h), y ~66% o ~53% (a 72 h), respectivamente (Fig. 6C y 6D). Tomados en conjunto, EVO aumenta la relación de Bax /Bcl-2 en el nivel transcripcional, que se espera que aumente aún más la relación de Bax /Bcl-2 a nivel de proteínas y, finalmente, la promoción de la apoptosis.
Los lisados celulares se analizada por RT-PCR. Cada experimento se repitió 3 veces. Datos presentados como media ± desviación estándar (n = 3). H446 sin tratar o las células H1688 se utilizaron como grupo de control negativo. *
P
& lt; 0,05 en comparación con el grupo control.
#
P Hotel & lt; 0,05 en comparación con el grupo tratado con EVO correspondiente a las 24 h.
P Hotel & lt; 0,05 en comparación con el grupo tratado con EVO correspondiente a las 48 h
Discusión
En este estudio, mostramos por primera vez. que EVO inhibe significativamente la viabilidad de las células de SCLC. El IC
50 valores de EVO en células H446 disminuyeron de & gt; 20 M (24 h) a 18,07 M (48 h) o 1,80 M (72 h); y en H1688 células, el IC
50 disminuyó de 8,14 M (24 h) a 2,08 mM (48 h) o 1,37 mM (72 h). EVO ejerce efectos inhibidores sobre las células H446 y H1688 de maneras de concentración-y dependientes del tiempo. Se documentó previamente que la IC
50 valores de EVO en células de NSCLC humanos fueron 12 M (48 h, las células H460) [13], 13,2 M (72 h, (R) -Evo, células H460) [12] , 2,6 M (72 h, (S) -Evo, células H460) [12], y 100 m (72 h, las células A549) [9]. En resumen, EVO exhibió actividad antitumoral en SCLC además de células de NSCLC. Además, en la mayoría de los casos, EVO inhibió el crecimiento de células H446 de SCLC más eficiente que la de las células H460 y A549 NSCLC.
La investigación de la distribución del ciclo celular demostró que la interrupción del ciclo celular era responsable de EVO- inhibición del crecimiento celular mediado. El número de células H446 y H1688 en fase S era casi sin cambios después del tratamiento EVO en comparación con el control. Sin embargo, EVO provocó una detención en G2 /M fase, es decir, H446, tratado con EVO y H1688 células acumuladas en la fase G2 /M. Una detención de las células en fase G2 /M en respuesta a estrés genotóxico (tales como agentes de estrés oxidativo y de intercalado de ADN) puede inducir daño del ADN, tanto en una manera dependiente de p53 (vía ROS) [20] y independiente de p53 [21].
se documentó previamente que la apoptosis inducida por EVO en diferentes células de cáncer humano a través de diferentes vías. Por ejemplo, en NSCLC H1299 células apoptosis fue inducida por medio de la supresión del factor nuclear (NF) ruta de activación -κB [10]; y en las células SW1990 pancreáticas, se indujo apoptosis mediante la regulación de la vía de PI3 K /Akt [22], en células de cáncer de vejiga 253J y T24, se indujo la apoptosis a través de mTOR /regulación a la baja S6K1 mediada de MCL-1 [8]. inducción de apoptosis por EVO en células H446 o H1688 SCLC se caracterizó por Anexina V-FITC /PI tinción doble, y los cambios morfológicos fueron evidentes en las células H446. Además, los resultados del presente estudio sugieren que la detención del ciclo celular en fase G2 /M se detuvo el crecimiento de células H446 y H1688 y finalmente llevó a la muerte celular por apoptosis a través de dos vías intrínseca dependiente de caspasa, pero no a través de la vía extrínseca de la caspasa-dependiente (Fig . 7):
la apoptosis fue inducida a través de la vía de activación de la caspasa mitocondrias mediada. Los resultados mostraron que EVO desencadena apoptosis mitocondrial acompañado por la acumulación de ROS. En este estudio, el cambio de permeabilidad de la membrana mitocondrial inducida por la generación de ROS condujo a la activación de la liberación de calcio intracelular, la pérdida de potencial de membrana mitocondrial, y la posterior liberación de Cyt C. Al ser un factor de apoptosis, Cyt C activan aún más la activación de caspasa 9 (caspasa iniciadora) seguido por la activación de la caspasa-3 (caspasa efectora), la inducción de la escisión de PARP y la inducción de la apoptosis final de [23]. Xu et al.