Extracto
El carcinoma gástrico es una de las principales causas de muerte por cáncer en todo el mundo. la detección y el tratamiento temprano conduce a un excelente pronóstico en pacientes con cáncer gástrico temprano (CGT), mientras que el pronóstico de los pacientes con cáncer gástrico avanzado (AGC) sigue siendo pobre. No está claro si EGCs y AGC son entidades distintas o si EGCs son las etapas iniciales de AGC. Se realizó la secuenciación del exoma de las cuatro muestras de pacientes con EGC y se compararon los resultados con los de AGC. En ambos EGCs y AGC, un total de 268 genes fueron mutados comúnmente y las mutaciones independientes se encontraron, además, en EGCs (516 genes) y AGC (3104 genes). Una mayor frecuencia de C & gt; G transiciones se observó en el tipo intestinal en comparación con carcinomas (
P = 0,010)
de tipo difuso. El
DYRK3, GPR116, MCM10, PCDH17, PCDHB1, RDH5
y
UNC5C
genes están mutados de forma recurrente en EGCs y pueden estar implicados en la carcinogénesis temprana
Visto:. Kang G , Hwang WC, Do IG, Wang K, Kang SY, Lee J, et al. (2013) Exoma secuenciación Identifica carcinoma gástrico precoz como una etapa temprana de cáncer gástrico avanzado. PLoS ONE 8 (12): e82770. doi: 10.1371 /journal.pone.0082770
Editor: Patrick Tan, Duke-Universidad Nacional de Singapur Escuela de Medicina de Graduados, Singapur
Recibido: 17 Julio, 2013; Aceptado 27 de octubre de 2013; Publicado: December 23, 2013
Derechos de Autor © 2013 Kang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por una beca de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (2012-P4KR 003) y una subvención de Samsung Instituto de Investigación Biomédica (# SBRI-SP1B20111). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. KW se emplea por Pfizer Inc. Sin embargo, esto no altera la adhesión del autor para todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales. Los autores han declarado que no existen otros intereses en competencia.
Introducción
El carcinoma gástrico (CG) es una enfermedad heterogénea con múltiples etiologías ambientales, las vías alternativas de la carcinogénesis y no conocida de alta frecuencia de perturbación oncogénico [1], [2], [3]. La clasificación de Lauren ha demostrado ser útil en la evaluación de la historia natural de GC, especialmente con respecto a las tendencias de incidencia, las correlaciones clínico-patológicas y precursores etiológicos [4]. Lauren clasificado adenocarcinoma gástrico en intestinal y difuso, según las características morfológicas del tumor [4], [5], [6]. Los carcinomas de tipo intestinal se cree que son secundarios a la gastritis atrófica crónica asociada con
H. pylori
y metaplasia intestinal [7]. Difusa de tipo GC no están asociados con metaplasia intestinal y pueden surgir de mutaciones de una sola célula dentro de las glándulas gástricas normales [4], [8], [9].
GC es una de las principales causas de cáncer- La mortalidad relacionada con todo el mundo. detección y tratamiento tempranos resultados en un excelente pronóstico para los pacientes con cáncer gástrico temprano (CGT), mientras que el pronóstico de los pacientes con cáncer gástrico avanzado (AGC) sigue siendo deficiente. Sin embargo, no está claro si EGCs y AGC son entidades distintas o son del mismo tumor progresa desde principios de los estadios avanzados [10]. Las firmas moleculares que distinguen EGC de AGC son importantes para ayudar a la identificación de nuevos marcadores de pronóstico y posibles dianas terapéuticas.
Recientemente, la secuenciación del exoma en 22 [11] y 15 [12] mostró muestras de AGC inactivación de las mutaciones frecuentes en la adhesión celular y la remodelación de la cromatina genes, y las alteraciones genéticas difieren entre los subgrupos estratificados por el virus de Epstein-Barr (VEB) o
H. pylori
la infección y el estado de inestabilidad de microsatélites (MSI). Para explorar más a fondo las alteraciones genéticas que subyacen a los GC, se realizó la secuenciación del exoma en cuatro parejas de EGC y el tejido normal, y se compararon los resultados con los de AGC.
Materiales y Métodos
Preparación de muestras
El tumor y los tejidos gástricos no neoplásicas fueron recogidos a partir de muestras de gastrectomía. El presente estudio se llevó a cabo después de la aprobación de la Junta de Revisión Institucional del Centro Médico Samsung, y todos los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito antes de la cirugía. Para muestras de tumores, masas eran & gt; 4 cm en la inspección macroscópica, y la mucosa superficial de cada tumor se adquirió. Después de incrustar en medios PTU, se cortó el tejido y H & amp; E manchada. Las muestras de & gt; 90% de contenido de tumores fueron seleccionados para la extracción de ADN con un mini kit (Qiagen, Valencia, CA, EE.UU.) y se trató con RNasa A para eliminar el ARN restante. ADN también se extrajo de tejido gástrico no afectado emparejado, que se obtuvo distante del sitio del tumor y se confirmó que estar libre de tumor. MSI se analizó con cinco marcadores NCI como se describe anteriormente [13]. La presencia de EBV fue detectado por EBV-encoded RNA
in situ
hibridación como se ha descrito anteriormente, y sólo los casos con señal fuerte dentro de la casi totalidad de los núcleos de las células tumorales se consideraron positivos [14]. Detalles adicionales para las muestras de LIG se proporcionan en la Tabla 1.
enriquecimiento Exoma y secuenciación
Exoma enriquecimiento (Kit SureSelect Human All Exon, Agilent Technologies) y las bibliotecas de secuenciación de Illumina se prepararon de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, 3 g de ADN genómico fue esquilada con el sistema Covaris S2; los fragmentos de ADN fueron reparados-final, ampliado con una "A" de base en el extremo 3 ', ligado con adaptadores de gama sincronizado y amplificado (cuatro ciclos). se hibridaron bibliotecas ligados a adaptadores que contiene Exoma durante 24 h con biotinilados cebos oligo-ARN y enriquecido con perlas magnéticas de estreptavidina conjugada. Las bibliotecas finales se amplifican aún más a través de 11 ciclos de PCR y se sometieron a secuenciación de Illumina en una pista del secuenciador HiSeq 2000 con un tamaño de inserción dirigida de ~ 180 pb. Toda la secuenciación se realizó con-extremo emparejado 65-bp lee y se realizó de acuerdo con el protocolo estándar de Ilumina. En promedio, se filtró pureza ~136.3 millones de lecturas se generaron para cada muestra. El porcentaje medio de lecturas duplicadas debido a la PCR y artefactos ópticos fue del 0% en nuestro conjunto de datos, y ~123.7 millones asignada de forma única lecturas se obtuvieron para cada muestra. En promedio, 69,1% de lecturas en cada muestra tenía al menos 50% de superposición con cualquier región de orientación ± 100 pb en la biblioteca exoma cebo SureSelect conjunto. Las regiones seleccionadas en cada muestra se secuenciaron para una profundidad media de 113,7 ×, con ~98.8% de las regiones seleccionadas cubiertas ≥1 ×, ~94.3% ≥10 x, ~82.4% ≥30 x, ~70.8% ≥50 x, ~66.4% ≥60 x, ~62.2% ≥70 x, ~58.2% ≥80 x, ~54.4% ≥90 × y ~50.8% ≥ 100 ×. Los resúmenes detallados de calidad de los datos en bruto se describen en la Tabla S1. A modo de comparación, el mismo algoritmo (SMART), que se utiliza en el conjunto de datos anterior de muestras AGC [11], se aplicó a estos datos para identificar las variaciones y las inserciones /deleciones (indeles) alteraciones de la secuencia de datos de lectura corta de un solo nucleótido somáticas. El conjunto de datos se ha depositado en el Archivo Europeo de nucleótidos y se puede acceder en http://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/PRJEB 4850.
Las mutaciones detectadas por secuenciación del exoma eran más validado por PCR y secuenciación de Sanger. Brevemente, los cebadores están diseñados usando el software Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu), y las secuencias se enumeran en la Tabla S3. Los productos amplificados por PCR fueron secuenciados utilizando un kit v3.1 Ciclo de Secuenciación BigDye Terminator y un secuenciador automático ABI 3700 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.).
Resultados
somática alteraciones en EGCs
en total, 2.389 mutaciones somáticas se identificaron en las cuatro muestras EGC, de los cuales 1.117 ocurrieron en regiones o sitios de empalme esenciales (627 sin sentido, sin sentido 32, 10 del sitio de empalme esencial, 169 y 279 de codificación indeles sinónimo) (Figura 1, y en las Tablas 2 y S2). Uno GC con MSI-alta tenía 727 mutaciones no silentes, incluidos los genes reparadores de desajustes (
MSH6
y
MSH3
), mientras que los tres microsatélites estables (MSS) muestras tenían un promedio de 37 años, diferencia de aproximadamente 20 veces. Las proporciones de no sinónimas a sinónimos en el cáncer del SMS tendían a ser más alta que la de la MSI-alta cáncer, pero la diferencia no fue estadísticamente significativa. C & gt; T y G & gt; A transiciones fueron la mutación más común (61%) en la CGT, y no hubo diferencias significativas en los cambios sencillos en pares de bases entre los cánceres del SMS (Figura 2A y la Tabla S4) MSI-alto y. De los 784 genes que albergan mutaciones no silenciosas, 13 se mutaron en dos o más muestras. Estos genes incluidos conocidos por estar implicados en la carcinogénesis gástrica (
TP53
) y reportado en el Catálogo de mutaciones somáticas en el Cáncer (cósmica) a mutar en GC (
DYRK3, MCM10, PCDH17 Opiniones y
UNC5C
) (Tabla 3). De los genes seleccionados para la validación,
PCDH17
mutación fue muy probablemente no validados por el método de Sanger, debido a las bajas frecuencias del alelo mutante (Tabla S3). Curiosamente, en un EGC de tipo difuso con MSI-alto, un
EGFR gratis (c.2224G & gt; A, p.V742I). Se identificó la mutación
La estrella (*) indica los resultados producidos en la misma plataforma.
la estrella (*) indica una diferencia significativa entre los de tipo difuso intestinal- y en todos los tipos de cáncer de microsatélites estables (
P
= 0,010).
Comparación entre EGC y AGC
Para la comparación de nuestros resultados en EGC con los de AGC, se utilizaron dos datos de secuenciación de toda exoma publicados recientemente [11], [12] . Wang
et al
. detectado 164 no silenciosa y 48 mutaciones sinónimo de media en 22 muestras de AGC con 116 × profundidad promedio de cobertura [11]. Zang
et al
. detectado en promedio 50 no silenciosa y 16 mutaciones somáticas sinónimas en 15 muestras de AGC con 96 × profundidad promedio de cobertura [12]. En la comparación directa entre los cuatro EGCs y 37 AGCs, no hubo diferencia significativa en el número de tipo de mutación (Figura 1). Los cambios de pares de bases individuales en EGCs fueron similares a un informe anterior por Wang
et al
. [11], que muestra una claramente mayor número de C & gt; T y G & gt; A transiciones, tanto en el SMS y los tumores MSI-alto (Figura 2A y la Tabla S4). Curiosamente, C & gt; G transiciones eran más comunes en los de tipo intestinal que en los GC de tipo difuso en todas las muestras del SMS, que incluyeron tres EGCs y 18 AGC (Wilcoxon rango suma de prueba,
P
= 0,010) (Figura 2B y la Tabla S4).
en el 37 AGC y 4 muestras EGC, se detectaron mutaciones no silentes (sin sentido, sin sentido, el sitio de empalme esencial y indeles) en 3.372 y 784 genes, respectivamente. En ambos EGCs y AGC, 268 genes fueron mutados comúnmente;
BCORL1, LRP2, LRP12, MACF1, PRKCI
y
TP53
genes se mutaron en al menos dos muestras de EGC, y el
ACVR2A, CCNL1, CTNNB1, FMN2, PTEN, rpl22 Opiniones y
TTN
genes, así como otros, se asociaron significativamente con el AGC con una tasa de falso descubrimiento de & lt; 0,2 [11], [12] (Figura 3). Análisis Funcional anotación utilizando DAVID (http://david.abcc.ncifcrf.gov) para examinar los genes que se encuentran superposición entre los dos conjuntos de la muestra reveló que los términos enriquecido significativamente incluyen unión a la actina, el citoesqueleto, la proyección de células y la unión célula-célula (Tabla . S5)
subrayado y en negrilla indica los genes con mutaciones en proteínas que alteran en al menos dos muestras de cáncer de primeros y los genes seleccionados con tasas de mutación más altas de lo esperado en el cáncer gástrico avanzado (tasa de falso descubrimiento & lt; 0,2 ), respectivamente.
Discusión
a pesar de que la secuenciación del exoma ha sido reportado en 37 muestras de AGC [11], [12], no ha habido ningún estudio de este tipo para evaluar la carcinogénesis temprano a las el nivel genético. Para explorar el repertorio completo de mutaciones somáticas en la CGT, se realizó la secuenciación del exoma de cuatro muestras pareadas EGC, y encontramos firmas genéticas distintas y comunes entre CGT y AGC que pueden identificar genes implicados en la carcinogénesis temprana y posterior progresión.
Los cánceres epiteliales tienen a menudo la variable que apunta espectros de mutación para determinados estímulos mutagénicos [15], [16]. Por ejemplo, las altas tasas de A & gt; C y C & gt; se observaron T transiciones en los adenocarcinomas de esófago y melanomas expuestas al sol, respectivamente, lo que sugiere que estas mutaciones son atribuibles a reflujo gastroesofágico y la exposición ultravioleta [15], [17]. Un estudio de la secuenciación de todo el genoma anterior en dos adenocarcinomas gástricos mostró frecuente C & gt; A y T & gt; A alteraciones en comparación con genomas normales [18]. Aquí, encontramos frecuentes C & gt; G transiciones en los carcinomas de tipo intestinal en comparación con los GC-tipo difuso después de la exclusión de MSI-alto GC. Nuestros únicos de observación garantiza futuros estudios para definir la etiología específica que potencialmente contribuye a la comprensión de las vías moleculares complejos y poco conocidos de los GC de tipo intestinal.
A través de análisis comparativo, se identificaron 268 genes superpuestos con mutaciones no silentes compartidos por tanto EGCs y AGC (Figura 3). Alrededor de un tercio de las mutaciones no silenciosas en EGCs se comparten con AGC y 8% de las mutaciones no silentes se encuentran en AGCs se comparten con EGCs. Un estudio previo con el análisis de la expresión de genes mostró que la mayoría de las alteraciones asociadas con EGCs se retienen en AGCs y más cambios de expresión marcar la transición de la EGC a AGC [10]. En general, estos resultados indican que EGC representa una etapa molecular temprana de AGC, y los genes mutados comúnmente juegan un papel importante en la progresión de EGC a AGC. Nos volvió a confirmar que
TP53
es el gen más frecuentemente mutado en los GC, con
TP53
mutaciones encontradas en la mitad de EGC y dos tercios de las muestras de AGC. Entre los genes que se superponen,
AKAP9, CAMTA1, COL1A1, CTNNB1, KDM5A
y
rpl22
fueron anotados como oncogenes, mientras que
ATM, FBXW7, MSH6, NF1, PTEN, SETD2
y
TP53
eran genes supresores de tumores por el gen de censo de Sanger (http://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/census). De los genes del cáncer del censo, que identificó por primera un
EGFR
mutación (c.2224G & gt; A, p.V742I) en una de tipo difuso EGC con MSI-alto. En un estudio reciente sobre 63 MSI-alta GC,
EGFR
mutación no fue detectada por secuenciación directa del dominio quinasa (exones 18, 19, 20 y 21) [19]. La misma mutación V742I se ha informado en un paciente con cáncer de endometrio y en una línea celular de glioma [20], [21]. La importancia clínica de esta rara mutación debe ser validado en un futuro próximo.
A pesar de la prevalencia de mutaciones recurrentes en EGCs era relativamente baja, 13 genes fueron mutados en al menos dos muestras, y tenía muy pocos sinónimo, mutaciones intrónicas y /o no traducidas. Entre estos 13 genes,
DYRK3, GPR116, MCM10, PCDH17, PCDHB1, RDH5
y
UNC5C
puede ser específico para GC etapa temprana, lo que sugiere un posible papel en la carcinogénesis temprana. En nuestra serie,
PCDH17
mutaciones ocurrieron en GC de tipo intestinal con el SMS, incluyendo una muestra VEB positivo. Anteriores análisis genómicos globales de colon y cáncer de páncreas también revelaron mutaciones sin sentido en algunos miembros de
Pcdh
(protocadherin) subfamilias [22], [23]. Sin embargo, las mutaciones detectadas en nuestros EGCs por secuenciación de Illumina no se confirmaron por secuenciación de Sanger, probablemente porque las frecuencias de los alelos mutantes eran muy bajos.
UNC5C
pertenece a la familia de receptores de dependencia funcional, cuyos miembros comparten la capacidad de inducir la apoptosis en ausencia de sus ligandos [24], [25]. metilación aberrante de este gen se ha informado en el curso de la carcinogénesis gástrica, y esta metilación desaparecido en GCs altamente avanzada [26]. Para el resto de genes, su relevancia funcional en GC aún no está claro.
La pérdida de función en moléculas de adhesión celular incrementa la capacidad de las células tumorales de invadir el tejido circundante, y la disfunción en el complejo remodelador de la cromatina promueve la inestabilidad cromosómica que impulsa la tumorigénesis [27]. Ninguna de nuestras muestras EGC tenían mutaciones en proteínas que alteran los genes de remodelación de la cromatina se encuentran en AGC, como
ARID1A, MLL3, PBRM1
y
MBD2
[11], [12], lo que sugiere la cromatina modificación se produce tarde en la progresión de la GC.
en general, nuestro estudio sugiere que EGC y AGC comparten mutaciones somáticas comunes, y AGC se asocia con alteraciones genéticas acumuladas adicionales en la adhesión celular y genes remodelación de la cromatina. Las firmas moleculares que distinguen EGC de AGC son importantes para ayudar a identificar nuevos marcadores de pronóstico y posibles dianas terapéuticas. Se necesitan estudios más amplios para determinar el significado biológico de los genes mutados de forma recurrente en la CGT.
Apoyo a la Información sobre Table S1.
Resumen de las estadísticas de secuenciación del exoma conjunto de cuatro pares de muestras gástricas
doi:. 10.1371 /journal.pone.0082770.s001 gratis (PDF) sobre Table S2. List de todas las mutaciones somáticas en los cánceres gástricos tempranos identificados por secuenciación del exoma
doi:. 10.1371 /journal.pone.0082770.s002 gratis (XLS) sobre Table S3.
Los cebadores para la secuenciación de Sanger, y la frecuencia de los alelos resultados de la validación
doi: 10.1371. /journal.pone.0082770.s003 gratis (PDF) sobre Table S4.
Comparación de los espectros de mutación somática en los cánceres gástricos por el estado y el tipo histológico del tumor
doi:. 10.1371 /journal.pone.0082770.s004 gratis (PDF) sobre Table S5. análisis de la vía
DAVID de los 268 genes superpuestos entre los cánceres gástricos tempranos y avanzados
doi:. 10.1371 /journal.pone.0082770.s005 gratis (XLS)