Resumen
Antecedentes y objetivos
Este estudio fue diseñado para identificar y validar las firmas de genes que pueden predecir la supervivencia libre de enfermedad (DFS) en pacientes sometidos a una resección radical de sus metástasis hepáticas de cáncer colorrectal (CRLM).
Métodos
perfiles de expresión génica del tumor se obtuvieron de 119 pacientes sometidos a cirugía para su CRLM en el hospital Paul Brousse (Francia) y el Centro Médico Universitario de Utrecht (Holanda). Los pacientes fueron divididos en grupos de alto y bajo riesgo. Un conjunto de entrenamiento seleccionada al azar se utilizó para encontrar firmas de predicción de genes. La capacidad de estas firmas de genes para predecir DFS fue probado en un conjunto de validación independiente que comprende el resto de pacientes. Por otra parte, las puntuaciones de riesgo conocidos 5 clínicos fueron probados en nuestra cohorte completa del paciente.
Resultado
No hay ninguna firma de genes se encontró que predijo significativamente DFS en el conjunto de validación. Por el contrario, tres de cada cinco puntuaciones de riesgo clínicos fueron capaces de predecir DFS en nuestra cohorte de pacientes.
Conclusiones
No se encontró firma genética que podría predecir DFS en pacientes sometidos a resección CRLM. Tres de cada cinco puntuaciones de riesgo clínicos fueron capaces de predecir DFS en nuestra cohorte de pacientes. Estos resultados enfatizan la necesidad de validar las puntuaciones de riesgo en los grupos de pacientes independientes y sugieren diseños mejorados para futuros estudios
Visto:. Snoeren N, van Hooff SR, Adam R, R van Hillegersberg, Voest EE, Guettier C, et Alabama. (2012) La exploración de la expresión génica firmas para predecir la supervivencia libre de enfermedad después de la resección del cáncer colorrectal metástasis hepáticas. PLoS ONE 7 (11): e49442. doi: 10.1371 /journal.pone.0049442
Editor: Ajay Goel, Baylor University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 1 de mayo de 2012; Aceptado: 7 Octubre de 2012; Publicado: 21 Noviembre 2012
Derechos de Autor © 2012 Snoeren et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la subvención holandés Cancer Society desde 2007 hasta 3923. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal es el tercer cáncer más común en hombres y la segunda en mujeres en todo el mundo, lo que representa aproximadamente 608.000 muertes en todo el mundo [1]. El hígado es el sitio más común y con frecuencia sólo de la enfermedad metastásica. El desarrollo de metástasis en el hígado en aproximadamente 50% de los pacientes es el principal determinante de la supervivencia en pacientes con cáncer colorrectal. La resección quirúrgica es la mejor opción de tratamiento para los pacientes con metástasis hepáticas de cáncer colorrectal que ofrecen una supervivencia media de más de 40 meses después de la resección en comparación con una supervivencia media de 18 meses cuando se tratan con quimioterapia y 6 a 12 meses si los pacientes permanecen sin tratamiento [2]. Por desgracia, el 60% -80% de los pacientes desarrollan recidivas locales o distantes después de la resección R0 de metástasis hepática colorrectal [2] - [5]. Los pacientes con recurrencia son susceptibles de beneficiarse de la quimioterapia adyuvante. Sin embargo, el 20-40% de los pacientes no desarrollan recurrencia y probablemente mejor dejarse sin tratar después de la resección hepática. Dado que la quimioterapia se asocia con una morbilidad y mortalidad graves, el riesgo asociado a la terapia, por tanto, debe estar justificada por una mejora significativa en la supervivencia de estos pacientes.
Muchos grupos de investigación han tratado de definir los factores que predicen la supervivencia libre de enfermedad y la supervivencia global (OS) después de la resección de metástasis de hígado [5], [6]. Recientemente, cinco publicados puntuaciones de riesgo clínicos, la combinación de diferentes factores clínicos, fueron validados en una cohorte de pacientes independientes que demuestran que dos escalas de riesgo clínicos fueron capaces de predecir la supervivencia global en un conjunto independiente de los pacientes [7]. Predicción de la supervivencia (libre de enfermedad) puede mejorarse por el uso de la expresión de genes que podrían capturar propiedades tumorales no se reflejan por variables clinicopatológicas
.
Genoma amplia de perfiles de expresión génica se ha usado para predecir el resultado o la respuesta a la terapia de la enfermedad en muchos tipos de tumores diferentes [8], [9] también se ha demostrado que los perfiles de expresión puede utilizarse para identificar tumores colorrectales con diferente agresividad y potencial metastásico [10] - [13]. Ningún estudio, sin embargo, ha sido publicada en el que la expresión del gen se utilizó para predecir la supervivencia libre de enfermedad después de la resección de metástasis hepáticas colorrectal. La identificación de una firma genética capaz de identificar las metástasis hepáticas de cáncer colorrectal recurrencia propensas al momento de la resección abriría el camino para la selección de pacientes que pueden beneficiarse de la terapia agresiva después de la resección, mientras que la retención de otros tratamientos innecesarios.
Resultados
pacientes y muestras tumorales
ciento cuarenta y ocho pacientes cumplieron con la expresión dentro y criterios de exclusión. Los perfiles se obtuvieron con éxito para 119 pacientes. Las características basales de los 119 pacientes incluidos, que se muestran en la Tabla 1, no difirieron significativamente entre el alta en comparación con el grupo de bajo riesgo, con la excepción de la administración de la quimioterapia. Los pacientes de alto riesgo recibieron quimioterapia neoadyuvante con más frecuencia y la quimioterapia adyuvante con menos frecuencia que los pacientes de bajo riesgo. Las muestras de pacientes tenían un porcentaje de células tumorales media de 45% (IC del 95%: 40,75-49,60), necrosis del 19% (IC del 95%: 16,19-22,47) y la fibrosis del 20% (IC del 95%: 16,44-22,71). Seguimiento medio fue de 26,7 meses. Una comparación de las características basales de los 119 incluidos y excluidos 29 pacientes se muestra en la Tabla S1.
Los pacientes se dividieron en un grupo bajo la predicción del riesgo basada en la predicción del riesgo de las diferentes firmas de genes de alto y. firmas de genes fueron descubiertos que define el alto riesgo como DFS ≤1 año y bajo riesgo como DFS & gt; 1 año a menos que se indique lo contrario. La razón de riesgo de la predicción de genes firma se muestra con el intervalo de confianza del 95% entre paréntesis. El valor p de la prueba de log-rank se muestra, así, con el valor de p ajustados para múltiples pruebas entre paréntesis. R: Las curvas de supervivencia para los pacientes en conjunto de entrenamiento. gen firma fue descubierto usando el mismo conjunto de entrenamiento. B: Curvas de supervivencia para los pacientes en el conjunto de validación. gen firma fue descubierto usando el conjunto de entrenamiento completo. C: Las curvas de supervivencia para los pacientes en el conjunto de validación. gen firma fue descubierto usando el conjunto de entrenamiento completo que define el alto riesgo como DFS ≤ 6 meses y bajo riesgo como DFS & gt; 2 años. D: Las curvas de supervivencia para los pacientes UMC Utrecht en el conjunto de validación. gen firma fue descubierto usando el subconjunto UMC Utrecht del conjunto de entrenamiento. E: Curvas de supervivencia para los pacientes Paul Brousse en el conjunto de validación. gen firma fue descubierto usando el subconjunto Paul Brousse del conjunto de entrenamiento. F:. Al igual que E, pero solamente a los portadores Paul Brousse que recibieron quimioterapia neoadyuvante (formación y conjunto de validación) guía empresas
original puesta en marcha del estudio: Modelo supervisada dividir a los pacientes con SLE ≤1 año frente a los pacientes con SLE & gt; a 1 año. La firma gen fue descubierto usando el conjunto de entrenamiento y posteriormente se probó en el conjunto de validación independiente. B: Al igual que en A, utilizando un modelo de supervisión dividir a los pacientes con DFS ≤ 6 meses frente a los pacientes con SLE & gt; 2 años. C: Al igual que en A, incluyendo sólo los pacientes tratados en Paul Brousse. D: Al igual que en A, incluyendo sólo los pacientes tratados en UMC Utrecht. E:. Al igual que en A, incluyendo sólo los pacientes tratados en Paul Brousse tratado con quimioterapia neoadyuvante
Expresión Génica Firma
Uso del conjunto de entrenamiento de 75 pacientes de ambos centros, una firma genética se descubrió que consta de 20 genes (Tabla S2). Esta fue la firma genética más predictivo tal como se mide en el conjunto de entrenamiento, capaces de predecir la supervivencia libre de enfermedad con alta significación estadística (Figura 1A). Cuando se usa para predecir el riesgo para los pacientes en el conjunto de validación independiente de 44 pacientes, sin embargo, esta firma gen fue incapaz de predecir significativamente DFS (Figura 1B). Esto apunta a overfitting en los pacientes del conjunto de entrenamiento, un hecho subrayado por el área bajo la curva (AUC) de 0,508 (IC del 95% 0,482-0,534) alcanzada durante el descubrimiento de firma (ver Métodos). La potencia de la prueba de log-rank usado se muestra en la Figura S1. Un análisis para encontrar enriquecimiento funcional para los 20 genes en la firma no pudieron encontrar ningún enriquecimiento significativo. Al no haber podido encontrar una firma genética de predicción, se examinó si una definición más estricta de los grupos de alto y bajo riesgo se traduciría en una mejor firma genética mediante la división del conjunto de entrenamiento en un grupo de alto riesgo de los pacientes con un DFS menos de 6 meses y una grupo de bajo riesgo con un DFS de al menos 2 años (Figura 2B). A pesar de que los resultados de la validación de la firma de este gen parecen mostrar una tendencia positiva también logró alcanzar significación (Figura 1C).
Los pacientes se dividieron en un grupo de predicción de bajo riesgo en base a la predicción del riesgo de la alta y diferentes firmas de genes. firmas de genes fueron descubiertos que define el alto riesgo como DFS ≤1 año y bajo riesgo como DFS & gt; 1 año a menos que se indique lo contrario. En todo el entrenamiento define la relación de los pacientes tratados con quimioterapia neoadyuvante para pacientes no tratados en el grupo de alto y bajo riesgo se mantuvo tan iguales como sea posible para evitar cualquier sesgo tratamiento. La razón de riesgo de la predicción de genes firma se muestra con el intervalo de confianza del 95% entre paréntesis. El valor p de la prueba de log-rank se muestra, así, con el valor de p ajustados para múltiples pruebas entre paréntesis. R: Las curvas de supervivencia para los pacientes en el conjunto de validación. gen firma fue descubierto usando el conjunto de entrenamiento completo controlado por el sesgo de tratamiento neoadyuvante. B: Curvas de supervivencia para los pacientes en el conjunto de validación. gen firma fue descubierto usando el conjunto de entrenamiento completo que define el alto riesgo como DFS ≤ 6 meses y bajo riesgo como DFS & gt; 2 años y de controlar por el sesgo de tratamiento neoadyuvante. C: curvas de supervivencia para los pacientes UMC Utrecht en el conjunto de validación. gen firma fue descubierto usando el subconjunto UMC Utrecht del conjunto de entrenamiento controlado por el sesgo de tratamiento neoadyuvante. D: Las curvas de supervivencia para los pacientes Paul Brousse en el conjunto de validación. gen firma fue descubierto usando el subconjunto Paul Brousse del conjunto de entrenamiento controlado por el sesgo de tratamiento neoadyuvante.
Los pacientes se dividieron en un grupo de predicción de bajo riesgo en base a la predicción de riesgo de los diferentes genes de alto y firmas. firmas de genes fueron descubiertos que define el alto riesgo como DFS ≤1 año y bajo riesgo como DFS & gt; 1 año a menos que se indique lo contrario. Ambos conjuntos de entrenamiento y validación fueron separados en neoadyuvante tratados y los no tratados. Los resultados sólo se muestran en la formación conjuntos contenían suficientes pacientes de alto y bajo riesgo de hacer posible descubrimiento firma. La razón de riesgo de la predicción de genes firma se muestra con el intervalo de confianza del 95% entre paréntesis. El valor p de la prueba de log-rank se muestra, así, con el valor de p ajustados para múltiples pruebas entre paréntesis. R: Las curvas de supervivencia para los pacientes en el conjunto de validación. firmas de genes fueron descubiertos usando el conjunto de entrenamiento completo estratificados por tratamiento neoadyuvante. B: Curvas de supervivencia para los pacientes no tratados UMC Utrecht en el conjunto de validación. gen firma fue descubierto usando pacientes UMC Utrecht no tratados en el conjunto de entrenamiento. C: curvas de supervivencia para los pacientes tratados neoadyuvante Paul Brousse en el conjunto de validación. gen firma fue descubierto usando tratado neoadyuvante pacientes Paul Brousse del conjunto de entrenamiento.
Algunos de los factores clínico-patológicos diferían significativamente entre los pacientes del Hospital de Paul Brousse y el Centro Médico Universitario de Utrecht ( S3 Tabla). Para explorar la posibilidad de que el fracaso previo de encontrar una firma genética de predicción podría haber sido causado por estas diferencias, el descubrimiento de genes firma se repitió para las muestras UMC Utrecht y las muestras Paul Brousse por separado. La firma genética derivada de los datos UMC Utrecht por sí solos no poseía ningún poder predictivo cuando validado (Figura 1D). La validación de la firma genética Paul Brousse, sin embargo, mostró una tendencia positiva (Figura 1E). El resultado de una regresión de Cox multivariado, sin embargo, sugiere que la firma de genes no es un factor predictivo independiente (Tabla 2). Etapa del tumor primario y la administración de la quimioterapia neoadyuvante parecía suficiente para predecir DFS dentro del conjunto de validación. Es posible que la quimioterapia neoadyuvante, que se administra antes de la recogida de muestras, tuvo un efecto sobre el patrón de expresión génica y por lo tanto era un factor de interferencia en la configuración experimental. Esto se confirma por la ausencia de poder predictivo cuando el descubrimiento de firma se llevó a cabo exclusivamente en pacientes Paul Brousse que no reciben quimioterapia neoadyuvante (Figura 1F). Además, un análisis de los genes expresados diferencialmente entre pacientes tratados con quimioterapia neoadyuvante y los pacientes no tratados reveló 875 genes que fueron significativamente arriba o downregulated (Tabla S4) lo que sugiere que la quimioterapia neoadyuvante induce un cambio considerable en la expresión del gen medido. Para investigar si la ausencia de una firma de predicción fue causado por el sesgo de tratamiento neoadyuvante en el grupo de alto riesgo el descubrimiento de la firma se repitió utilizando conjuntos de entrenamiento eran se eliminó este sesgo (Figura 3), así como el análisis de la neoadyuvante tratada y sin tratar pacientes por separado ( Figura 4). Los resultados sugieren fuertemente que la ausencia de una firma de predicción es independiente de los efectos del tratamiento neoadyuvante, añadiendo la salvedad de que en algunas de estas comparaciones el tamaño de la muestra es baja. Tabla S5 muestra el rendimiento predictivo de todas las firmas de genes descritos anteriormente cuando se usan para predecir DFS redefine como una variable dicotómica.
Las curvas de supervivencia basado en los 119 pacientes que utilizan predictores clínicos conocidos. La razón de riesgo del predictor de riesgo clínico se muestra con el intervalo de confianza del 95% entre paréntesis. El valor p de la prueba de log-rank se muestra, así, con el valor de p ajustados para múltiples pruebas entre paréntesis. R: Iwatsuki (≥3 alto riesgo, bajo riesgo & lt; 3). B: Basingstoke (≥10 alto riesgo, bajo riesgo & lt; 10). C: Fong (≥3 alto riesgo, bajo riesgo & lt; 3). D: Mayo (alto riesgo ≥2 bajo riesgo & lt; 2). E: Nordlinger (alto riesgo ≥4, bajo riesgo & lt; 4)
Validación de las escalas de riesgo clínicos
Los resultados del análisis de supervivencia univariantes para todos los factores clínico-patológicos se representan en la Tabla 3. . en un modelo de regresión de Cox, que contiene los factores que muestran los valores de p inferior a 0,1 en el análisis univariable, superior etapa del tumor primario (p = 0,006, HR = 1,444; IC del 95% = 1,110-1,877), la resección mayor ( p = 0,005, HR = 2,190; IC del 95% = 1,268-3,784), el número de metástasis hepáticas (p = 0,031, HR = 1,142; IC del 95% = 1,012-1,289) y la administración de la quimioterapia adyuvante (p & lt; 0,001, HR = 0,382; IC = 0,237 a 0,617) 95% resultaron ser factores de riesgo independientes para pobres DFS.
Todos los artículos de las puntuaciones de riesgo clínicos fueron documentados excepto por el estado de los ganglios linfáticos hepatoduodenal, lo que hizo imposible que la puntuación de riesgo de Zakaria sea mayor que 2. Debido a que no se incluyeron pacientes con enfermedad extrahepática en este estudio, la puntuación de riesgo Basingstoke no fue completa. Tres de cada cinco puntuaciones de riesgo clínicos predijeron DFS precisión, en nuestros pacientes, incluyendo las puntuaciones de riesgo Basingstoke, Fong y Nordlinger (Tabla 3). De éstos, la puntuación por Fong ha obtenido mejores resultados. Las curvas de Kaplan Meier para alto y bajo riesgo predijeron los pacientes, en base a las diferentes puntuaciones clínicas, están representados en la Figura 5.
Discusión
Este estudio fue diseñado para identificar y validar un clasificador basado en la expresión génica que predice DFS. Por desgracia, no hemos podido encontrar una firma genética que podría predecir de manera significativa DFS en un conjunto de validación independiente. Una firma genética desarrollado utilizando sólo Paul Brousse muestras de los pacientes mostró una tendencia positiva tras la validación. Sin embargo, en un modelo de regresión de Cox, la firma no ha demostrado ser un factor independiente de DFS. En lugar de reflejar la biología del tumor, la firma gen parece estar influenciada por un sesgo en la administración previa de quimioterapia, una posibilidad que debe ser tenido en cuenta cuando se realizan estudios futuros. Este punto de vista se ha reforzado tanto por la falta de capacidad de predicción en una firma genética diseñada en un subconjunto incluyendo sólo los pacientes Paul Brousse que reciben quimioterapia neoadyuvante, así como un análisis de la expresión génica diferencial entre los pacientes tratados con quimioterapia neoadyuvante y los pacientes no tratados que mostró 875 genes diferencialmente expresado. Para descartar que la ausencia de una firma genética de predicción fue causado por el sesgo de tratamiento neoadyuvante en el grupo de pacientes de alto riesgo, el descubrimiento de la firma se repitió utilizando conjuntos de entrenamiento fueron el sesgo neoadyuvante se retiró, así como el análisis de la neoadyuvante pacientes tratados y no tratados por separado . Similar a los resultados preliminares de este estudio de las firmas de genes resultantes no fueron predictivos de la DFS en el conjunto de validación indica que la sobrerrepresentación de tratamiento neoadyuvante en el grupo de pacientes de alto riesgo no explica la falta de resultados positivos.
También probado cinco conocidos puntuaciones de riesgo clínicos y encontraron que Basingstoke, Fong y Nordlinger predijeron significativamente la DFS en nuestro grupo de pacientes. El hecho de que tres de cada cinco puntuaciones fueron predictivo es notable teniendo en cuenta el hecho de que estas puntuaciones de riesgo clínico (CRS) se desarrollaron en una época donde el uso de la quimioterapia en el CCR primario fue rara [14] - [18]. Los mismos cinco puntuaciones de riesgo clínicos recientemente fueron validados por Reissfelder y colegas. Ellos encontraron que las puntuaciones Fong y Iwatsuki fueron capaces de predecir la supervivencia específica de la enfermedad en sus pacientes, pero no Nordlinger y el índice de Basingstoke [7]. Es notable que sólo la puntuación Fong fue predictivo en ambos estudios. La correlación no significativa de la puntuación Iwatsuki con DFS podría deberse al hecho de que la puntuación más alta no se pudo calcular, ya que no registrar el estado de los ganglios linfáticos hepatoduodenal. La pregunta sigue siendo: ¿por qué no encontramos una firma predecir DFS después de la resección de metástasis hepáticas de cáncer colorrectal? Las dificultades en la predicción de la supervivencia (sin enfermedad) con perfiles de expresión génica se han reportado recientemente. Lauss et al evaluó el rendimiento de 8 firmas de genes publicados en la predicción de la recurrencia en el cáncer de vejiga de los que ninguno sobrevivió a la validación [19]. Una revisión evaluar firmas genéticas desarrolladas para predecir la supervivencia en el cáncer de pulmón en 16 estudios fueron encontrados inadecuados para su uso en la práctica clínica debido a la falta o insuficiencia de validación. En estos estudios, ya sea la firma no superan a los factores clínicos o los autores no se refirió a la influencia de cualquiera de los factores clínicos [20].
Creemos que el diseño de nuestro estudio era de calidad suficiente para ser capaz de encontrar una firma genética para predecir DFS. Sin embargo, no puede excluirse que una firma gen utilizable existe, pero no se encontró debido a factores limitantes en nuestro estudio. Estos factores potenciales incluyen la definición de los pacientes de alto y bajo riesgo en el descubrimiento de la firma, el número de pacientes incluidos en el estudio especialmente a la luz de la heterogeneidad del grupo de pacientes, la inclusión de los pacientes de sólo dos centros médicos, la existencia de una efecto del tratamiento previo y límites a la sensibilidad de los microarrays.
las metástasis hepáticas son por su naturaleza sesgada hacia un subgrupo más agresivo de la CRC. Por lo tanto, se podría especular que los patrones de expresión de genes que caracterizan rápidamente recurrentes metástasis hepáticas son demasiado sutiles para ser descubierto usando el tamaño de la muestra empleada en este estudio. Por otra parte, la recurrencia después de la resección de metástasis hepáticas podría no ser dependiente de las características de la propia metástasis de hígado, pero en la presencia de micrometástasis en el momento de la resección hepática
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Aunque no podemos excluir la existencia de un gen predictivo firma, ningún beneficio añadido de la expresión génica firmas para la predicción de la supervivencia libre de enfermedad en la enfermedad colorrectal metastásico se puede establecer sobre la base de los resultados de este estudio. Por último, la puntuación de riesgo clínico Fong, ya validado por Reissfelder et al [7], es el más poderoso puntuación de riesgo para predecir la DFS de pacientes con CRLM resecado de las cinco puntuaciones de riesgo analizados en nuestro estudio. Esta puntuación de riesgo se debe utilizar para la estratificación en los estudios clínicos prospectivos que examinan el posible beneficio de las terapias adyuvantes en pacientes sometidos a cirugía por CRLM.
Materiales y Métodos
muestras de pacientes
las muestras congeladas de tumores de 148 pacientes se obtuvieron del hospital Paul Brousse en Villejuif, Francia y el UMC Utrecht, en los Países Bajos entre noviembre de 2000 y agosto de 2010. el protocolo de estudio fue aprobado por el Comité de ética médica (MEC) del Centro Médico Universitario de Utrecht como se reconoce en el artículo 16 de la OMM (Ley holandesa para la Investigación médica con sujetos humanos). Escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes. Las muestras se incluyeron los pacientes mayores de 18 años o más que fueron sometidos a resección curativa para el diagnóstico histológico de las metástasis hepáticas de CCR. Se excluyeron los pacientes con antecedentes de tumores malignos no colorrectal, enfermedad extrahepática o enfermedad residual macroscópica (R2) después de la cirugía. Los pacientes que recibieron la terapia ablativo local o solo o en combinación con la resección quimioembolización fueron excluidos. Sólo se incluyeron muestras que fueron broche de congelados en nitrógeno líquido dentro de los 30 minutos después de la resección y se almacenan en -80 ° C. La cantidad de estroma, tumor, las células del hígado benignos y necrosis se determinó por los dos patólogos estudio (C.G y P.J.vD). Los pacientes cuyas muestras contenían tejido hepático benigno o insuficiencia de las células tumorales fueron excluidos del estudio. ecografía intraoperatoria del hígado se realizó en todos los pacientes para evaluar el tamaño y la ubicación de las metástasis hepáticas. El tamaño del conjunto de datos se determina por las muestras de tumores de pacientes disponibles en las dos instituciones participantes que cumplieron con todos los criterios de inclusión y exclusión. El paciente, características y quirúrgicos a tumores fueron extraídos de nuestras bases de datos recogidos prospectivamente. La definición de metástasis hepáticas sincrónicas (diagnóstico dentro de los dos meses después del diagnóstico inicial) se basó en la proporcionada por el Instituto Nacional del Cáncer de EE.
seguimiento
Todos los pacientes recibieron seguimiento estándar con espiral TC del abdomen y el pecho cada 3 meses para supervisar las recurrencias. supervivencia libre de la enfermedad se define como el tiempo de la resección para el momento de la primera señal de recurrencia en la TC. Todos los pacientes fueron censurados en el momento de la muerte o el último seguimiento. Se determinó el tiempo de supervivencia usando la función de supervivencia de Kaplan-Meier.
Expresión Génica
de perfiles
aislamiento de ARN.
El ARN total fue aislado de muestras de tejido individuales utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen) siguiendo el protocolo del fabricante. El ARN se purificó usando el mini-kit RNeasy (Qiagen) y se sometió a tratamiento con DNasa usando el kit Qiagen de ADN libre. El rendimiento y la calidad de ARN total fue comprobada por espectrofotometría y por el Agilent Bioanalyzer (Agilent). Trece muestras se excluyeron sobre la base del rendimiento de ARN y el rendimiento de cRNA (número integridad del ARN [RIN] & lt; 6). Ocho muestras fueron excluidos debido a fallos de amplificación y 8 muestras más no cumplieron con los criterios de etiquetado, lo que resulta en datos de 119 muestras.
cRNA síntesis y marcaje fluorescente.
Todos los procedimientos de amplificación y etiquetado se llevaron a cabo en placas de 96 pocillos (4titude, Bioke) en un personalizado SciClone ALH 3000 Estación de trabajo (Caliper Life Sciences), con una PCR PTC-200 (Bio-Rad Laboratories), SpectraMax 190 espectrofotómetro (Molecular Devices), y una magnética grano-localizador (Beckman). productos de ARNc se purificaron y se concentraron con RNAClean (Agencourt, Beckman) de acuerdo con el protocolo del fabricante. mRNA se amplificó mediante transcripción in vitro usando un cebador anclado y T7 RNA polimerasa en 1 g de ARN total. En primer lugar se generó un molde de ADNc de doble cadena que incluye el promotor T7. A continuación, se utilizó esta plantilla para la transcripción in vitro con el kit T7 MEGAscript (Ambion) para generar cRNA. Durante la transcripción in vitro, 5- (3-aminoalil) -UTP (Ambion) se incorporó en el único cRNA hebra. No se utilizaron muestras con un rendimiento de menos de 2.000 ng de ARNc o con fragmentos pequeños (mediana de menos de 500 nt). Cy3 o Cy5 fluoróforos (GE Healthcare) se acoplaron a cRNA. Se aplicaron criterios de ARN total y control de calidad de ARNc de conformidad con el tumor Análisis de Mejores Prácticas Grupo de Trabajo [21]. La incorporación de rendimiento y la etiqueta de la etiqueta cRNA-cy se comprobó mediante espectrofotometría. Sólo se incluyeron las muestras con entre el 1,5% y el 3% de Cy-incorporación. Antes de la hibridación, 300-1000 ng de ARNc marcado con Cy de una biopsia se mezcló con una cantidad igual de material marcado con Cy color inverso de la muestra de referencia.
hibridación de microarrays.
Para cada muestra, se generaron dos perfiles de expresión en experimentos de tinte del canje. Las muestras se compararon con una referencia comercial (Catálogo de ARN de referencia Universal Humanos#740000, Stratagene). La matriz Humano Oligo-Ready set (versión 2.0) fue adquirido de Qiagen y manchas en las diapositivas CodeLink (GE Healthcare) en un polvo filtrado y humedad controladas sala limpia. Los microarrays contenían 70-mer oligonucleótidos que representan 21.329 genes humanos y de las etiquetas de secuencias expresadas (EST), así como 3871 puntos adicionales para fines de control. Gene anotaciones fueron actualizados por BLAST análisis de todas las secuencias de funciones utilizando Ensembl construir se hibridaron 55. Las matrices en una estación de hibridación Tecan HS4800PRO, utilizando el protocolo descrito anteriormente [22]. hibridizada diapositivas fueron digitalizadas en un escáner de Agilent (G2565BA) a la potencia del láser 100% y 60-90% PMT. Después de la extracción automática de datos utilizando Imagene 8.0.1 (BioDiscovery), printtip loess normalización se realizó en terreno intensidades medias [23]. tinte sesgo se corrigió en base a una estimación dentro del conjunto [24].
Acceso a los datos.
De acuerdo con la propuesta MIAME (Información mínima alrededor de un experimento de microarrays) las normas, los datos primarios y procesados como así como los protocolos fueron depositados en array Express (http://www.ebi.ac.uk/microarray-as/aer) con el número de E-TABM-1112.
identificación de una recurrencia Firma
La cohorte se dividió al azar en un conjunto de entrenamiento (n = 75) y un conjunto de validación (n = 44). Este último no participó en la selección de genes para evitar un sesgo de selección. A los efectos del descubrimiento de la firma genética, los pacientes fueron divididos inicialmente en un alto riesgo y un grupo de bajo riesgo. Los pacientes de alto riesgo se definieron como aquellos que habían recaído durante 1 año (Figura 2). Este umbral se basa en la observación de que un DFS & lt; 1 año es predictivo de la supervivencia global adverso como se describe por Fong et al [14]. Una división basada en DFS ≤6 meses (alto riesgo) y DFS & gt; 2 años (bajo riesgo) también fue aplicado (Figura 2B). Utilizando el conjunto de entrenamiento, los genes se clasifican en base a tres parámetros diferentes (de relación señal-ruido-, la estadística t-test y el cociente de riesgos proporcionales de Cox). Esta clasificación se realizó utilizando un método de muestreo múltiple seleccionando 2/3 de las muestras en cada iteración. Las 75 mejor clasificados genes fueron utilizados para predecir la clase de riesgo de las muestras en el 1/3 restante de las muestras utilizando la clasificación media cercana [9] y dejar fuera de una validación cruzada (LOOCV). El uso de estas predicciones un área combinada bajo la curva para 1000 iteraciones se calculó que da una indicación de la capacidad de predicción agregada de las 75 firmas de genes, donde un valor significativamente por encima de 0,5 puntos a poder predictivo cierto. El ranking de los genes fueron como media de todas las iteraciones de 1000 [25]. A partir de la lista de clasificación resultante, la firma genética con el poder pronóstico más importante (medida como la precisión global de la predicción) se determinó mediante Más cercano clasificación media y LOOCV a partir del gen mejor clasificado y, posteriormente, añadir el gen siguiente mejor clasificado en cada iteración (selección hacia adelante ) [9]. Una medida independiente de la capacidad de predicción se obtuvo mediante el uso de la firma resultante de genes para predecir la clase de riesgo de las muestras en el conjunto de validación (el más cercano media, LOOCV). De Kaplan-Meier análisis se utiliza para estimar la DFS y curvas de supervivencia para las dos clases de riesgo predichos se compararon mediante la prueba de log-rank de Mantel-Cox. Un análisis de potencia para la prueba de log-rank se realizó utilizando el programa PS [26]. análisis de enriquecimiento conjunto de genes funcionales se realizó utilizando el paquete de análisis Babelomics 4.2 basada en web incluyendo todas las bases de datos disponibles para el análisis de enriquecimiento [27].
Análisis de Expresión diferencial de genes
La expresión génica en pacientes tratados con quimioterapia neoadyuvante se comparó con la expresión en pacientes no tratados usando ANOVA [28]. En un análisis de efectos fijos, se modelaron muestra, matriz y efectos de tinte. Los valores de p se determinaron mediante una prueba de permutación-F2 en el que los residuos se barajan 5000 veces en todo el mundo.
las escalas de riesgo clínicos
Un modelo de riesgos proporcionales de Cox univariante de regresión se utilizó para estimar los índices de riesgo de cinco las puntuaciones de riesgo clínicos que fueron calculadas para cada paciente [14] - [18]. Un análisis multivariante se realizó también introducir los factores con valores de p inferior a 0,1 en el análisis univariante
Pruebas de estadística y Descargas de Software
Todas las pruebas estadísticas fueron de dos caras y la significación estadística se asignó a los valores de p inferior a 0,05. En su caso, los valores de p se ajustaron por su tasa de falso descubrimiento utilizando el método de Benjamini-Hochberg [29]. Los análisis estadísticos se realizaron en R 2.7.0 con Bioconductor paquetes adicionales y SPSS para Windows versión 15.0 (SPSS, Chicago, Illinois, EE.UU.).
Apoyo a la Información
Figura S1.
Poder de la prueba de log-rank. El poder estadístico de la prueba de log-rank como una función de la tasa de riesgo de la predicción de la firma de genes en el conjunto de validación
doi:. 10.1371 /journal.pone.0049442.s001 gratis (TIF) sobre Table S1.
Paciente y características de los tumores de los pacientes entrada y excluidos
a
doi:. 10.1371 /journal.pone.0049442.s002 gratis (DOC) sobre Table S2. El análisis de regresión de Cox univariante
para los genes de la firma
a
doi:. 10.1371 /journal.pone.0049442.s003 gratis (DOC) sobre Table S3.