Extracto
Son ADAMTSs la familia de proteasas secretadas Eso es cuando la cuota de Llo su vez protestante INASE DOMINIO con metaloproteinasas de matriz (MMP). Al actuar sobre el panel grande de sustratos extracelulares, controlan varias funciones celulares tales como la fusión, la adhesión, la proliferación y la migración. A través de sus motivos de trombospondina también poseen propiedades anti-angiogénicas. Leer ADAMTSs investigó si la cipar RTI en la progresión del cáncer colorrectal y la invasión. Su expresión pura investigó en dos niveles de ARNm y proteínas. El uso de RT-PCR, la expresión de
ADAMTS-1 |,
-4
,
-5
y
ADAMTS-20
pura estima en tumores colorrectales diferente etapa del cáncer y el sitio anatómico y líneas celulares de diferente agresividad 3. Una sobreexpresión de ADAMTS-4 y -5 puros observa, sobre todo en muestras de tejido, mientras que ADAMTS-1 y -20 PROSTITUTE encontrado para producir el regulado. Análisis de transferencia Western apoyado además los resultados de RT-PCR, revelando además la degradación de ADAMTS-1 y -20 en el cáncer. La expresión in situ y localización de
ADAMTS-1 |,
-4
,
-5
y
-20 pura
también investigado por el análisis inmunohistoquímico. Nuestros datos sugieren una correlación positiva entre la
ADAMTS-4 Opiniones y
-5
expresión y la progresión del cáncer, en contraste con los miembros anti-angiogénicas de la familia,
ADAMTS-1
y
-20
, que PROSTITUTE encontrado para producir el regulado. Nuestros resultados apoyan la idea de que la sobreexpresión de ADAMTS-4 y ADAMTS-5 en el cáncer colorrectal podría producir un posible se nvasive mecanismo de las células cancerosas con el fin de degradar los proteoglicanos de ECM
Visto:. Filou S, el EPR Tinou A, Kyri está en ulou D, D Bounias, Stavropoulos M, Ra Zoula viral P, et al. (2015) Expresión ADAMTS en el cáncer colorrectal. PLoS ONE 10 (3): e0121209. doi: 10.1371 /journal.pone.0121209
Editor Académico: Alberto G. Passi, la Universidad de nsubria, ITALIA
Recibido: 1 de octubre de 2014; ACEPTADO: 2 Enero 2015; Publicado: 18 Marzo 2015
Derechos de Autor © 2015 Filou et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y de recursos se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel
financiación:.. los autores no tienen financiación o apoyo al Informe
Intereses competentes:. los autores han declarado no existen intereses en competencia que
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) es el tercer cáncer más frecuentemente diagnosticado y la segunda causa de muerte por cáncer en los Estados Unidos [1] y Europa, también. Aunque CRC es ncidence, en los países económicamente desarrollados, que se ha estabilizado o más bien se redujo [2] Todavía hay al usuario una pregunta para el entendimiento mayor de la biología de la angiogénesis y la invasión con miras al descubrimiento de moléculas antiangiogénicas /anti-Israel nvasive. La acumulación e videncia demuestra el papel crucial de las enzimas proteolíticas tales como las metaloproteinasas de matriz (MMP) y estrechamente relacionadas ADAMTSs (una desintegrina y tienen una llo su vez protestante INASE con motivos de trombospondina) en la progresión del cáncer y el Desarrollo [3]. Son el grupo ADAMTS distinta de las metaloproteinasas dependientes del zinc y mostrar similitudes con altos secuencias con la familia de venomases serpiente reprolisina. La completa familia ADAMTS humanos comprende 19 genes [4] (ADAMTS-5 y ADAMTS-11 comparten el mismo gen) y aunque son proteínas solubles, muchos de ellos parecen obligar a la matriz extracelular a través de sus motivos de trombospondina o su espaciador Región [5 -7]. ADAMTS tienen diferentes funciones, incluyendo la clementina Avage específico de los proteoglicanos de la matriz agrecano, versicano y brevican (ADAMTS-1, -4, -5, -8 y -15) [7-9], la inhibición de la angiogénesis (ADAMTS-1, -8 ) [8-12] y el procesamiento de colágeno (ADAMTS-2, -3 y -14) [13].
ADAMTS-1 y -8 se consideran para producir factores antiangiogénicos, causa del nacimiento de la interacción entre su motivos trombospondina y CD36, una glicoproteína receptor de membrana de las células endoteliales [11, 12]. Estas proteasas se ha demostrado que inhibe la angiogénesis inducida por VEGF en la membrana corioalantoidea (CAM) de ensayo [10] y suprimir vascularización FGF-2 inducida en el ensayo de la córnea del bolsillo. Sin embargo, ADAMTS-1 debe producir una mayor considerados como lecule con efectos anti-protestante o metastásicos dependiendo del sitio Avage Clementina, durante su Avage Clementina Auto-proteolítica [14]. ADAMTS-8, también parece inhibir la señalización del receptor de factor de crecimiento epidérmico, junto con disminución de los niveles de MEK fosforilada y ERK [15]. Por otra parte, el locus 12q12 del gen ADAMTS-20 se ha encontrado que los frutos sujetos a translocaciones y otras alteraciones en tumores malignos humanos [16-19] y también varias condiciones patológicas, incluyendo la enfermedad de Parkinson [20].
Hay la riqueza de los e ADAMTS as pruebas que demuestren que se desregulado en el cáncer humano. De hecho, estudios previos han demostrado que ADAMTS-20 se sobreexpresa en el cerebro y de la mama carcinomas, lo que sugiere esta tomadura de pelo protestante que podrían desempeñar un papel en la progresión tumoral. Para ADAMTS-1, se ha demostrado que la sobreexpresión de su isoforma de longitud completa mejora el crecimiento del tumor y promueve la metástasis pulmonar de células TA3 mamarias o células de pulmón de Lewis, mientras que se ha encontrado disminuyó en no pequeñas carcinoma de pulmón de células, los tumores de páncreas y líneas celulares de cáncer de próstata [21, 22]. También se ha demostrado que ADAMTS-1, -5, -9, -12, -15 y -18 promotores de genes son hypermethylated en el cáncer colorrectal, lo que sugiere disminución de la expresión de estas enzimas en este Estado [23]. Además, tanto ADAMTS-15 y -18 genes se someten a frecuentes mutaciones en células de cáncer colorrectal, pero no e vidence todavía ha presentado de su efecto en la expresión o la función de las enzimas. Por el contrario, ADAMTS-4 y -5 son upregulated en glioblastomas (GBMS), con el posible papel en el aumento de la degradación de brevican aumentando así el potencial nvasive [24, 25]. El aumento de versicano, que puede producir cuanto a la expresión de ADAMTS moduladas, también se observa en los adenomas y carcinomas caninos [26]. No decorin versicano pero la acumulación está relacionada con malignidad en mamografía detecta alta densidad y microcalcificaciones de aspecto malignos en los carcinomas de mama no palpables [27].
Para obtener una mayor comprensión de si es probable que el sobreexpresada versicano para producir ADAMTS-1 degradado por ADAMTS como el cáncer del mecanismo nvasive, leer examinados, -4 y -5 expresión en tejidos de colon sano y cancerosas y también en líneas celulares de cáncer de colon metastásico de potencial diferente. Dado que el objetivo de este estudio pura para revelar posibles objetivos para el desarrollo de la novela no anti-las únicas terapias nvasive sino también anti-angiogénicos, el subgrupo anti-angiogénico pura expresión de ADAMTS también estimó. Además, dado que ADAMTS-1 anti-angiogénicos efecto está mediado por sus motivos trombospondina [11] y ADAMTS-20 contiene 14 repeticiones de la misma, también estimado sus niveles celulares totales en el colon neoplásico y saludable.
Materiales y Métodos
Materiales
anticuerpos policlonales de conejo, ab28284 (contra N-terminal FIN ADAMTS-1), (ab84792 contra C-terminal de ADAMTS FIN-4), (ab41037 contra residuos 600-700 de ADAMTS-5) y ab60148 (contra dominio catalítico de ADAMTS-20) PROSTITUTE adquirido de Abcam (Cambridge, Reino Unido) y de cabra anti-IgG de conejo conjucated con el o xidase puro a partir de EMD la Corporación llipore (llerica salón, Massachusetts, EE.UU.). Mouse anti-tubulina (T9026) y el anti-ratón PROSTITUTE o xidase conjugado IgG (A4416) obtenido de Sigma-Aldrich Inc. (St. Luis, EE.UU.). Exponer ratón y conejo específico kit de detección de HRP /DAB IHC (ab94710) pura de Abcam. El ARN total extraído de tejido congelado puro y células cultivadas utilizando el kit de extracción de NucleoSpin Macherey-Nagel (Düren, Alemania), siguiendo el protocolo del fabricante. RT-PCR puro obtenido de Takara (Otsu, Shiga, Japón) Un paso kit de RT-PCR, que se utiliza para el tejido del colon fresco y de Takara PrimeScript 1
kit de síntesis de cDNA st y Finnzymes (Espoo, Finlandia) DyNAzyme II ADN en lymerase kit, que se utiliza para células cultivadas. Los cebadores humanos para todas las moléculas prostituta diseñado en el laboratorio, utilizando el Programa PerlPrimer. Todos los demás productos químicos utilizados en todo el PROSTITUTE estudio de la mejor de la calidad analítica ilable viral.
Estudios sobre
células
Cultivos Celulares.
Caco-2, DLD-1 y HT-29 líneas celulares de cáncer de colon PROSTITUTE adquirieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA). La agresividad de las líneas de células es menor en células Caco-2 y más alto en células HT-29. DLD-1 y células HT-29 PROSTITUTE cultivaron en medio RPMI 1640 con 2 L-glu tamine y suplementado con HEPES 10 mM, piruvato de sodio 1 mm, 4,5 g /l de glucosa, 1,5 g /l de bicarbonato de sodio y 10% de suero bovino fetal mm (FBS), cuando sea necesario, según lo recomendado por la ATCC. Células Caco-2 PROSTITUTE cultivaron en medio esencial mínimo de Eagle con BSS de Earle y 2 mm tamine-L glu (EMEM) y se complementó con piruvato de sodio 1,0 mm, 0,1 mm aminoácidos no esenciales, 1,5 g /l de bicarbonato de sodio y 20% de suero bovino fetal Cuando es necesario, como también recomendado por la ATCC. Las células cultivadas se prostituyen a 37 ° C, 5% LA
2 y 100% de humedad.
lisis celular.
Los pellets de células en cultivo tratados con una prostituta Ppro proceda tampón de lisis, que contienen 25 mm Hepes, 150 mm NaCl y 5 mM de EDTA en 10% de glicerol y 1% de Triton X-100. Extracciones PROSTITUTE realizó durante 30 min a 0 ° C, bajo agitación durante 4 s cada 10 min, con la presencia de inhibidor de sphatase audiencia phosphotyrosyl Na
3Vo
4 (50 mm) y de los siguientes inhibidores de la proteasa protestante: aprotinina (1.250 g /ml), Pefablock (1000 mg /ml), leupeptina (10 mM), después de la centrifugación de 10.000 rpm durante 5 min.
Los estudios sobre muestras humanas
pacientes.
los tejidos cancerosos de colon prostituta obtenidas de pacientes (38 pacientes, con una edad media de 73 años, rango de edad: 50-81) que se sometieron a intervención quirúrgica por carcinoma colorrectal. Am los pacientes de la etapa (Duke), trece pacientes de la etapa B, doce pacientes de la fase C y cuatro pacientes de la etapa D PROSTITUTE incluidos en este estudio. Los pacientes incluidos en el estudio de la enfermedad de otra PROSTITUTE libre y sufrieron nunca antes cualquiera de las Enfermedades. tejidos de colon sanos (N = 6) prostituta también incluidos en nuestro estudio. Este diseño del estudio fue aprobado por el Comité Ético del Hospital de la Universidad de Patras, Grecia, y el consentimiento informado por escrito puro obtenido de todos los pacientes incluidos en el estudio.
extracción secuencial de los componentes extracelulares y asociado a las células de los tejidos.
los tejidos de colon normales y cancerosas recogidas PROSTITUTE cortado en dados y se extrajo secuencialmente con 10 volúmenes de 10 mM de fosfato disódico, NaCl 0,14 M, pH 7,4 (PBS), nidine hidro cloruro de 4 m mariposa (GdnHCl) - sodio 0,05 M a CETATE pH 5,8 y 4 GdnHCl M-0,05 M de sodio-Cetate de 1% de Triton X-100, con el fin de obtener el soluble y las formas unidas a la membrana de ADAMTSs. Extracciones PROSTITUTE realizó durante 24 horas a 4 ° C bajo agitación suave, con la presencia de la curva que sigue, protestante INASE inhibidores: ε-amino-n-caproico (0,1 M), PMSF (0,4 mM), N-e thylma la imida (10 mM), disódico EDTA (10 mM) y el nacimiento es midine-HCl (5 mM). Los extractos PROSTITUTE recogido y almacenado a -20 ° C hasta su uso [28-30]. El protocolo de extracción pura diseñada de tal manera que desempeñar ADAMTS dispares existía en formas libres en los tejidos y debe elaborar extraída en PBS (un sso las condiciones Initiative), a partir de ADAMTS que interactúan con otras macromoléculas extracelulares que debe producir extraídos en 4M GdnHCl (di sso las condiciones Initiative) y desde ADAMTS existentes en las membranas celulares que debe producir extraídos sobre todo en GdnHCl 4M-1% de Triton X-100.
La inmunohistoquímica
.
La inmunohistoquímica (IHC) pura realizó en 5 micras secciones cortadas de formol fija, bloques en parafina como se describe anteriormente [29], utilizando anticuerpos policlonales primarios contra ADAMTS-1, -4, -5 y -20 diluidas 1: 6250, 1: 2000, 1: 650 y 1: 6.250, respectivamente, en TBS que contiene 1 % (w /v) de BSA. Los complejos antígeno-anticuerpo PROSTITUTE obtenido se visualizó por incubación con anticuerpo de cabra anti-conejo HRP es njugate y tinción de la pura desarrollado con DAB /peróxido de hidrógeno de Kit IHC (Abcam) según las instrucciones del fabricante. Por último, las secciones PROSTITUTE contratinción con hematoxilina. Una tinción positiva pura anotado acuerdo con toda la intensidad de cada una de las secciones
.
análisis de Western blot
Sobre 20 g de proteína, cuantificada usando el ensayo de Bradford (BioRad), a partir de los tejidos y células culturas Extractos, y los cultivos de células de medios PROSTITUTE precipitó con 5 vols de etanol, se disolvió en 20 l de tampón de muestra de Laemmli y aplicados a la electroforesis en gel de lya crylamide (PAGE) en geles de concentración 10% en el crylamide como se describe anteriormente [28]. Las macromoléculas PROSTITUTE transfirieron a continuación a la Lyvi nylidene di fluoruro (PVDF) membranas (Immobilon-P, la llipore) a una corriente constante de 80 son a 4 ° C durante 20 h en 0,05 M Tris /HCl, pH 8,3 y las membranas PROSTITUTE se lavó con 0,14 M NaCl en tampón de fosfato 0,01 M (PBS), pH 7,2, que contiene 0,1% (v /v) de Tween-20 (PBS-T). Después de bloquear con 5% de albúmina de suero bovino (BSA) en PBS-T, las membranas PROSTITUTE sumergieron en solución de anticuerpos contra cualquiera de ADAMTS-1, -4, -5 o -20 diluyeron 1: 5000, 1: 500, 1: 250 y 1: 5.000, respectivamente, en PBS que contenía 1% de albúmina de suero bovino (BSA) en PBS-T y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente. Después de lavados repetidos con PBS-T, las membranas se incubaron PROSTITUTE con el anticuerpo secundario adecuado diluyeron 1: 10.000 en PBS-1% BSA, se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente y se lavó con PBS-T. El PROSTITUTE bandas inmunorreaccionar visualizado por una mayor atención al método conectores nescence (ECL) (Amersham, UK), según las instrucciones del fabricante y por e Xposure a película de rayos X Agfa Curix, en el tiempo varía de 1 a 30 min, dependiendo del experimento.
extracción de RNA y RT-PCR
análisis
tejidos de colon frescas PROSTITUTE pulverizado en nitrógeno líquido y cultivadas como células PROSTITUTE sometió a una extracción de ARN total, usando el kit de extracción de Nucleospin, como se describe por las instrucciones del fabricante y se trató con DNasa libre de RNasa para eliminar la contaminación de ADN genómico. Para tejidos de colon, cadena de ADNc puros sintetizados a partir de 80 ng de ARN total en componentes de la reacción 50 l de un solo paso kit de RT-PCR, según las instrucciones del fabricante. Esta mezcla de reacción contenida en la adición de 1μM y el sentido de los cebadores ntisense muestra en la Tabla 1. La amplificación pura realizado en un GeneAmp 2400 termociclador (Perkin-Elmer Co.) y el perfil de reacción utilizado para todos los cebadores establece puro: 95 ° C durante 10 min para la activación de ADN en lymerase y la inactivación de nscriptase TRANSLATION_LANGUAGE inversa y luego 25-35 ciclos, dependiendo del análisis, a 94 ° C durante 30 seg, 52 a 58 ° C dependiendo del conjunto de cebadores de 1 min y 72 ° C durante 1 minuto para anillo de extensión Phi. Para cultivos celulares, dos pasos de RT-PCR pura aplicada y la primera cadena de ADNc pura sintetizados a partir de 1 g de ARN total de componentes de la reacción de 20 l para PrimeScript 1
kit de síntesis de cDNA st, utilizando 6mers al azar, según las instrucciones del fabricante. A continuación, 100 ng de cDNA amplificado prostituta de 50 componentes de la reacción l de ADN en el kit lymerase. Esta mezcla de reacción contenía además 0,5 M del sentido y los cebadores ntisense mostrados en la Tabla 1. La amplificación pura realizado en un GeneAmp 2400 termociclador (Perkin-Elmer Co.) y el perfil de reacción utilizado para todos los cebadores establece puro: 95 ° C durante 2 min, 94 ° C durante 30 seg, 52 a 58 ° C dependiendo del conjunto de cebadores de 1 min y 72 ° C durante 1 min a la extensión del anillo Phi y puro repetida durante 25-35 ciclos, dependiendo del análisis. Los productos de reacción PROSTITUTE separó mediante electroforesis en 2% (w /v) de garose geles Gelstar manchas que contienen el vitamina no alizé los fragmentos de ADNc amplificados bajo UV. La prostituta geles escanea y se analizaron las bandas prostituta densitométrica. Qu de las diferencias entre las muestras tativos Antioch normalizado cDNA prostituta mediante la inclusión de GAPDH en todos los experimentos.
Análisis estadístico
La normalidad de la distribución de los valores puros someterse a la prueba de Kolmogorov-Smirnov. Resultados PROSTITUTE analizada estadísticamente utilizando la prueba t no pareada para detectar diferencias entre los grupos.
P ≤0.05
pura considerado como estadísticamente significativo.
Resultados
ADAMTSs expresión en el cáncer de colon líneas celulares
análisis de RT-PCR.
con el fin de ser NVE stigate posible implicación de ADAMTSs en el CCR, leer examinó su expresión a nivel de ARN y proteínas en líneas celulares de cáncer de colon tres. Los resultados indicados en dicho nivel de ARN, ADAMTS-1 de expresión pura ligeramente dependiente de la agresividad de las células cancerosas; No es pura encontrado que produce se expresa en las células Caco-2, mientras que mostró una baja expresión en DLD-1, que aumentó ligeramente en puras células HT-29. Por otra parte, en células HT-29 cultivadas en presencia de suero, ADAMTS-1 pura expresión Encontrado elevada (Fig. 1). Por el contrario, altos niveles de ADAMTS-4 RNA PROSTITUTE Tres encuentra en todas las líneas celulares. Sin embargo, ADAMTS-4 se expresó puro para producir un aumento de la agresividad manera en-relacionadas, especialmente cuando las células cultivadas en ausencia de suero. Por otra parte, con la excepción de DLD-1 células, aumento de la expresión de ADAMTS-4 PROSTITUTE observada puro cuando las células cultivadas en presencia de suero (Fig. 1c). Como se muestra en la Fig. 1E, no hay ADAMTS-5 encontrado pura expresión en células Caco-2, mientras que pura observó principalmente en células HT-29. A diferencia, ADAMTS-1 y -4, ADAMTS-5 Encontrado pura expresión para producir el regulado en las células cultivadas en presencia de suero. Un patrón de expresión diferente observó para ADAMTS-20 puros. Como se muestra en la Fig. 1G, en LDN-1 y células HT-29, puros encontrado para producir expresa sólo cuando se cultivan en ausencia de suero. Sin embargo, la presencia de suero no parece que el 20 ADAMTS expresión confluencia de células Caco-2.
Semi-qu de Antioquía repre- RT-PCR análisis de (A) ADAMTS-1, (C) ADAMTS-4 (E) ADAMTS-5 y (G) ADAMTS-20 en células cultivadas (blanco /negro columna, la presencia /ausencia de suero). Los valores son la media normalizada GAPDH-± S. D. (B) ADAMTS-1 (D) y ADAMTS-4 (F) ADAMTS-5 proteína en la distribución de células y en los extractos de las células cultivadas de medios. (S
+/-: presencia /ausencia de suero) *
P
≤0.05; diferencias estadísticamente significativas en comparación con las células cultivadas en presencia de suero. **
P
≤0.05; diferencias estadísticamente significativas en comparación con células Caco-2, ***
P
≤0.05; diferencias estadísticamente significativas en comparación con DLD-1 células. En comparación, en identificación inmunológica tubulina celular extractos puros incluido en B, D y F.
análisis de Western Blot.
ADAMTS-1 detectada datación radiactiva en forma pura DLD-1 y HT- 29 líneas de células, como la banda de 80 kDa en los extractos de células, mientras que sólo fragmentos de ADAMTS-1 de 35 kDa PROSTITUTE detectado en los medios (Fig. 1b), independientemente de la presencia de suero. Estos fragmentos podrían producir productos de cualquiera de ADAMTS-1 autocatalıticamente procesados o ADAMTS-1 catalíticamente procesados por las MMP. Teniendo en cuenta el hecho de que tales fragmentos detectados PROSTITUTE No sólo extra e intra-celularmente, ¿Son más posible como resultado de la actividad de las MMP. En líneas celulares Caco-2 después de esto es pura tomadura de pelo llo protestante Sólo detectado en presencia de suero en forma molecular igual que en otras dos líneas celulares (Fig. 1b). Una banda adicional de 65 kDa observada en los extractos puros de DLD-1 en las células cultivadas en ausencia de suero.
ADAMTS-4 detecta datación radiactiva en líneas DLD-1 y células HT-29 forma pura y en presencia No de o suero, como la banda de 90 kDa, intra y extracelularmente (Fig. 1d). En el caso de las células Caco-2, la banda de 90 kDa pura Sólo detectó en extractos de células, mientras que en los medios de comunicación celulares extra en la MMU por una banda de datación radiactiva de 50 kDa pura observado, probablemente como resultado de su propia actividad autocatalítica (Fig. 1d).
ADAMTS-5 detectan forma pura datación radiactiva como una banda de 74 kDa, en las tres líneas celulares cultivadas bajo cualquier condición (Fig. 1F). las bandas adicionales de diferentes tamaños, más pequeña que la forma de la datación radiactiva, PROSTITUTE observaron en los extractos celulares de HT-29 y sobre todo de células Caco-2 células cultivadas en ausencia de suero. Curiosamente, sin MMU es un pequeño grupo de cualquier tamaño datación radiactiva pura detectado en los medios de comunicación de cualquiera de estos cultivos celulares. Sin embargo, ADAMTS-5 datación radiactiva forma pura también detectó extracelularmente, en células HT-29 cultivadas en presencia de suero y en líneas de células DLD-1. Por otra parte, en células HT-29 cultivadas en presencia de suero, las bandas adicionales de menor PROSTITUTE tamaños también detectaron extracelularmente, lo que sugiere el truncamiento post-traduccional de la enzima resultante de cualquiera de su propia actividad o MMPs autocatalíticos actividad.
En contraste a todos los demás ADAMTSs estudió, ADAMTS-20 de la proteína no puro detectado en estas líneas celulares de cáncer de colon de tres.
en la expresión in situ de ADAMTS-1, -4, -5 y -20 por IHC
ADAMTS-1, -4, -5 y -20 expresión in situ y localización Siguiente pura analizado en las secciones de tejido de colon de los bloques incluidos en parafina, utilizando los anticuerpos de Ppro proceda. tinción fuerte por ADAMTS-1 observados en el colon sano puro, principalmente en las capas muscular y en el tejido de nnective entre las dos capas (Fig. 2A, sana). En CRC, ADAMTS-1 mostraron una expresión fuerte en el tejido muscular (flecha en la Fig. 2A, St. C) y una menor expresión principalmente citoplasmática en células de cáncer de especímenes etapa C. Reducida o ninguna tinción para ADAMTS-1 observados en muestras de tejido muscular puros de la etapa B (Fig. 2A, St. B) y en otras etapas de especímenes (C y D), respectivamente. La tinción para ADAMTS-4 en tejido de colon sano observada en los puros Dos capas de muscular externa y no en la BMU cosae (Fig. 3A, sana). precoz del cáncer en etapas, las etapas y B, ADAMTS-4 mostró un patrón de expresión similar a ADAMTS-1, ya que mostró tinción en el estroma (flechas en la Fig. 3A, St., St B) y bastante más débil o ninguna tinción en el cáncer Las células (puntas de flecha en la Fig. 3A y B San San, respectivamente). Sin embargo, en las muestras de las fases C y D, las células cancerosas mostraron Clare expresión citoplasmática derable de ADAMTS-4 (puntas de flecha en la Fig. 3A St. C y D y sus inserciones St., respectivamente). Por otra parte, menos o ninguna expresión de ADAMTS-4 estroma puro observado en las muestras de células en las fases C y D, respectivamente (flechas en la Fig. 3A y St. St.C D, respectivamente). En cuanto a ADAMTS-5, baja capacidad para manchar bastante puro observados en la capa longitudinal de muscular externa en muestras de colon sano (flecha en la Fig. 3B, sana). En CRC, sin manchas de ADAMTS-5 observados ya sea en estado puro o estroma en células epiteliales neoplásicas, el estadio de los especímenes (flecha y la punta de flecha en la Fig. 3B, St.A, respectivamente), mientras que la expresión de ADAMTS-5 puro detectado en el estroma Las células de las muestras de fase B (flecha en la Fig. 3B, St. B). Como ADAMTS-4, ADAMTS-5 también mostraron fuerte tinción citoplasmática en las células cancerosas de la etapa C y muestras D (puntas de flecha en la Fig. 3B St.C St. y D, respectivamente) y no expresión en la etapa del estroma D. Finalmente, ADAMTS- 20 también exhibieron baja tinción en la capa longitudinal muscular externa en las muestras de colon sano (Fig. 2B, sanos), mientras que en el CCR es pura detectado sólo en las células cancerosas de la etapa B y sobre todo de especímenes etapa C (puntas de flecha en la Fig. 2B, San St.B y C, respectivamente).
tejido de colon sano y colon canceroso de la etapa B y C, manchado de ADAMTS-1 (a) y ADAMTS-20 (B). (A, ampliación, x4, sitio anatómico, ciego, ampliación, x4, sitio anatómico, ciego, ampliación, x4, sitio anatómico, el recto y B, ampliación, x4, sitio anatómico, ciego, ampliación, x20, sitio anatómico, ciego, ampliación, x20, sitio anatómico, el recto). Inserciones de A y B (todos los aumentos, x10) muestran la mucosa y la capa no bmucosa. Las flechas en colon sano muestran la expresión de ADAMTS en el tejido muscular. Las flechas en colon cancerosa muestran la expresión de ADAMTS en estroma, mientras que las puntas de flecha muestran la expresión de ADAMTS en células de cáncer.
tejido de colon sano y colon canceroso de la etapa A, B, C y D, se tiñeron para ADAMTS-4 (A) y ADAMTS-5 (B). (A, ampliación, x4, sitio anatómico, ciego, ampliación, x10, sitio anatómico, ciego, ampliación, x20, sitio anatómico, ciego, ampliación, x4, sitio anatómico, el recto, ampliación, x20, sitio anatómico, el recto y B, ampliación, x4, sitio anatómico, ciego, ampliación, x10, sitio anatómico, ciego, ampliación, x20, sitio anatómico, ciego, ampliación, x4, sitio anatómico, el recto, ampliación, x10, sitio anatómico, el recto), manchado de ADAMTS- 5. El recuadro muestra de la mucosa y no bmucosa capa en el colon sano (ampliación, x10) y la localización citoplasmática de ADAMTS-4 células de cáncer en etapa C y D (ampliación, x20 y x40, respectivamente). El recuadro muestra B de la mucosa y no bmucosa capa en el colon sano (ampliación, x10) y la localización citoplasmática de ADAMTS-5 en células de cáncer de la etapa C (ampliación, x20). Las flechas en colon sano muestran la expresión de ADAMTS en el tejido muscular. Las flechas en colon cancerosa muestran la expresión de ADAMTS en estroma, mientras que las puntas de flecha muestran la expresión de ADAMTS en células de cáncer.
ADAMTSs expresión en tejidos de cáncer de colon
análisis RT-PCR.
Los niveles de ARN de ADAMTSs PROSTITUTE examinados en el ciego saludable, sigmoide y el recto. De todas las proteasas investigados, ADAMTS-1 mostraron la expresión más alta (más del doble que el de control interno GAPDH), mientras que ADAMTS-5 el menos puro protestantes expresaron tomadura de pelo (casi al mismo nivel en cero de combate) (datos no mostrados). RT-PCR indicaron los análisis que
ADAMTS-1 | pura reducido regulado en muestras de cáncer de cualquier etapa en comparación con el colon saludable, con el mayor aumento de aproximadamente el 20% de las muestras de la etapa (Fig. 4A). Estos datos están de acuerdo con estudios anteriores, donde
ADAMTS-1 | había sido encontrado para producir las reguladas en muchos tipos de cáncer [21, 22]. Un patrón de expresión diferente de
ADAMTS-1 | pura observada para
ADAMTS-4
y-
5
, que PROSTITUTE encontrado para producir sobreexpresado en muestras etapa C; casi 14 veces y 20 veces en comparación con tejido de colon sano, respectivamente (Fig. 4C, E). Estos PROSTITUTE de datos de acuerdo con estudios previos en otros tipos de cáncer, ¿Dónde ADAMTS-4 y -5 se han encontrado para producir sobre-expresado con el fin de degradar los proteoglicanos de la MEC, como agreecan y versicano para difundir la invasión de células cancerosas litar [24, 25 ]. Siguiendo el mismo procedimiento protestante experimental para
ADAMTS-20
, puro encontrado elevados en la fase A y muestras de B en comparación con los tejidos sanos de 50% y 100%, respectivamente, pero en la etapa C especímenes que exhibió una de pliegue para 20% (Fig. 4G).
Semi-qu de Antioquía tativo RT-PCR el análisis de (a) ADAMTS-1, (C) ADAMTS-4 (e) ADAMTS-5 y (G) ADAMTS-20. Los valores son la media normalizada GAPDH-± S. D. la distribución de la proteína de (b) ADAMTS-1 (D) ADAMTS-4, (F) y ADAMTS-5 (H) ADAMTS-20. *
P
≤0.05; diferencias estadísticamente significativas en comparación con los tejidos sanos. **
P
≤0.05; diferencias estadísticamente significativas en comparación con el escenario A. ***
P
≤0.05; diferencias estadísticamente significativas en comparación con la etapa B. Ciego saludable, tejidos de colon sigmoide y recto se muestran;
El C-
: CRC etapas de Duke. Flechas ndicate de la migración masiva de los marcadores moleculares. PBS, GdnHCl y Tritón son las soluciones de extracción secuencial utilizados (más suave texto).
Analiza
Western Blot.
ADAMTS-4, -5 y -20 PROSTITUTE detectado en el ciego, sigmoides y el recto, mientras que ADAMTS-1 pura detectó sólo en sigmoide y ciego. Sin embargo, difieren en su capacidad de extracción revelando diferentes tipos de interacciones y /o la localización de estas enzimas en el tejido de colon.
ADAMTS-1 sólo puro detectado en PBS y GdnHCl /Triton saludables extractos de sigmoide y ciego, como la banda de 120 kDa y 11 kDa, respectivamente, lo que representa la forma latente de la enzima y de los productos incompletos de la síntesis, mientras que ninguno de los extractos contenía la forma datación radiactiva (80 kDa) de la enzima. (Fig. 4b). ADAMTS-1 forma pura latente también detectado en el ciego canceroso de la etapa B, utilizando el di sso creativo Eso condiciones que muestra que interactuaba con los componentes de ECM, como TIMP-3 o a2 macroglobulina, que mantuvo la enzima en su forma inactivada. En el recto de la etapa cancerosa que pura C detectado en GdnHCl como extractos del fragmento de 35 kDa, posiblemente como resultado de la actividad de las MMP (Fig. 4b). Figura A Different pura obtenida de sigmoides, donde ADAMTS-1 pura no se detectó en ninguna etapa del cáncer. Por lo tanto, se podría producir afirmado que ADAMTS-1 Papel en el CRC depende de la medida grande en el sitio anatómico.
Para el Continuar, la forma latente de ADAMTS-4 pura detectado en Triton Los extractos de los tres sitios anatómicos colon sano como una banda de 110 kDa. Sin embargo, en PBS y GdnHCl extractos de ambos ciego y el recto, la forma de datación radiactiva de la enzima (90 kDa) y varios fragmentos de diferentes tamaños moleculares y dos fragmentos distintos de 60 kDa y 70 kDa PROSTITUTE detectados, respectivamente (Fig. 4D). Por el contrario, ADAMTS-4 puro detectado en la etapa B y C especímenes principalmente en su forma datación radiactiva. En las muestras de ciego etapa B, la forma datación radiactiva de la enzima pura detectado en PBS y GdnHCl extractos, mientras que en las muestras de recto etapa C, a excepción de la forma datación radiactiva que puro encontrado en PBS Extractos, una banda adicional de 110 kDa, lo que representa su forma latente , puro también detectaron en todos los extractos del árbol.
siguiendo el mismo procedimiento protestante experimental, ADAMTS-5 datación radiactiva observó en forma pura y PBS GdnHCl saludables los extractos de colon, pero también de todas las etapas del cáncer, sin embargo, con la etapa relacionada aumento de la inmunoreactividad (Fig. 4F).
Finalmente, Western blot reveló la presencia de forma latente de ADAMTS-20 (161 kDa) en el PBS y GdnHCl los extractos de los tres sitios anatómicos de los tejidos sanos, siendo sigmoide que contiene las cantidades más bajas. Curiosamente, también puro detecta el cáncer en todas las etapas, sin embargo con las diferencias en su capacidad de extracción y en las formas moleculares. En las muestras de fase sigmoide, la forma latente de la enzima detectada en extractos puros de PBS, lo que indica que existía cierta libertad en ese tejido. ADAMTS-20 fragmentos detectados en PROSTITUTE GdnHCl y GdnHCl /Triton extractos (Fig. 4H). Los extractos de GdnHCl en muestras de ciego de fase B, el fragmento de 60 kDa única de pura obtenidos, mientras que en PBS y Gdn-HCl extractos de las muestras de recto etapa C, un fragmento de 50 kDa más pequeña adicional de pura obtenida.
Discusión
la acumulación e videncia de ADAMTSs implicación en tumores malignos humanos ha demostrado su papel importante en la progresión tumoral [21, 24, 25]. El exceso de expresión de estas proteasas es consistente con los requisitos de las células de carcinoma para eliminar los proteoglicanos de ECM, tales como agrecano y versican, como mecanismo complementario a la degradación del colágeno por las colagenasas y gelatinasas. En consecuencia, el aumento de expresión de versican se ha observado en neoplasias de colon y recto [26, 30]. mejoras significativas adicionales daría el estudio de la expresión ADAMTSs en el CCR, ya que el posible deterioro de los versicano daría lugar a fragmentos de VS datación radiactiva con roles establecidos en la progresión tumoral [14]. Por otra parte, algunos miembros de la familia ADAMTSs, los reportados para tener un potencial papel anti-angiogénico, se han silenciado epigenetically encontrados en varios tipos de cáncer, incluyendo el CRC [12]. En este estudio, la posible modulación de ADAMTS-1, -4, -5 y -20 distribución y la expresión en el cáncer de colon en comparación con el colon sano puro investigado.