Extracto
Antecedentes
oncolisis mediada por virus es un nuevo enfoque terapéutico del cáncer con el potencial de ser más eficaces y menos tóxicos que los tratamientos actuales debido a la agentes de crecimiento selectivo y la amplificación en el tumor Células. Hasta la fecha, estos agentes han sido muy seguro en los pacientes, pero en general han estado a la altura de su valor terapéutico esperado como monoterapias. En consecuencia, se necesitan nuevos enfoques para generar virus oncolíticos muy potentes. Para hacer frente a esta necesidad, hemos desarrollado un nuevo método que denominamos "Evolución dirigida" para la creación de virus oncolíticos muy potentes.
Metodología /Principales conclusiones
Tomando el enfoque de "Evolución dirigida", la diversidad viral se aumentó mediante la agrupación de una serie de serotipos, a continuación, realizando pases las piscinas en las condiciones que invitan a la recombinación entre los serotipos. Estas piscinas virales muy diversas continuación, se colocaron bajo la selección dirigida estrictas para generar e identificar agentes muy potentes. ColoAd1, un virus quimérico complejo Anuncio3 /Ad11p, fue el virus oncolítico inicial derivada por esta novedosa metodología. ColoAd1, el primer anuncio describe oncolítico no basado en Ad5, es de 2-3 registros más potente y selectivo de los serotipos de los padres o el anuncio oncolítico clínicamente más avanzado, ONYX-015,
in vitro
. La eficacia de ColoAd1 se ensayó adicionalmente
in vivo
en un modelo de xenoinjerto de metástasis hepáticas de cáncer de colon después de la inyección intravenosa y su
ex vivo
selectividad se demostró en los tejidos tumorales de colon humanas derivadas de la cirugía. Por último, hemos demostrado la capacidad de armar ColoAd1 con un gen exógeno que se establece el potencial de impactar en el tratamiento del cáncer en múltiples niveles a partir de un solo agente.
Conclusiones /Importancia
Uso de la "Evolución dirigida "metodología, hemos generado ColoAd1, un nuevo virus oncolítico quimérico.
in vitro, España demostró este virus a & gt; 2 log aumento tanto en potencia y selectividad en comparación con ONYX-015 en las células de cáncer de colon. Estos resultados fueron apoyados además por
in vivo
y
ex vivo
estudios. Además, estos resultados han validado esta metodología como un nuevo enfoque general para derivar altamente potentes virotherapies clínicamente relevantes, contra el cáncer
Visto:. Kuhn I, P Harden, Bauzon M, Chartier C, J Nye, Thorne S, et al. (2008) Evolución dirigida Genera un nuevo virus oncolítico para el tratamiento de cáncer de colon. PLoS ONE 3 (6): e2409. doi: 10.1371 /journal.pone.0002409
Editor: Dong-Jin Yan, Universidad de Hong Kong, China
Recibido: 15 Febrero, 2008; Aceptado: 30 de abril de 2008; Publicado: 18 Junio 2008
Derechos de Autor © 2008 Kuhn et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Estos estudios fueron apoyados en su totalidad por Bayer Healthcare Farmacia
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El desarrollo de tratamientos eficaces para los sólidos humanos tumores sigue siendo un reto importante para los investigadores del cáncer y oncólogo por igual. Esto es debido a la complejidad de los tumores sólidos humanos, con múltiples, caminos, a veces redundantes que interactúan de señalización [1], diferencias de población de pacientes [2], y la capacidad para adquirir resistencia a los tratamientos, incluyendo las terapias moleculares recién desarrollados dirigidas, como erlotinib, gefitinib, e imatinib [3]. En consecuencia, los nuevos agentes, con mecanismos únicos de acción capaz de enfrentarse a esta complejidad, se necesitan.
Virus oncolíticos son agentes anti-cáncer únicas capaces de amplificar la dosis de entrada a través de la replicación de una manera-tumor dependiente. adenovirus humano (Ad) es uno de una serie de virus está siendo desarrollado como agentes oncolíticos para tratar tumores malignos humanos [4]. Los primeros ensayos clínicos y estudios preclínicos han demostrado la sinergia de este tipo de novela de la terapia del cáncer con quimioterapia estándar de atención [5] y la radiación [6], [7], [8]. Sin embargo, mientras que los anuncios oncolíticos probados en ensayos clínicos han demostrado marcada de seguridad, que han demostrado eficacia clínica limitada como monoterapias [9], [10], [11], [12]. En consecuencia, varios enfoques se están explorando para aumentar su potencia (que se define como la capacidad de los virus para replicarse, lisar las células, y la propagación), incluyendo el aumento de la eficiencia de la lisis celular [13], [14], [15], [16], [17], [18], la infectividad [19], y un "armado" con transgenes terapéuticos [20].
Hay 51 serotipos Ad humana definidos, agrupa a la F y estos serotipos difieren en una variedad de los niveles (por ejemplo, la patología en los seres humanos y roedores, propiedades hemagglutinatin, receptores celulares). Sin embargo, con la excepción de las alteraciones de la fibra [19], los serotipos Ad humanos alternativas al serotipo Ad5 bien estudiados han sido ignorados. Por lo tanto serotipos alternativos pueden representar una vía inexplorada para el desarrollo más potentes virotherapies.
Para explorar completamente su potencial, se empleó una metodología que denominamos "Evolución dirigida", en la que grupos de serotipos de anuncios, en representación de los diferentes subgrupos de anuncios, se pasan en tumor humano líneas celulares representativas de importantes indicaciones de tumores sólidos (mama, colon, páncreas, próstata) para invitar a la recombinación y la selección de variantes virales potentes o serotipos. Este enfoque simple, sin prejuicios utiliza la complejidad de la célula tumoral humana para dirigir la evolución de seleccionar los anuncios, altamente potentes de la piscina y es muy atractiva ya que puede ser dirigido hacia un resultado (por ejemplo, el desarrollo de un virus más lítico) sin perjuicio hacia el mecanismo (s) que pueden ser responsables de este resultado (por ejemplo, la eficiencia de la lisis celular, la infectividad, la replicación del ADN viral). ColoAd1, un virus aislado de la piscina viral se pasaron la línea de células de colon, muestra la potencia superiores a Ad5 en una serie de líneas de células tumorales de colon, y una ventana terapéutica más amplia en una colección de líneas tumorales de colon y las células normales primarias que el recientemente aprobado y virotherapy comercializado, ONYX-015 /H101 [21]. La potencia superior, se demostró además
in vivo en un modelo
la diseminación de tumores de hígado y la selectividad fue validado en el tejido de cáncer de colon extirpado clínicamente. Además, demostramos que podemos "brazo" de este nuevo agente mediante la incorporación de transgenes en el genoma viral sin comprometer la potencia del agente, lo que aumenta el potencial de este agente para tratar la complejidad de los tumores sólidos humanos. Esta es la primera descripción de un Ad oncolítico no basado en Ad5, y la explotación de los serotipos Ad alternativos marca un nuevo enfoque para el desarrollo de virus oncolíticos más potentes y selectivos para el tratamiento de cánceres humanos.
Resultados
Evolución dirigida de serotipos de adenovirus agrupados en diferentes líneas celulares tumorales se deriva claramente diferentes piscinas virales que son superiores en potencia a Ad5
La estrategia Evolución dirigida describe en los Materiales y Métodos (Figura 1
un
) es un enfoque imparcial para determinar si los serotipos alternativos, o recombinantes de los mismos, son superiores en potencia a Ad5 (el serotipo de todos los actuales Anuncios oncolíticos) en líneas celulares de cáncer humano. Como un método de baja resolución para seguir los cambios durante el paso de la piscina viral y para caracterizar la naturaleza homogénea /heterogénea de la piscina viral final, las piscinas se examinaron en una columna de intercambio aniónico TMAE aprovecharse de las diferencias de carga de la cápside viral asociados con cada serotipo (Figura 1
B Opiniones). Cada piscina viral recogido de las diferentes líneas celulares después del paso 20 eluyó como un único pico con tiempo de retención distinta (Figura 1
C
). Cada pico de elución de una piscina viral mediante pasajes apareció para hacer un seguimiento con uno de los serotipos originales (Figura 1
B Opiniones). Esto sugiere que todos los virus no son iguales en su potencia en una línea de células tumorales dado y que las diferencias en las líneas de células tumorales pueden seleccionar en busca de virus específicos de un virus mixto. Dado que al menos dos de estas piscinas virales seleccionados no siguió con el tiempo de retención de Ad5, Ad5 no está (basado en la potencia) la mejor virus para derivar todos los anuncios oncolíticos.
A, España Representación del proceso de Evolución dirigida (véase Materiales y Métodos para la descripción detallada).
B, cromatogramas de cada serotipo Ad pura incluido en el grupo mixto a partir del serotipo de la que fue seleccionado ColoAd1.
C,
cromatogramas del pasaje 20 piscinas virales derivados de la HT-29, Panc-1, líneas MDA-231, y PC-3 células tumorales, respectivamente. Los tiempos de retención diferentes de estas piscinas son consistentes con el serotipo predominante de la piscina ser Ad5 o Ad40 para la piscina Panc-1, Ad11p para la piscina HT-29, Ad3 o Ad4 para la piscina PC-3, y Ad5 o Ad40 para la piscina MDA-231.
se empleó un ensayo de MTS para comparar la potencia de las diferentes piscinas virales seleccionados a la piscina serotipo mixta original y al Ad5. Todas las piscinas virales seleccionados aumentaron en potencia en relación con Ad5 o la piscina de partida, con la magnitud del aumento varía significativamente entre las piscinas. Se observó el mayor incremento en la potencia relativa de Ad5 en la piscina a pases en la línea celular de tumor de colon HT-29 (aproximadamente 2 aumento log) con el menor aumento (1,2 veces) señaló en la piscina derivado de paso en la célula MDA-231mt1 línea (Tabla 1).
ColoAd1 es un potente y selectivo de virus oncolítico
Desde la piscina viral a pases en células HT-29 muestra el mayor aumento de la potencia de su celular afines línea, los virus dentro de este grupo fueron perseguidos para una caracterización adicional. virus purificados en placa individuales se aislaron y se seleccionaron mediante el ensayo de MTS por su potencial lítico en la línea celular de tumor HT-29. La potencia de las placas individuales se comparó con la de la piscina HT-29 de los que se aislaron. Se encontró que los virus purificados en placa para que sea igual o mayor en la potencia de la piscina HT-29. El más potente de estos virus purificado en placa, denominada ColoAd1, se eligió para una caracterización adicional.
Mientras ColoAd1 fue seleccionado para el crecimiento de la línea celular de tumor de colon HT-29, no estaba claro si este virus había aumentado potencia en todas las líneas de células tumorales, era selectivo para líneas de células tumorales de cáncer de colon, o era más potente en todos los tipos de células incluyendo las células normales primarias. Para hacer frente a las dos primeras preguntas, ColoAd1 se ensayó mediante el ensayo de MTS en todas las líneas de células tumorales originales utilizados en este estudio (Panc1-SCT, MDA-231mt1, HT-29 y PC-3), dos líneas de células tumorales adicionales (OVCAR-3, DU-145), y en un panel de líneas de células tumorales de colon (DLD-1, LS1034, HCT116, LS174T, SW48, SW403, Colo320DM), comparándolo con Ad5. ColoAd1 fue de 2 registros más potente que el Ad5 en la línea de células afines, HT-29. Además, ColoAd1 demostró actividad igual a o mayor que Ad5 en algunas líneas de células tumorales humanas (por ejemplo, PC-3, MDA-231, OVCAR-3, y DU-145), pero se atenuó (alrededor de dos logs menos potente que Ad5) en la línea celular Panc1 (Tabla 2). ColoAd1 mostradas aumentó significativamente la potencia (9 a 100 veces) con respecto a Ad5 en todas las líneas de células tumorales de cáncer de colon seleccionados, con la excepción de Colo320DM (Tabla 3). Esto sugiere que las líneas celulares de tumor de colon tienen propiedades que los hacen significativamente susceptibles a la infección y lisis por ColoAd1.
Para probar si ColoAd1 fue selectiva para las células tumorales sobre las células normales y por lo tanto, por definición , un virus oncolítico, ColoAd1 se examinó en dos líneas celulares de tumor de colon diferentes (HT-29, DLD-1), y en endoteliales primarias y las células epiteliales (HUVEC, HMEC) que comparan su potencia en cada ensayo MTS a Ad5 y ONYX-015 /H101. Los resultados muestran que ONYX-015 y Ad5 son significativamente menos potente que ColoAd1 en las líneas de HT-29 y DLD-1 de células (Tabla 4). En contraste, la potencia de ColoAd1 en células HUVEC fue el mismo que Ad5 y ligeramente más potente que el ONYX-015 (Tabla 4). En las células HMEC, ColoAd1 fue menos potente que Ad5 y ONYX-015 (Tabla 4). Para cuantificar estas diferencias entre ColoAd1, ONYX-015, y Ad5, un
in vitro
se calculó ventana terapéutica, que se define como la relación de la IC
50 de un virus dado sobre las células normales, HUVEC o HMEC , dividida por la IC
50 en las líneas de células de tumor de colon HT-29 o DLD-1 (Tabla 2). Estos cálculos establecer que ColoAd1 tiene una ventana terapéutica que es de 3 a 4 logs mayor que la de Ad5 o ONYX-015 /H101 en estos
in vitro
ensayos.
ColoAd1 es una virus quimérico que muestra la potencia mejorada sobre su virus parental, Ad11p
análisis
cromatográfico indicó que las principales proteínas de la cubierta de ColoAd1 se derivaron de Ad11p, un virus del grupo B. Para determinar la relación entre ColoAd1 y Ad11p, el virus se secuenció, revelando que ColoAd1 es Ad11p, con una región casi completa supresión E3, una deleción más pequeña en la región de E4, y una región de Ad3 /Ad11p E2B quimérico (Figura 2).
las diferencias genómicas entre ColoAd1 y Ad11p se indican en el esquema. En la región E2B hay sustituciones frecuentes de secuencias para las secuencias Ad3 Ad11p entre los pares de bases 6081 y 9322. Además, ColoAd1 tiene una casi completa (2.444 pb) E3 supresión región, y una más pequeña (25 pb), en segundo lugar que se asigna a su eliminación una región E4orf4 putativo del virus.
es posible que Ad11p o Anuncio3 son serotipos que son inherentemente más potentes, y tienen una ventana terapéutica más amplia, de Ad5, y que esta propiedad es independiente de la cambios genéticos adquiridos que se encuentran en el genoma ColoAd1. Para probar esto, hemos examinado ColoAd1, Ad11p y Ad3 en las líneas de células tumorales de colon de dos, HT-29 y DLD-1, y en endotelial humano primario y las células epiteliales primarias humanas, HUVEC y HMEC, respectivamente, por el ensayo de MTS. Tal como se presenta en la Tabla 4, ColoAd1 exhibió potencia superior sobre ambos Ad11p y Ad3 en las líneas de células tumorales de colon, lo que demuestra que este virus recombinante era superior en potencia a ambos de sus virus parentales. Curiosamente, Ad11p, y no Anuncio3, aparecerá una ventana terapéutica inherente como se define aquí, a través de análisis MTS. Por lo tanto, ColoAd1 es un derivado de Ad11p cuyas diferencias con Ad11p mejorar la potencia del virus sin alterar la capacidad natural del serotipo de replicarse selectivamente en las células tumorales frente a las células normales primarias.
Es importante tener en cuenta que la seroprevalencia informado de Ad11p es baja [22], [23] la mayor necesidad de este tipo de terapéutica se encuentra en poblaciones de pacientes en el que el tumor ha progresado a un cáncer sistémico, metastásico. Por lo tanto el tratamiento de pacientes con un agente que carece de inmunidad pre-existente debe mejorar la oportunidad para el agente a circular y eliminar las células tumorales metastásicas. Para confirmar los informes anteriores de baja seroprevalencia de Ad11p, se recogió el suero de seis individuos diferentes y se prueba para la capacidad de neutralizar la infectividad y el potencial lítico de estos virus en una línea celular reportero, OVCAR-3. De acuerdo con la literatura, el suero demostró poco efecto sobre ColoAd1 (datos no presentados), lo que sugiere que ColoAd1 puede ser un enfoque viable para el tratamiento sistémico del cáncer de colon.
ColoAd1 tiene actividad anti-tumor superior a ONYX -015 y Ad11p en un tumor de hígado cáncer de colon siembra modelo de ratón con xenoinjerto tras iv administración
La mayoría de los tumores sólidos son metastásica en el momento del diagnóstico. Dado que el sitio inicial de la metástasis del cáncer de colon es el hígado, el hígado del cáncer de colon modelo de diseminación de tumores [24] se utilizó para examinar la
in vivo
eficacia de ColoAd1. Para determinar primero si la actividad anti-tumoral viral depende de la capacidad del virus para replicar y propagación en este modelo, un estudio de respuesta a la dosis se llevó a cabo la comparación de ColoAd1 a una forma de replicación defectuosa de ColoAd1 (donde la región esencial E1 del virus fué borrado). Como se observa en la Figura 3
Un
, sistémicamente entregado ColoAd1 disminuye significativamente la carga tumoral en una dosis, y la replicación, de manera dependiente. Desde células HT-29 arrojan antígeno embrionario cancerígeno (CEA), este se puede utilizar como un sustituto fácilmente medida para la carga tumoral. Es importante destacar que las mediciones de CEA en la sangre (Figura 3
B
) correlacionan bien con los resultados de las mediciones de peso del tumor (Figura 3
A
).
HT-29 células de cáncer de colon se sembraron en el hígado de los ratones nude de color beige (n = 10 ratones por grupo de tratamiento). nivel de plasma CEA se utiliza para supervisar el establecimiento del tumor.
Un
y
B Opiniones, los ratones fueron tratados por (iv) la inyección de cola vena con 1 × 10
10, 5 × 10
10, o 1 × 10
11 partículas virales totales de ColoAd1 por ratón. Un cuarto grupo de ratones de hígado-portadores del tumor eran i.v. inyectados con 1 × 10
11 partículas virales totales de una replicación defectuosa [E1
(-)] versión de ColoAd1, ColoAd1CJ132. Un quinto grupo de ratones fueron inyectados con el control del vehículo (tampón). mediciones de peso Tumor demostrar que ColoAd1 tiene actividad anti-tumoral, que es dependiente de la dosis (
A
). los niveles de CEA en la sangre al final del estudio (día 12 después de la administración viral) corroboran los datos del peso del tumor (
B Opiniones).
C y D, España Comparación de la actividad anti-tumoral de ColoAd1, Ad11p y ONYX-015 en el modelo de xenoinjerto de metástasis hepáticas de ratón HT-29. En un segundo estudio realizado en el mismo modelo que en los Paneles A y B, ColoAd1 se comparó con su virus parental, Ad11p, y para el virus oncolítico-clínicamente aprobado ONYX-015; cada uno por vía intravenosa virus dosificado hasta un total de 1 × 10
11 partículas virales por ratón.
Para probar si el superior
in vitro
potencia de ColoAd1 en relación con Ad11p y ONYX-015 /H101 fue recapitulado
in vivo
, estos virus se compararon en el modelo de la diseminación de tumores de hígado. Como se observa en la Figura 3
C gratis (peso del tumor) y la Figura 3
D gratis (mediciones de nivel de CEA), la actividad anti-tumoral de ColoAd1 fue superior a ambos Ad11p y ONYX-015 en este modelo, corroborando la
in vitro
conclusiones.
Selectividad de ColoAd1 en los tejidos tumorales humanas aisladas de pacientes con cáncer de colon
in vitro
y
in vivo y modelos que predicen con exactitud la eficacia clínica han sido difíciles de identificar, y la falta de tales modelos de pronóstico sigue dando lugar a un extenso desgaste de los medicamentos contra el cáncer. En consecuencia, recién aisladas, material de cáncer de colon humano extirpado quirúrgicamente se examinó como un sistema modelo adicional para el ensayo de ColoAd1. Dado que el material quirúrgico incluye tanto el tejido del tumor y los márgenes normales de la célula, este sistema ofrece una excelente oportunidad para probar la selectividad tumoral del virus en el contexto de tejido humano intacto. La viabilidad de una serie de muestras de tumor se analizó en cultivo de tejidos; viabilidad varió de 2 a 6 días. En consecuencia, para asegurarse de que la muerte celular era debido a la inducida viralmente lisis y la liberación de la progenie del virus y no era debido a la lisis espontánea del material quirúrgico, se seleccionó un punto final de 24 hr. Seis muestras de tumores se recogieron y se generaron cultivos de perforación de tumor y las secciones normales (tal como se determina por un patólogo clínico) y se expusieron a cualquiera de Ad5 o ColoAd1. Para determinar la capacidad de cada virus para replicarse, se lisan y liberar el virus infeccioso, el sobrenadante se recogió 24 horas después de la infección y se ensayó para la presencia de virus de la progenie. Como se ve en la figura 4
Un
, ColoAd1 generó progenie aproximadamente dos troncos más viral en el material tumoral que en el tejido normal correspondiente, lo que confirma su replicación selectiva del tumor en el tejido tumoral humana recién aisladas. Estos estudios también demostraron que ColoAd1 exhibe al menos un registro de una mayor selectividad del tumor que el virus de control, Ad5.
A, España sacador muestras de tumores de colon humanos extirpados recién (n = 6) y áreas de márgenes normales de la misma, se infectaron con cualquiera de ColoAd1 o Ad5 y se mantuvieron en cultivo de tejidos. El estallido viral de cada muestra se midió por ensayo de placa a las 24 horas después de la infección.
B, tinción inmunohistoquímica para CD46 presente en el tumor de colon clínica, colon normal, y las muestras de hígado normales.
CD46 se ha identificado como un receptor para la unión celular Ad11p, el virus parental de ColoAd1 [25], [26]. Para definir mejor la expresión de CD46 en el cáncer de colon primario y metastásico, se analizó el material cáncer de colon, tejido hepático normal y tejido de colon normal para la expresión de CD46 por inmunohistoquímica (IHC) (Figura 4
B Opiniones). Fuerte tinción IHC CD46 se observó consistentemente en tejido de cáncer de colon, pero estaba ausente o generalmente débil en colon normal y tejido hepático. Esto sugiere que la expresión de CD46 puede ser un factor que contribuye a la selectividad tumoral observada de ColoAd1 y por lo tanto puede ser una herramienta potencial para los pacientes de pre-selección para el tratamiento con este agente terapéutico.
ColoAd1 puede ser armado sin comprometer potencia
virus oncolíticos Armadas buscan complementar la potencia del virus oncolítico de la adición de transgenes terapéuticos [20]. En este enfoque, es importante que un sitio de inserción del transgén terapéutico dentro del genoma viral se identificó que no comprometa el ciclo de vida y por lo tanto la potencia del virus. A diferencia de Ad5, en el que el la biología y la descripción de los sitios de inserción compatibles con el ciclo de vida viral están bien descritas, ColoAd1 representa un nuevo agente que se deriva principalmente a partir del genoma Ad11p poco estudiada. En consecuencia, se utilizó un sistema basado en transposón que puede explorar el genoma de los sitios de inserción en una forma no perjudicada por la identificación de los sitios de inserción del transgén compatibles [27] Dado que el genoma viral capacidad del Ad humano de codificación está limitada [28] un sitio aceptor de corte y empalme consenso fue colocado aguas arriba del transgén, eliminando la necesidad de un promotor exógeno y la vinculación de expresión a un promotor endógeno ColoAd1 [29]. Para mejorar la capacidad de identificar de transgenes que expresan variantes ColoAd1, GFP fue elegido como el transgén. Se generó un número de aislamientos virales y luego respecto a la potencia y un virus denominado ColoAd1-GFP se selecciona en base a la potencia equivalente a la de los padres ColoAd1 (Fig. 5A y 5B).
Los ensayos se realizaron en MTS y ColoAd1 ColoAd1-GFP en a) la línea de células tumorales de colon, HT-29 y B) las células endoteliales primarias, HUVEC. El gen reportero, GFP, se expresa con fines de cinética (es decir., Depende de la iniciación de la replicación de ADN viral para la expresión) como se define por la expresión C) sólo en ausencia de AraC y D) la falta de expresión en la presencia de AraC .
estudios anteriores utilizando un casete de expresión basado en aceptor de empalme demostraron que la expresión se produjo tarde en el ciclo de vida viral y era dependiente de la replicación del ADN viral [29]. La vinculación de la expresión del transgen terapéutico a la selectividad del virus tiene una ventaja de seguridad significativa sobre los sistemas tradicionales de expresión constitutivos ya que la expresión de genes sería limitada y depende de la selectividad tumoral del sistema viral [30]. Para determinar la cinética de expresión de GFP de ColoAd1-GFP, HT-29 células fueron infectadas en presencia o ausencia de AraC, un compuesto que inhibe la replicación viral. Como se ve en las figuras 5C y 5D, la expresión de GFP fue bloqueado por la adición de AraC que indica que la expresión se produce tarde en el ciclo de vida viral y está vinculada a la replicación viral.
Discusión
En el presente estudio hemos establecido las condiciones que seleccionan agentes virales potentes, sin sesgo hacia cualquier mecanismo, entre un grupo de serotipos Ad representan los subgrupos B Ad-F. Este método, que es una versión altamente acelerado de la selección natural de los virus, se puede aplicar a cualquier virus y cualquier tipo de cáncer de elección.
El uso de este proceso, hemos generado y caracterizado ColoAd1, una novela Ad3 /Ad11p virus oncolítico quimérico para el tratamiento de cáncer de colon humano y, potencialmente, otras indicaciones. Este virus fue demostrado ser más potentes y tienen una ventana terapéutica más grande que Ad5 y el virus clínicamente más avanzado oncolítico Onyx-015 (Tablas 2-4). Futhermore, ColoAd1 demostrado un aumento potentcy en un modelo de tumor por vía intravenosa y en explantes tumorales (Figuras 3 y 4) .Este virus tiene varios cambios relativos al virus Ad11p padre, incluyendo una región E2B quimérico y deleciones en las regiones E3 y E4. Que cambian o cambios desempeñan un papel en la potencia mejorada de este virus no es clara. La pérdida de genes de la región Ad5 E3 se ha demostrado en el grupo B Anuncios para mejorar la lisis viral y la propagación [31] por un mecanismo definido. La región E2B codifica la proteína pre-terminal (PTP) y el ADN viral de la polimerasa (ADN pol), dos de las tres proteínas E2 codificados necesarios para la replicación del ADN viral. El terminal de 18 pb del genoma viral, considerado el origen de replicación mínimo, interactúa directamente con la PTP y DNA heterodímero pol. Es importante tener en cuenta que cuando se secuenciaron los extremos genómicos de ColoAd1 y el tipo salvaje Ad11p eran idénticos a los de Ad3 y entraba en conflicto con la secuencia de ADN descrita termini descrito para Ad11p [32], [33]. Por lo tanto, las alteraciones en E2B ColoAd1 pueden generar un heterodímero pol PTP-ADN que es más compatible con el terminal de 18 pb de ColoAd1 que la pol Ad11p PTP-ADN original. Junto con el genoma más pequeño de ColoAd1 (resultado de deleciones genómicas) este virus puede replicarse más rápidamente y también alcanzar un tamaño crítico estallido viral más rápidamente, mejorando en consecuencia la lisis viral y propagación.
En lo que respecta a la selectividad, los estudios con el PTP de Ad5 han demostrado que interactúa con el CAD, una gran cantidad de proteínas responsables de la asociación matriz TP-nuclear. El nivel de CAD se correlaciona con la tasa de división celular; cuatro y cincuenta y ocho veces mayores niveles en las células tumorales que en las células normales y casi inexistente en células quiescentes [34], [35]. En consecuencia, las alteraciones TP y sus posibles interacciones con CAD (o proteínas similares) también pueden ser mecanismos de replicación y /o selectividad del virus mejorada.
La tercera alteración en el genoma viral ColoAd1 es una pequeña deleción (24 pb) que se asigna a la región E4orf4 del virus. La proteína E4orf4 de Ad5 interactúa con la serina /treonina proteína fosfatasa 2A de la célula huésped (PP2A), [36]. Esta interacción se ha demostrado que induce la apoptosis independiente de p53, inactivar factores de empalme, y reducir la activación E1A de AP-1, JunB, y la expresión de las unidades de transcripción Ad E2 y E4 [37]. Sin embargo, ya que la región E4 es muy corta y empalma, la deleción del gen E4orf4 puede también alterar la expresión de otro gen E4 en esta unidad de transcripción compleja, contribuyendo así indirectamente a la mayor potencia de ColoAd1. Además, no está claro que las proteínas Ad11p y Ad3 mantienen cualquiera o todas las funciones atribuidas a las proteínas Ad5 homólogas. Por lo tanto extrapolaciones de las funciones de las proteínas Ad5 a proteínas en ColoAd1 deben ser probados con cuidado. En consecuencia, si bien es evidente que CololAd1 ha sido objeto de una serie de alteraciones genéticas que dan como resultado un virus más potente, no está claro que la alteración (s) son responsables de la potencia mejorado.
Es importante señalar que ColoAd1 es un miembro del grupo B Anuncios y por lo tanto claramente diferente de los virus oncolíticos tradicionales basados en Ad5. No lo hace, por ejemplo, utilizar el receptor de Ad5, (Coxsackie B y adenovirus receptor, CAR), para su unión a las células. En su lugar, aparece ColoAd1 emplear al menos dos receptores que son claramente diferentes de coches [22], [38], [39], uno de los cuales ha sido descrito recientemente como CD46 [25], [26]. La importancia de esto se pone de relieve por los estudios recientes sobre el material clínico que muestran que CAR está mal expresada en una variedad de diferentes tipos de tumores y que la expresión CAR disminuye con el avance en la etapa y el grado del tumor [40] [41], [42, ], [43], [44]. informes adicionales de propiedades supresoras de tumores de coches [45], [46] y la detección de CAR soluble en el microambiente del tumor [47] poner en cuestión el uso de adenovirus dependientes del automóvil para el tratamiento de todos los cánceres humanos. En contraste, la expresión en superficie de células tumorales de CD46, el receptor de ColoAd1 putativo, parece aumentar con la etapa y el grado en una variedad de tipos de cáncer [48]. Por lo tanto, ColoAd1 puede tener utilidad terapéutica más allá del cáncer de colon, y los estudios para investigar este están en curso. De importancia adicional son los datos que demuestran que la seroprevalencia de Ad11p es baja [22], [23]. Dado que la mayor necesidad de este tipo de terapéutica se encuentra en poblaciones de pacientes en el que el tumor ha progresado desde un local de la enfermedad confinada a un cáncer sistémico, metastásico, el tratamiento de los pacientes con un agente al que ellos no tienen inmunidad preexistente debe mejorar la oportunidad de el agente circule y eliminar las células tumorales metastásicas. Esto está en contraste con Ad5 donde sero-prevalencia, medida por anticuerpos neutralizantes, alcanza niveles de aproximadamente 50% en la población general [23], [49].
Es importante tener en cuenta que la potencia de ColoAd1 puede complementarse con uno y potencialmente más transgenes terapéuticos. La capacidad de armar estos agentes representa una oportunidad única para impactar el tratamiento del cáncer en múltiples niveles a partir de un solo agente. Como se ha demostrado por la incorporación y expresión eficiente de GFP a partir del genoma ColoAd1, el armado se puede producir sin comprometer la potencia o la selectividad de la terapéutica viral. Además de los agentes que complementan el potencial oncolítico del virus (enzimas por ejemplo profármacos de conversión, los factores anti-angiogénicos, agentes inmunoterapéuticos,) que incorpora, armar crea la oportunidad para que los médicos realizar un seguimiento de la actividad del tratamiento virotherapy de una manera mínimamente invasiva [50] . Esto se hace aún más significativo si el método para el seguimiento de la virotherapy está directamente relacionado con el ciclo de vida viral. En el caso de ColoAd-GFP, este ha sido claramente demostrado, en donde se demostró la expresión de GFP a estar directamente relacionado con la replicación del ADN (Figura 5B). Varios genes han sido identificados que permitiría a los médicos a realizar un seguimiento de la actividad viral e incluyen genes asociados con la formación de imágenes de radionúclidos (por ejemplo HSV-1 TK, tiroidea humana yoduro de sodio symporter, [51], [52]) y los péptidos marcadores solubles fácilmente detectable en el torrente sanguíneo o por medio de muestreo de orina (por ejemplo, antígeno carcinoembrionario humano, de cadena β de la gonadotropina coriónica humana [53], [54], [55]). El uso de la expresión del gen ligado como un biomarcador de la replicación viral y la propagación representa una oportunidad para los médicos a personalizar el tratamiento, dando dosis adicionales sólo cuando sea necesario, por lo tanto alejándose de estándar, sincronizado dosis comúnmente asociados con los tratamientos de quimioterapia actuales. Igualmente importante, ya que consideramos el equilibrio de la necesidad de aumentar la potencia con la seguridad de la terapia viral, el armado podría también ser utilizado para incorporar una "válvula de seguridad" en la viroterapia, capaz de abortar el basado en la terapia viral a través de la administración de una clínicamente aprobado fármaco (por ejemplo. incorporación del gen TK del HSV y la administración de ganciclovir).