Extracto
Fundamento y objetivo
La investigación relativa a la expresión de B7-H1 en células de cáncer colorrectal está en una etapa temprana. No está claro si la expresión de B7-H1 puede tener valor diagnóstico o pronóstico en el carcinoma colorrectal. Además, ¿cómo B7-H1 se asocia con las características clínicas de carcinoma colorrectal no se conoce. Con el fin de investigar la relación entre B7-H1 y el cáncer colorrectal, analizamos la expresión de B7-H1 y su efecto en muestras clínicas y células HCT116.
Métodos
parafina embebido en muestras de 143 elegibles pacientes se utilizaron para investigar la expresión de CD274 por inmunohistoquímica. También se examinó si misma B7-H1 puede estar relacionada con la proliferación celular, la apoptosis, la migración y la invasión de células de cáncer de colon HCT116.
Resultados
Nuestros resultados muestran que B7-H1 fue altamente expresado en El carcinoma colorrectal y se asoció significativamente con el estado de diferenciación celular y el estadio TNM (tumor nodo metástasis). Los pacientes con expresión de B7-H1 positivo mostraron una tendencia a la reducción del tiempo de supervivencia. Utilizando el análisis multivariado, demostramos que la expresión positiva B7-H1 es un predictor independiente de pronóstico de carcinoma colorrectal. Nuestros resultados indican que B7-H1 silenciar con siRNA inhibe la proliferación celular, la migración y la invasión. Por otra parte, la apoptosis celular también se incrementó la inhibición B7-H1.
Conclusiones
Expresión positiva B7-H1 es un predictor independiente para el pronóstico de carcinoma colorrectal. Por otra parte, desmontables de B7-H1 puede inhibir la proliferación celular, la migración y la invasión
Visto:. Shi S-J, Wang L-J, Wang G-D, Guo Z-Y, Wei M, Meng Y-L, et al. Expresión (2013) B7-H1 se asocia a peor pronóstico en el carcinoma colorrectal y regula la proliferación e invasión de células HCT116 cáncer colorrectal. PLoS ONE 8 (10): e76012. doi: 10.1371 /journal.pone.0076012
Editor: John Souglakos, Hospital General Universitario de Heraklion y Laboratorio de Biología de Células Tumorales, Escuela de Medicina de la Universidad de Creta, Grecia
Recibido: June 7, 2013; Aceptado: 19 Agosto 2013; Publicado: 4 de octubre 2013
Derechos de Autor © 2013 Shi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No.30873004, 30973000 y 81171924) y la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Shan XI (No.2011JM4006). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el carcinoma colorrectal es el tercer cáncer más frecuentemente diagnosticado en el mundo y la quinta causa principal de muerte entre los pacientes con cáncer en china [1]. Debido a la falta de marcadores de diagnóstico eficaces, la mayoría de pacientes con cáncer colorrectal tienen metástasis a distancia (estadio IV) el momento del diagnóstico. El tratamiento del cáncer colorrectal más eficaz es la cirugía. Sin embargo, la falta de marcadores de pronóstico precisos hace que sea difícil predecir el tiempo de supervivencia del paciente después de la cirugía. Por lo tanto, se requieren nuevas y eficaces marcadores para el diagnóstico y el pronóstico en la clínica
.
La molécula coestimuladora B7 homólogo 1 (B7-H1 o CD274) es un ligando identificado recientemente por la muerte co-receptor inhibitorio programado -1 (PD-1 o CD279) [2,3]. B7-H1 se expresa en células T, células B, macrófagos y células dendríticas. La expresión de B7-H1 puede ser upregulated aún más después de la activación o la presencia de IFN-γ [2-4]. Además de los linfocitos, B7-H1 también se ha detectado en niveles bajos sobre el endotelio cardíaco, células endoteliales microvasculares, islotes pancreáticos y syncytiotropho-blastos en la placenta [5,6]. Tradicionalmente, la función de B7-H1 en las células presentadoras de antígeno se logra a través de unión con PD-1 en células T, que se cree que tiene un papel importante en la inducción y mantenimiento de la tolerancia inmune [7-9].
Además de la expresión en los linfocitos y el tejido normal, la expresión de B7-H1 aberrante también se ha encontrado en diversos tumores malignos humanos. Los tipos de tumores, incluyendo los carcinomas de células escamosas del pulmón, esófago, cabeza y cuello, y otros tipos de carcinomas como el de ovario, de vejiga, cáncer de mama, melanoma y glioma también expresan B7-H1 [10-16]. La expresión de asociado a tumores B7-H1 se correlaciona con mal pronóstico y de alto grado de malignidad. El bloqueo de asociado a tumores B7-H1 se ha demostrado para promover la regresión del tumor in vivo en varios trasplantes de tumores murinos [10,12,17,18]. PD-1 de expresión está regulada positivamente en los linfocitos infiltrantes de tumor, y se ha propuesto que B7-H1 expresa en las células de cáncer pueden inhibir la función de la infiltración de linfocitos [16]. También se ha demostrado que asociado a tumores B7-H1 puede inducir la apoptosis de CTL, que posteriormente dio lugar a un escape de la vigilancia inmunitaria mediada por células T [8,10]. Estudio previo pagado excesiva atención a la función de B7-H1 asociado a un tumor, que surten efecto como un ligando para PD-1 o CD80, pero descuida el efecto de asociado a un tumor en sí B7-H1 en células tumorales. El estudio sobre el efecto de B7-H1 asociado a un tumor en las células tumorales se encuentra todavía en su infancia. Por lo tanto, asociado a tumores B7-H1 puede actuar en concierto con otros reguladores negativos de la activación de las células T para amortiguar la respuesta inmune antitumoral host [19], también con la gran posibilidad, asociado a tumores B7-H1 puede afectar el proceso de la progresión del cáncer a través de la interferencia con la función de la célula de cáncer.
la expresión de B7-H1 en carcinomas colorrectales es inconsistente. Dong et al. no pudo detectar la expresión de B7-H1 en tejidos de colon normales, pero se detectó la expresión de B7-H1 en una proporción relativamente alta (10/19) de los pacientes de cáncer de colon [10]. Sin embargo, otro grupo identificó la expresión de B7-H1 en el nivel de ARNm, sino también no pudo detectar la expresión en la superficie de las células epiteliales del colon B7-H1in de controles sanos [20]. La investigación relativa a la expresión de B7-H1 en células de cáncer colorrectal está en una etapa temprana. No está claro si la expresión de B7-H1 puede tener valor diagnóstico o pronóstico en el carcinoma colorrectal. Además, ¿cómo B7-H1 se asocia con las características clínicas de carcinoma colorrectal no se conoce. En este estudio, se investigó el perfil de expresión de B7-H1 en 5 tejidos normales del colon, 143 tejidos de cáncer colorrectal y 44 tejidos adyacentes. También se evaluó el valor predictivo de B7-H1 para el pronóstico en pacientes con cáncer colorrectal y examinamos si asociado a un tumor en sí B7-H1 podría modular directamente la progresión del cáncer colorrectal en lugar de a través de la unión a PD-1 en las células T.
materiales y Métodos
2.1: los pacientes y el seguimiento
Como ya hemos descrito anteriormente, este estudio fue aprobado por el comité de ética de la Cuarta Universidad médica Militar y todos los pacientes participantes han dado su escrito consentimiento informado por sus muestras de la información y de tejido para ser almacenado en la base de datos del hospital Xijing y se utiliza para la investigación [21]. . La cohorte retrospectivo investigatedincluded143 pacientes con carcinoma colorrectal potencialmente resecable diagnosticado a partir de febrero de 2006 a diciembre de 2007. Los pacientes fueron recogidas del Departamento de Cirugía Gastrointestinal del Hospital Xijing, Cuarta Universidad Médica Militar. Los criterios de exclusión para el reclutamiento en este estudio son los siguientes: recibir quimioterapia adyuvante antes de la cirugía, diagnóstico de tumor del estroma gastrointestinal o linfoma, diagnóstico con otros tipos de cáncer, y cualquier paciente que se niega consentimiento. Las muestras clínicas fueron recuperados desde el archivo de tejido en el Departamento de Patología, Hospital Xijing, Cuarta Universidad Médica Militar. La información de seguimiento de todos los participantes se actualiza cada 3 meses por teléfono. La supervivencia global se definió como el tiempo transcurrido desde la cirugía hasta la muerte. La información relativa a la muerte de los pacientes se determinó de su familia
2.2:. Inmunohistoquímica (IHC) tinción y evaluación
secciones de tejidos normales y tumorales incluidas en parafina se tiñeron para la expresión de B7-H1. La tinción inmunohistoquímica para B7-H1 se realizó como se informó anteriormente con ligeras modificaciones [22]. En pocas palabras, las diapositivas se deparaffinized en xileno y rehidratada en una serie graduada de alcohol antes de la actividad peroxidasa endógena fue bloqueada con el 3% de H
2O
2. Todas las proteínas de unión no específica fue bloqueada utilizando suero de conejo pre-inmune. El anticuerpo primario para B7-H1 (Abcam, ab58810) se diluyó de acuerdo con la concentración recomendada (5μg /ml), y las secciones se incubaron durante la noche en una cámara humidificada a 4 ° C. Las secciones se lavaron 3 veces con PBS, y después se añadió un anticuerpo secundario biotinilado y se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente. La visualización de la señal se realizó usando DAB cromógeno para 2-3 min. El control de tinción negativa se hizo mediante la sustitución del anticuerpo primario con suero de conejo pre-inmune. La tinción B7-H1 se obtuvo de forma independiente por dos patólogos que desconocían las características clínicas de los pacientes. El sistema de puntuación utilizado en la clasificación de la expresión de B7-H1 se describió anteriormente [23]. Los tumores con la intensidad de la inmunotinción fuerte y moderada fueron clasificados con expresión positiva (+), mientras que los tumores con inmunotinción débil ausente y se clasificaron como negativos (-) la expresión
. 2.3: Cell Cultura y
se obtuvieron células HCT116 cáncer de colon humano del Banco de células de la Academia de Ciencias de china (Shanghai, china), en el que se caracterizaron por la detección de micoplasmas, ADN -Fingerprinting, detección de isoenzimas y detección de vitalidad celular. Esta línea celular se expande inmediatamente y se congeló de manera que los cultivos celulares podrían ser renovadas cada 3 a 4 meses a partir del mismo lote de viales congelados. Las células HCT116 se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) (Hyclone, Logan, UT) y se cultivaron en un incubador humidificado a 37 ° C en 5% de CO
2
2.4: transfección siRNA y el silenciamiento de genes
Para silenciar B7-H1 en células, un pequeño ARN de interferencia (siRNA) se transfectó en las células. Los dúplex siRNAs (5'-GGCUGCACUAAUUGUCUAUTT-3 'y 5'-CCAGCACACUGAGAAUCAATT-3'), dirigidos el gen B7-H1. El dúplex de control negativo (5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ') dirige una secuencia específica. Los siRNAs fueron sintetizados por Sangon Biotech (Shanghai, China). Los dúplex siRNA (100 nmol /L) se transfectaron en células HCT116 utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) según las instrucciones del fabricante. Las células HCT116 se cosecharon 48 h después de la transfección para su posterior análisis. La eficiencia de inhibición fue identificado por Western blot (Figura S1)
. 2.5: RT-qPCR (inversa PCR cuantitativa con transcripción)
ARN celular total fue extraído utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El ARN fue luego a transcripción inversa con la ayuda Revert
TM Primera Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, Sankt Leon-Rot, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las reacciones en cadena de polimerasa con transcripción inversa cuantitativa (RT-qPCR) se realizaron utilizando un CFX96
TM en tiempo real sistema de PCR (BioRad, Valencia, CA) con reactivos SYBR Green (# DRR041A; Takara Bio, Japón) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El análisis RT-qPCR se realizó en un volumen total de 20 l con las siguientes etapas de amplificación: un paso inicial de desnaturalización a 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de desnaturalización a 95 ° C durante 15 segundos y alargamiento a la 55 ° C durante 30 seg. La expresión del gen de RT-qPCR se normalizó a β-actina humana. Los cebadores utilizados para la PCR en tiempo real en este estudio fueron los siguientes: 5 'TCAATGCCCCATACAACAAA -3' (sentido) y 5'-TGCTTGTCCAGATGACTTCG -3 '(antisentido) para B7-H1; 5'-CGTCTTCCCCTCCATCGT-3 '(sentido) y 5'-GAAGGTGTGGTGCCAGATTT-3' (antisentido) para β-actina
2.6:. Western Blot
Las células se recogieron en tampón de lisis (50 mM NaCl, 50 mM EDTA, 1% de Triton X-100) que contiene cóctel inhibidor de la proteasa (Roche, Indianapolis, IN, EE.UU.). Los lisados celulares (30 g) se separaron usando 10% en geles de SDS-PAGE y después se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Millipore, Bedford, MA). Las membranas se bloquearon con 5% de leche sin grasa diluido en PBS durante 2 h a temperatura ambiente antes de la adición del anticuerpo primario apropiado. Los anticuerpos usados en este estudio incluyen anti-B7-H1 (1: 400; Abcam, ab58810) y anti-GAPDH (1: 2.000; Abcam, mAbcam9484). A continuación, las membranas se lavaron con PBS que contenía 0,05% de Tween y se incubaron con el anticuerpo apropiado conjugado con HRP secundario (1: 10.000; Abcam) durante 1 h a temperatura ambiente. Las bandas se visualizaron usando un reactivo de quimioluminiscencia (New England Nuclear, Boston, MA)
2.7:. MTT ensayo
La proliferación celular se analizó in vitro con la sal de tetrazolio 3- (4, 5 -dimethylthiazol-2-il) -2, bromuro de 5-difeniltetrazolio (MTT) de reactivo. células HCT116 fueron transfectadas con siRNA (si-scramble o si-B7-H1) durante 24 h, y luego se examinó la proliferación. Brevemente, 2000 células de cada grupo (padres, si-scramble o si-B7-H1) se sembraron en cada pocillo de cinco placas de 96 pocillos en 200 l de medio. Para el análisis de la proliferación celular, 20 l de sustrato MTT a una concentración de 2,5 mg /ml en PBS se añadió a cada pocillo. Después las placas se volvieron a una incubadora de tejido estándar para un 4 h adicionales. Después se retiró el medio, y las células se solubiliza en 150 ml de dimetilsulfóxido para el análisis colorimétrico (longitud de onda, 490 nm). Una placa se analizó inmediatamente después de que las células adheridas (aproximadamente 4 h después de la siembra). A continuación, una placa por día fue examinada en los próximos 4 días consecutivos
2.8:. Citometría de flujo análisis para detectar la apoptosis celular
HCT116 células fueron transfectadas con siRNA (si-scramble o si- B7-H1) de 48 h, y las células se suspendieron en tampón de incubación a una densidad de 1 x 10
6 células /ml. Las células se incubaron con anexina V-FITC y yoduro de propidio (BD Bioscience, San Jose, CA) durante 15 min en la oscuridad a temperatura ambiente. a continuación, la apoptosis celular se analizó utilizando un citómetro de flujo (BD FACS Aria)
2.9:. migración y la invasión de ensayo
migración celular y la capacidad de invasión se midieron in vitro usando ensayos de migración transwell (Millipore, Billerica , MA). Las células HCT116 se transfectaron con ARNsi específicos (si-scramble o si-B7-H1) de 48 h y se suspendieron en DMEM con 10 g /L de BSA a una densidad de 50 células /ml. A continuación, las suspensiones de células (200μL) se sembraron en la cámara superior con la membrana tricodeos recubierto con (para el ensayo de invasión Transwell) o sin (para el ensayo de migración) Matrigel (BD Bioscience, San Diego, CA). Para atraer a las células, se añadieron 500 l de DMEM con 10% de suero a la cámara inferior. Después de permitir que las células migren durante 24 h o invaden durante 48 h, las células penetraron en los filtros se fijaron en metanol se secaron y se tiñeron en 4 g /L de cristal violeta. El número de células que migraron o invasivos se determinaron a partir de cinco campos aleatorios utilizando un microscopio (Olympus) a 10 × magnificación
2.10:. El análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó con el programa estadístico SPSS de IBM ( versión 20.0). Las curvas de supervivencia se estimaron utilizando el método de Kaplan-Meier, y las distribuciones se evaluaron por el log-rank test. Cox modelos de riesgo proporcional de factores relacionados con la supervivencia se utilizaron para calcular los CR y para identificar los factores que afectan a la supervivencia. Las diferencias en las características entre los 2 grupos fueron examinados por la χ
2 y el test exacto de Fisher. Todos los
P
-valores se determinaron a partir de ensayos de 2 caras, y la significación estadística se basan en un
P
-valor de 0,05.
Resultados
3.1: significado clínico de la expresión positiva B7-H1 en el tejido de cáncer colorrectal
Para determinar la prevalencia y la importancia clínica de la expresión de B7-H1 en el carcinoma colorrectal, se evaluó el nivel de proteína B7-H1 por inmunohistoquímica en una cohorte retrospectiva de 143 pacientes con cáncer colorrectal después de la resección del tumor. Entre los 143 pacientes, 64 pacientes (44,8%) mostraron expresión positiva B7-H1 en el citoplasma y la membrana (Figura 1A). Hubo 79 muestras de pacientes sin detectable expresión B7-H1 (Figura 1C). Además, sólo 5 (11,4%) de 44 tejidos adyacentes mostraron expresión positiva B7-H1 (Figura 1B & amp; D). Nuestro estudio no pudo detectar la expresión de B7-H1 en los tejidos normales del colon. También se evaluó la relación entre la expresión de B7-H1 y características clínicas utilizando una prueba de chi-cuadrado de Pearson o la prueba exacta de Fisher. Se encontró una tendencia de aumento de la expresión de B7-H1 entre el carcinoma bien y pobremente diferenciado y desde el estadio TNM I a IV. Estos resultados sugieren que la expresión de B7-H1 se asoció significativamente con el estado de diferenciación celular y el estadio TNM en el carcinoma colorrectal (
P = 0,030
y 0,034, respectivamente). Sin embargo, la expresión de B7-H1 no se correlaciona significativamente con el sexo, edad, localización del tumor, o el estado de los ganglios linfáticos (Tabla 1).
(AD) tinción immunohistochemiscal Representante de la expresión positiva y negativa de en el cáncer colorrectal o adyacentes tejido (aumento original x 100). (A) B7-H1 tejido tumoral positiva, (B) B7-H1 tejido adyacente positivo, (C) B7-H1 tejido tumoral negativo, y (D) B7-H1 tejido adyacente negativo. Se muestran imágenes representativas. (E) de asociación entre la expresión de B7-H1 y de mortalidad específica por cáncer en 143 muestras de cáncer colorrectal.
Características clinicopatológicas
Nº de pacientes en total, N =
B7-H1
χ positivo
2
p
Edad (años) 143 (59,8 ± 12,5) 641.1620.570≤4014640-606024≥606934Sex0.8420.398Men6130Women8234Tumor location2.9870.573Ascending5725Transverse1810Descending2411Sigmoid3312Rectum116T status1.9060.592T110T2145T312358T453N status0.3020.945N07233N16830N231M status0.9470.512M013361M1103TNM stagei1258.5020.034
*ii5332iii6824iv103Differentiation7.0550.030
*well7627moderately5126poorly1611Table 1. La correlación clínica entre la expresión de B7-H1 y otras características clínico-patológicas en el carcinoma colorrectal
* P ≤ 0,05 Descargar CSV CSV
. 3.2: Expresión positiva de B7-H1 se asocia con la supervivencia global pobres
para determinar el valor pronóstico de la expresión de B7-H1 en el carcinoma colorrectal, hemos analizado la relación entre la expresión de B7-H1 y el resultado clínico. El tiempo de supervivencia media general del paciente en nuestra cohorte retrospectivo fue de 43 meses (rango: 1-56 meses). De los 143 pacientes, 73 pacientes estaban vivos y 70 pacientes habían fallecido en el momento del análisis (60 meses). La relación entre B7-H1expression y la supervivencia global se investigó mediante análisis de Kaplan-Meier y la prueba de log-rank. Los pacientes se dividieron en 2 grupos en función de si B7-H1 estaba presente o ausente, que se definió como B7-H1 positivo o negativo B7-H1. Se encontró una diferencia estadísticamente significativa en la supervivencia global entre los grupos B7-H1 positivos y negativos (Figura 1E, log-rank test:
P = 0,0169
). Los pacientes con positivo B7-H1expression tendían a tener un mayor riesgo de muerte en comparación con los pacientes con negativo B7-H1expression. El CRI no ajustado fue 2,611 (IC del 95%: 1,008-3,576; p = 0,006). Como se muestra en la Tabla 2, la diferenciación celular y la etapa TNM también se asociaron con el pronóstico de carcinoma colorrectal. En el análisis multivariado, se encontró que la expresión de B7-H1 positivo se asoció con una disminución de la supervivencia global. El HR ajustado fue de 2.771. (IC del 95%: 1,048-2,994; p = 0,003), lo que indica que la expresión de B7-H1 podría ser un factor pronóstico independiente de estas características clínico ajustados (Tabla 2) guía empresas univariante
multivariado
HR
95% IC
Valor P
HR
95% IC
Valor P
B7-H1 expression2.611(1.008-3.576)0.006
*2.771(1.048-2.994)0.003
*Age0.815(0.497-1.335)0.4160.888(0.520-1.516)0.663Sex1.225(0.757-1.983)0.4081.010(0.596-1.714)0.433Tumor location1.199 (0.463-3.104) 0.7090.904 (0.281-2.906) 0.865TNM stage2.345(1.153-2.778)0.010
*1.416(1.179-1.971)0.043
*Differentiation1.956(1.224-2.928)0.030
*3.192(1.126-3.679)0.004
*Table . 2. Análisis de regresión de Cox de factores pronósticos de la supervivencia global en pacientes con cáncer colorrectal (n = 143)
IC del 95%: intervalo de confianza del 95% * P ≤ 0,05 Descargar CSV CSV
3.3: caída efectiva de B7-H1 por siRNA en células HCT116
se ha informado de que asociado a tumores B7-H1 podría promover la apoptosis de las células T [10], pero no hay estudios que indican un papel para la expresión B7-H1 en las células tumorales. Como línea celular de cáncer colorrectal humano usado comúnmente, las células HCT116 se han demostrado para ser invasiva y muy móviles in vitro [24 a 26]. Por lo tanto, para examinar la función de B7-H1 en biología celular del cáncer colorrectal, se utilizó siRNAs dirigidos B7-H1 para inhibir la expresión de B7-H1. A continuación, examinó las características de las células del tumor, incluyendo la proliferación celular, la apoptosis, la migración y la invasión. La caída efectiva de B7-H1 fue confirmada por QRT-PCR, Western blot y análisis de citometría de flujo. En comparación con las células transfectadas con siRNA revueltos, células transfectadas con siRNAs a B7-H1 demostraron una reducción significativamente la expresión de B7-H1 (cada experimento se realizó tres veces, y el resultado típico está presente como la figura 2A, 2B y 2C).
(a) análisis de RT-qPCR para mostrar el nivel B7-H1 ARNm. células de los padres o HCT116 transfectadas con siRNA codificado o siRNA dirigidos B7-H1 durante 48 h se recogieron y se realizó RT-qPCR; (B) Análisis de transferencia Western para detectar el nivel de proteínas B7-H1. células parentales o HCT116 transfectadas con siRNA revueltos o siRNA dirigidos B7-H1 durante 48 h se recogieron y se prepararon y utilizaron para la transferencia de Western de lisados de células; (C) El análisis por citometría de fluorescencia y la media canal para mostrar la expresión de B7-H1 en la membrana celular. células de los padres o HCT116 transfectadas con siRNA codificado o siRNA dirigidos B7-H1 durante 48 h se recogieron y tinción de la superficie celular se realizó antes del análisis de citometría de flujo. Los datos se presentan como media ± desviación estándar, * P & lt; 0,05 frente al grupo si-scramble
3.4:. Efecto de B7-H1 caída sobre la proliferación celular
Después de confirmar la eficacia desmontables de los siRNAs dirigidos B7-H1, se determinó el efecto de un nivel de B7-H1 reducida sobre la proliferación celular usando un ensayo MTT. células HCT116 que fueron transfectadas con siRNA dirigidos B7-H1 mostraron significativamente menos proliferación de las células parentales o revueltos siRNA-transfectadas (Figura 3A). Este resultado demuestra la B7-H1 tuvo un efecto directo sobre la proliferación celular en las células HCT116 y de que un alto nivel de proteína B7-H1 se correlaciona con el aumento de la proliferación celular.
(A) análisis MTT para detectar la proliferación celular. células parentales o HCT116 fueron transfectadas con siRNA revueltos o siRNA dirigidos B7-H1 durante 48 h se sembraron en placas de 96 pocillos y la proliferación celular se detectó por MTT. Los datos se presentan como media ± desviación estándar, * P & lt; 0,05 frente al grupo si-scramble. (B) Análisis de citometría de flujo para detectar la apoptosis de células. Se recogieron células de los padres o HCT116 transfectadas con siRNA revueltos o siRNA dirigidos B7-H1 durante 48 h y se tiñeron con anexina-V-FITC y PI antes del análisis de citometría de flujo. Los datos se presentan como media ± desviación estándar, * P & lt; 0,05 frente al grupo si-scramble
. 3.5: Efecto de B7-H1 caída en la apoptosis de las células
Hemos demostrado que la nivel de expresión B7-H1 se correlaciona con la proliferación celular. Por lo tanto, hemos probado si la inhibe la proliferación celular puede ser causado por el aumento de la apoptosis celular en las células desmontables B7-H1. Se analizaron las células HCT116 transfectadas con siRNA scramble o siRNA dirigidos B7-H1 durante 48 h para la apoptosis. Los resultados indican que, en comparación con las células siRNA transfectadas parentales o revueltos, las células transfectadas con siRNA dirigidos B7-H1 había aumento del índice de apoptosis que calcula poner las células en los 1 y las células en el 2 (12,3 ± 5,9% y 17,2% ± 6,2 vs. 1,1 ± 0,4%, P & lt; 0,05; 12,3 ± 5,9% y 17,2% frente a 0,9 ± 0,5%, P & lt; 0,05; cada experimento se realizó tres veces, y el resultado típico está presente como la Figura 3B). En conjunto, estos resultados sugieren que la expresión de B7-H1 en células HCT116 es importante tanto para la proliferación celular y la apoptosis
3.6:. Efecto de B7-H1 caída sobre la migración celular y la invasión
B7 -H1 se ha demostrado previamente para regular la migración celular y la invasión en las células de carcinoma de páncreas [27]. Nuestras observaciones que la expresión de B7-H1 jugó un papel importante en la proliferación celular y la apoptosis HCT116 nos llevó a evaluar la función de B7-H1 sobre la migración celular y la invasión de células de cáncer de colon. Para probar la migración, se utilizaron ensayos de cámara de transwell estándar recubierta con Matrigel o sin recubrimiento. Hemos encontrado que en comparación con las células siRNA transfectadas revueltos, las células HCT116 transfectadas con siRNAs dirigidos B7-H1 había reducido la migración y capacidad de invasión (Figura 4A-4D), y un número de serie /migración celular reducido índice invasiva (célula invasión, Figura S2 ). En conclusión, nuestros resultados indican que la expresión de B7-H1 en las células HCT116 se correlaciona con la proliferación celular, la apoptosis, la migración y la invasión.
ensayo de cámara de Boyden (A) para detectar la migración celular. células de los padres o HCT116 transfectadas con siRNA o revueltos siRNA dirigidos B7-H1 durante 48 h se sembraron en cámaras de Boyden sin membrana recubierta con Matrigel, y después de otras 48 horas, las células migradas se tiñeron y se contaron bajo un microscopio (ampliación × 10). Se muestran imágenes representativas. (B) Número de células migraron mostrados en A. Los datos se muestran como la media ± SD de cinco campos. * P & lt; 0,05 frente al grupo si-scramble. (C) de ensayo de cámara de Boyden para detectar la invasión de células. células de los padres o HCT116 transfectadas con revueltos siRNA o siRNA dirigidos B7-H1 durante 48 h se sembraron en cámaras de Boyden modificadas con membrana recubierta con Matrigel, y después de otras 24 horas, las células invasoras que se movían a través de la membrana de Matrigel se tiñeron y se contaron con un microscopio (ampliación × 10). Se muestran imágenes representativas. (D) Número de células invasivas se muestran en C. Los datos se muestran como la media ± SD de cinco campos. * P & lt;. 0,05 frente al grupo si-scramble
Discusión
B7-H1 es altamente expresado en diferentes tipos de tumores. Sin embargo, la correlación entre la expresión de B7-H1 y la progresión del cáncer colorrectal no ha sido bien estudiado [20,28]. En este estudio, se confirmó que la expresión de B7-H1 se pudo detectar tanto en el cáncer colorrectal y los tejidos adyacentes, pero a una frecuencia diferente. También hemos presentado pruebas de que la expresión positiva B7-H1 se correlacionó con las características clínicas y patológicas adversas en pacientes con carcinoma colorrectal. Por otra parte, hemos demostrado que el nivel de expresión de B7-H1 también fue predictivo de progresión de la enfermedad y la muerte específica por cáncer. Nuestros resultados mostraron los pacientes con expresión positiveB7-H1 son por lo general a un riesgo significativamente mayor de progresión del cáncer, la muerte específica del cáncer y la supervivencia general más corta. Este aumento del riesgo fue independiente del sexo, la edad, el tamaño del tumor, localización del tumor, el estado de diferenciación y el estadio TNM. Estos resultados proporcionan la primera evidencia de apoyo B7-H1 como predictor de mal pronóstico en el carcinoma colorrectal.
El hallazgo más interesante e inesperado era nuestros resultados demostraron que sí B7-H1 correlacionada con la proliferación celular, apoptosis, migración y invasión. Aunque algunos grupos de investigación han confirmado que las células tumorales que expresan B7-H1 tenían un alto índice de proliferación [14,27], la mayoría de los grupos tendían a creer B7-H1 a prevenir la destrucción del tumor solamente mediante la formación de "un escudo molecular [18,29]", pero no formando "una más potente lanza" [18,30]. Nuestro hallazgo proporciona evidencia poderosa que B7-H1 puede tener la función oncogénica durante la carcinogénesis colónica, que arrojan una nueva luz sobre la función de B7-H1 en el desarrollo del cáncer colorrectal.
La tasa de recurrencia del carcinoma colorrectal es relativamente alto. Una posible razón para la recurrencia es que el tumor residual puede evadir immunesurveillance anfitrión. Estudios previos han confirmado que la alta infiltración de células T en el tejido de cáncer colorrectal se correlaciona con una mejoría en la supervivencia global a los 5 años. Un alto nivel de infiltración de células T puede servir como un mejor predictor de pronóstico que la puesta en escena histopatológico convencional [31]. Sin embargo, también se ha demostrado que los pacientes con cáncer colorrectal tienen una población Treg expandida. El aumento del número de células Treg puede suprimir CD4
+ función de las células T en respuesta a antígenos asociados a tumores [32]. También se ha informado de que la frecuencia de células T reguladoras en TDLNs se correlacionó con la etapa de la enfermedad [33]. los pacientes con cáncer colorrectal con alta expresión de Th1 o grupo de genes citotóxicos tienen una supervivencia libre de enfermedad prolongada. A la inversa, la alta expresión de los genes de racimo Th17 como resultado un mal pronóstico [34,35]. La relación entre B7-H1 asociado a tumor y la función de las células T infiltradas en el microambiente tumoral ha sido bien establecida. También es bien aceptado que asociado a tumores B7-H1 puede ayudar a las células tumorales evaden la vigilancia inmunológica mediante la inhibición de la función de las células T efectoras y la mejora de la función de células T reguladoras en el cáncer colorrectal [36]. Y nuestros resultados apoyan esta idea para alta expresión de B7-H1 que puede paralizar el immunesurveillance anfitrión se asocia con un mal pronóstico en el cáncer colorrectal.
Sin embargo, la función de B7-H1in la supresión de la inmunidad tumoral todavía no es entendido completamente. Por ejemplo, ¿cómo B7-H1 regula la función de las células T y se debe identificar el receptor putativo no-PD-1. La identificación de B7-1 como un nuevo receptor-H1 B7 hizo la cuestión más compleja, y la complejidad de estas interacciones moleculares sugiere que B7-H1 o PD-1 bloqueo por sí sola puede no ser suficiente para bloquear las vías inhibidoras. Y nuestros resultados hacen esta pregunta incluso ser más complicado. Nuestros resultados mostraron que las células con expresión reducida B7-H1 habían deteriorado la proliferación celular, la migración y la invasión. Además, la reducción de B7-H1expression provocó un aumento de la apoptosis celular (Figuras 3 y 4 amp;). Aunque un mecanismo más detallada debe ser descubierto a explicar nuestros resultados, estos resultados proporcionan evidencia de que B7-H1 puede ser no sólo un ligando para PD-1 o un receptor putativo no-PD-1, sino también funcionar como una molécula oncogénica. Tomados en conjunto nuestros resultados y literaturas anteriores, podemos obtener la conclusión de que B7-H1 puede acelerar la progresión del cáncer colorrectal, aunque la inhibición de la función de células T y la mejora del grado de malignidad de las células del cáncer colorrectal, por lo que es asociado con el mal pronóstico en pacientes con cáncer colorrectal.
también notó un poco la literatura llegar a una conclusión contradictoria con nuestro estudio.