Extracto
BTN3A2 /BT3.2 butyrophilin la expresión de ARNm de células tumorales fue previamente identificado como un factor pronóstico en una pequeña cohorte de cáncer epitelial de ovario seroso de alto grado (HG-EOC). A continuación, se evaluó el valor pronóstico de BT3.2 a nivel de proteínas en una muestra de 199 pacientes HG-EOC. Como la única función conocida de las proteínas butyrophilin está en la regulación inmune, se evaluó la asociación entre la expresión BT3.2 e infiltración intratumoral de células inmunes mediante técnicas de inmunohistoquímica con anticuerpos específicos contra BT3.2, CD3, CD4, CD8, CD20, CD68 y CD206. expresión epitelial BT3.2 se asoció significativamente con la supervivencia global más larga y un menor riesgo de progresión de la enfermedad (HR = 0,651, p = 0,006 y HR = 0,642, p = 0,002, respectivamente) y significativamente asociado con una mayor densidad de la infiltración de células T, en particular Las células CD4 + (0,272, p & lt; 0,001). También se observó una fuerte asociación entre la densidad relativa de las células CD206 +, tal como se evaluó por la relación de intratumoral CD206 + /CD68 + expresión, y el riesgo de progresión de la enfermedad (HR = 1,355 p = 0,044, respectivamente). En conclusión, la proteína BT3.2 es un biomarcador de pronóstico potencial para la identificación de pacientes con EOC HG-mejor resultado. En contraste, alta CD206 + /CD68 + expresión se asocia con un alto riesgo de progresión de la enfermedad. Si bien el papel de BT3.2 es aún desconocida, nuestro resultado sugiere que BT3.2 expresión por las células epiteliales puede modula la infiltración intratumoral de células inmunes
Visto:. Le Page C, Marineau Un, Bonza PK, Rahimi K, L Cyr, Labouba I, et al. (2012) Expresión BTN3A2 de cáncer epitelial de ovario se asocia con mayor tumor infiltrante células T y un mejor pronóstico. PLoS ONE 7 (6): e38541. doi: 10.1371 /journal.pone.0038541
Editor: V. Salvatore Pizzo, Duke University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 6 Febrero, 2012; Aceptado: May 7, 2012; Publicado: 7 Junio 2012
Derechos de Autor © 2012 Le Page y col. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por una beca de la Sociedad de Investigación del cáncer y Fondation Carole Epstein. El Dr. Cailhier sostiene una beca clinicien-chercheur del Fonds de Recherche en Santé du Québec. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción cáncer de ovario
epitelial (EOC) es la principal causa de muerte entre los tumores malignos ginecológicos [1]. Debido a su falta de síntomas, la enfermedad a menudo se diagnostica en una etapa avanzada (estadio III o IV) cuando el cáncer ya se ha diseminado a sitios secundarios. El tratamiento estándar para estos pacientes es la cirugía y la quimioterapia basada en platino, aunque la enfermedad progresa a menudo incluso después de la cirugía y se hace resistente a la quimioterapia estándar [2]. En consecuencia, la tasa de supervivencia de los pacientes en estadio avanzado de EOC es extremadamente baja (& lt; 40%). Las variables clínicas, como el estadio de la enfermedad y la enfermedad residual, son de pronóstico [3], [4], pero en gran parte no informativa para las personas con enfermedad en estadio avanzado.
En un estudio anterior [5], se realizó un ARNm de perfiles de expresión de los tejidos tumorales EOC serosos de alto grado para identificar marcadores moleculares de pronóstico utilizando una plataforma de microarrays de expresión génica basada en Affymetrix. Entre los marcadores de pronóstico identificados, encontramos BTN3A2, también conocido como BT3.2 y BTF4, un gen perteneciente a la familia butyrophilin BT3, también una subfamilia B7. BTN3A2 mRNA fue el biomarcador más robusta entre otros 8 ensayados. No sólo tiene un significado pronóstico en los análisis univariados y multivariados, pero también mostró el índice de riesgo más alto en comparación con las otras variables pronósticas moleculares y clínicos. la expresión de ARNm de alta BT3.2 está fuertemente asociada con un buen pronóstico en relación con la supervivencia libre de enfermedad y la supervivencia global. Como un marcador pronóstico EOC que alcanzó el 87% y especificidad del 77% de sensibilidad para predecir la recurrencia temprana (& lt; 18 meses). En una cohorte de 52 pacientes [5]
El butyrophilin (BTN) de la familia contiene BTN1A1, BTN2A1 , los miembros BTN2A2, BTN2A3, BTN3A1, BTN3A2, BTN3A3, y BTN-similares. Curiosamente, estos nuevos miembros de la familia comparten BTN considerable homología con miembros de la familia B7, que tienen un dominio de exoplasmic IgV-como seguido por otro exoplasmic dominio IgC-similares. El dominio citoplásmico contiene una proteína de unión de dominio SPRY /PRY B30.2 [6], [7], [8]. A diferencia de otros miembros de la BTN, BT3.2 no tiene un dominio B30.2 en la región intracelular [7], [9]. Se conocen moléculas BT3 (BTN3A1 /BT3.1, BTN3A2 /BT3.2 y BTN3A3 /BT3.3) que se expresa en las células endoteliales [10], en la capa de membrana que rodea la leche gotita secretoras de grasa de las células epiteliales mamarias [11] , en las células inmunitarias, y en algunas líneas de células tumorales [5], [12].
Las moléculas B7 pueden ser reguladores positivos o negativos de la activación de células T. B7-H1 /PD-L1, B7-H3, H4-B7, B7DC /PD-L2, B7S3, B7S1, BTNL2, BTN1A1, BTN2A2 pueden inhibir la proliferación de células T, enviando una señal inhibitoria. A la inversa, B7-H3 se ha considerado como una molécula reguladora positivo y negativo capaces de estimular o inhibir las células CD4 + y T CD8 +, dependiendo del contexto celular [13], [14], [15], [16]. Del mismo modo, algunos miembros de la familia BTN han surgido recientemente como nuevos reguladores del sistema inmunológico. Estos incluyen BTNL2 [17] - [18] BT1.1, BT2.2 [19], BTNL1 [20], [21] y las moléculas BT3. Por ejemplo, Yamashiro
et al.
[22] trató PMBC con un anticuerpo contra BT3.3 y observó una inhibición de CD4 + y CD8 + la proliferación celular, así como disminución de la secreción de citoquinas por los dos tipos de células T. En otro informe, Cubillos-Ruiz
et al
. mostró que la expresión BT3 en las células presentadoras de antígeno (APC) inhibió
vitro
proliferación de células T en Th1 y la secreción de citoquinas [23]. Si bien estos estudios han analizado la función de miembros de la familia B7 cuando se expresa en el componente inmunológico, no está claro cómo estas moléculas podrían afectar la respuesta inmune cuando se expresa por otros tipos de células. De hecho, los datos publicados soporta la expresión de BT3 en las células EOC en los tejidos primarios y metastásicos tejidos [23]. Además, Messal N.
et al
. informó recientemente de que BT3 actúa como una molécula co-estimuladora en las células T CD4 + y células NK [24]. Curiosamente, se observó un papel diferencial de inmuno-reguladoras de las diferentes isoformas BT3. En total, esto sugiere que los mecanismos complejos pueden gobernar la función de las moléculas de BT3. Se necesitan más observaciones para comprender el papel exacto de estas moléculas de una manera específica de contexto.
Para entender mejor el papel de BT3.2 en cáncer de ovario y más particularmente a confirmar nuestra asociación observada de la expresión del ARNm BT3.2 con un buen pronóstico del paciente [5], se realizó un análisis inmunohistoquímico de la expresión de la proteína BT3.2 en una gran cohorte de 199 pacientes EOC serosos de alto grado y se confirmó la asociación de BT3.2 y el pronóstico de los pacientes con EOC. En paralelo, se analizaron la densidad de las células inmunes intratumorales y encontramos una correlación positiva entre la expresión BT3.2 por las células EOC y la infiltración intratumoral de células T, mientras que una alta relación de CD206 + /CD68 + expresión se asoció con la supervivencia libre de enfermedad. Estos resultados sugieren un papel de BT3.2 en la infiltración tumoral de las células inmunes.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
aprobación
Ética se obtuvo por el comité de ética institucional local (comité d'éthique de En busca del Centro Hospitalario de la Universidad de Montreal). Las muestras tumorales fueron recogidos y peraltadas tras el consentimiento por escrito adecuado de los pacientes sometidos a cirugía en el Departamento de Oncología en el Centro Hospitalario de la Universidad de Montreal de 1993 a 2010.
Pacientes y muestras de tejido
Tumor las muestras se recogieron y peraltadas posteriores a la autorización apropiada de los pacientes sometidos a cirugía dentro de la División de Oncología ginecológica en el Centro Hospitalario de la Universidad de Montreal de 1993 a 2010. un patólogo independiente anotó grado y estadio tumoral y un oncólogo ginecológico anotó la enfermedad tumoral residual de acuerdo a los criterios de la Federación Internacional de ginecología y Obstetricia [25]. Menos de 10% de la muestra fueron excluidos en la calidad, y esto no se correlacionó con la edad de la muestra. Los datos clínicos sobre el intervalo libre de progresión se define de acuerdo a las imágenes de exploración y el nivel de CA125 en sangre [26]. La supervivencia global se definió como el tiempo desde la cirugía a la muerte por cáncer de ovario. Los pacientes que se sabe que sigue vivo en el momento del análisis fueron censurados en el momento de su última visita de seguimiento. supervivencia libre de enfermedad del paciente (DFS) se calculó a partir del momento de la cirugía hasta la primera progresión. Los criterios de elegibilidad para la inclusión en el estudio fueron los siguientes: sin tratamiento quimioterapéutico preoperatorio de cáncer de ovario, el tratamiento de quimioterapia post-operatoria basada en platino, tumores de alto grado, histopatología subtipo seroso y el consentimiento informado completado. Todos los pacientes recibieron una quimioterapia basada en platino como tratamiento inicial después de la cirugía con la excepcion de los pacientes que murieron poco (& lt; 3 meses) después de la cirugía. Los pacientes que murieron de otras enfermedades fueron censurados en el momento de la última visita de seguimiento. Un oncólogo ginecológico revisó los datos clínicos de todos los pacientes. Para el estudio de la progresión libre de enfermedad, sólo se incluyeron pacientes con un seguimiento clínico de al menos 18 meses o hasta que la recurrencia de la enfermedad. Las características de los tumores y los resultados del paciente para los conjuntos de la muestra se resumen en la Tabla 1.
Cultivos Celulares y sedimentos celulares en Histogel
Para verificar la especificidad de los anticuerpos BT3.2 , células TOV-112D y líneas celulares derivadas se cultivaron en medio OSE (50:50 mezcla de 199 y 105 medios Sigma) suplementado con 0,5 mg /ml de anfotericina B, 50 mg /ml de gentamicina y 10% de FBS (fetal bovino suero). células derivadas medios de comunicación también se complementaron con 0,5 mg /ml de puromicina. Las células se mantuvieron en una incubadora humidificada a 37 ° C con una atmósfera que contiene 5% de CO2 esencialmente como se describe [27]. Precipitar las células embebidas en parafina se prepararon como se describe anteriormente [28].
Los plásmidos
El BT3.1, secuencias BT3.2 y BT3.3 se subclonaron en los vectores pef6v5 y fueron una generosa regalo del Dr. Rodas (Cambridge, Reino Unido) [7]. Todos los plásmidos se verificaron mediante secuenciación. Las secuencias de isoformas BT3 se amplificaron por PCR y se subclonaron en el pENTR ™ /D-TOPO® (Invitrogen, Carlsbad, CA) y después se han recombinado en el plenti-CMV /TO-puoDest (Abgene) [29]. la producción de partículas lentiviral y la infección de células se realizaron como se informó anteriormente [30].
fueron seleccionados de tejido Microarray
Las áreas de tumor basado en la revisión de un portaobjetos de hematoxilina-eosina-manchado. tumor bloques FFPE fueron entonces una biopsia de tejido utilizando un arrayer diámetro de 0,6 mm y núcleos resultantes fueron dispuestos en una cuadrícula en un bloque de parafina receptor. La matriz de tejido se compone de 260 muestras de cáncer de ovario y 11 muestras de las áreas de las trompas de Falopio normales de pacientes con cáncer. Después de la revisión de los datos clínicos de 61 pacientes fueron excluidos del análisis final, ya que no cumplían con los criterios de inclusión. a continuación, se seccionó esta matriz de tejido, teñido con hematoxilina-eosina y recibió otra revisión de la patología para confirmar el contenido del tumor.
La inmunohistoquímica (IHC)
formol e parafina fijo tumores embebidos se seccionaron a 4 micras y el diapositivas fueron teñidas manualy en el banco o el uso de la tinción XT automatizado de referencia (Ventana Medical System Inc.). Para el método manual, las secciones de tejido se calentaron brevemente a 50 ° C durante 15 minutos, deparaffinized en tolueno y rehidratada en un gradiente de etanol. Los portaobjetos se sumergieron en tampón Tris-EDTA (10 mM Tris base, 1 mM EDTA ajustado a pH 9,0) y la presión cocido durante 15 min para desenmascarar antígenos. Un 0,6 o 3% de H
2O
2 de tratamiento se utiliza para eliminar la actividad peroxidasa endógena. Las secciones fueron bloqueadas con un reactivo libre de suero de bloqueo de proteína (DakoCytomation Inc., ON, Canadá) y se incubaron con diferentes anticuerpos para 60 o 120 min a temperatura ambiente. La concentración óptima para cada anticuerpo primario se determinó mediante diluciones en serie. Los anticuerpos y las condiciones de IHC se enumeran en la Tabla S1. Los tejidos se incubaron con un anticuerpo conjugado con HRP anti-ratón de cabra (1:150) (sc-2005, Santa Cruz Biotechnology, CA, EE.UU.). Para BT3.2, los tejidos se incubaron con un anticuerpo biotinilado secundario (DakoCytomation Inc., ON, Canadá) durante 30 min seguido de incubación con un complejo (DakoCytomation Inc., ON, Canadá) estreptavidina-peroxidasa durante 30 min a temperatura ambiente. Los productos de reacción fueron desarrollados usando diaminobencidina que contiene 0,3% de H
2O
2 como un sustrato de peroxidasa. Los núcleos se counterstained con hematoxilina. Con la tinción automatizada, la recuperación de antígenos para CD206 y CD4 se llevó a cabo con la célula acondicionado 2 (VMSI;#950-123). anticuerpo prediluido se dispensó de forma automática, y los portaobjetos se incubaron a 37 ° C durante 30 min. UltraView kit de detección de DAB (VMSI;#760-091). Las diapositivas se counterstained con hematoxilina (VMSI;#760 a 2021). Todas las secciones fueron observadas por microscopía de luz a 400 × magnificación. La sustitución del anticuerpo primario con tampón fosfato salino sirvió como control negativo.
Immunofluxorescence (SI)
formol e incluidas en parafina fijado tumores fueron teñidas manualy después de la recuperación de antígenos en Tris-EDTA (10 mM Tris base, 1 mM de EDA ajustó a pH 9,0) durante 15 minutos en la olla pressur. Las secciones se bloquearon con una proteína de reactivo de bloqueo libre de suero (DakoCytomation Inc., ON, Canadá) y se incubaron con los anticuerpos anti-CD68 durante 90 minutos a temperatura ambiente. Los tejidos se incubaron con un anticuerpo de cabra anti-ratón Cy5 (1/200) durante 45 min. anticuerpos IgG de ratón se bloquearon durante la noche con el reactivo de M.O.M. ™ (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Los anticuerpos anti-CD206 se incubaron durante 90 min a temperatura ambiente. Los tejidos se incubaron con anticuerpo de cabra anti-ratón de Alexa Fluor A488 (1/250) durante 45 minutos antes de lavar y el tratamiento con 0,1% de B negro Sudán durante 10 min para reducir la autofluorescencia. Los portaobjetos se contratiñeron con ProLong® oro antifade medio de montaje fluorescente con DAPI (Molecular Probes). La lectura se realizó por análisis de microscopio a alta potencia y después se evaluó la tinción dual immunoflourescent para su validación.
tinción Cuantificación
secciones tumorales se escanea y se visualiza digitalmente. Para BT3.2, zonas epiteliales se puntuaron de acuerdo con la intensidad de la tinción de la membrana epitelial (valor de 0 para ausencia, 1 para débil, 2 para moderado, 3 para alta intensidad) como se ilustra en la Figura 1. En los núcleos donde tinción fue de de intensidad variable se informó de la intensidad media. La cuantificación de la infiltración de linfocitos se llevó a cabo mediante el recuento del número de células nucleadas con tinción positiva en los islotes intraepiteliales. Resultados A continuación, se clasifican como 0 (sin células), 1 (0 & lt; n & lt; 10), 2 (10 & lt; n & lt; 90) y 3 (n & gt; 90) en consecuencia del número de células contadas. La cuantificación de los macrófagos se llevó a cabo mediante la evaluación del porcentaje de células teñidas en la zona intraepitelial. La densidad relativa de las células CD206 + se calculó mediante la relación de células teñidas CD206 + /CD68 +. Cada serie se analizó de forma independiente en un estudio ciego por dos observadores independientes. correlación inter-calificación era & gt; 75%. Cuando se produjeron fuertes diferencias en la puntuación entre los dos observadores (más de 1 unidad por núcleo) se volvió a evaluar el núcleo para llegar a una puntuación concordantes entre los dos observadores. El promedio de todos los núcleos con cáncer del mismo paciente se utilizó para el análisis.
A. El análisis de Western-blot de extractos de proteínas totales de la línea celular infectada con TOV112D PLENTI (control vectorial), BT3.1, BT3.2 o construcciones virales BT3.3. Los extractos se cargan por triplicado en SDS gel de 10% /PAGE y las membranas se hibridaron con anti-CD277 (eBioscience), anti-BT3.3 (Atlas anticuerpos) y anti-BT3.2 (SDIX Inc.) como se indica en la parte inferior de la figura. B. Análisis inmunohistoquímico de los sedimentos celulares en parafina procedentes de la línea celular TOV112D infectadas con cualquiera de PLENTI (control vectorial), BT3.1, BT3.2 o la BT3.3 construcciones virales. Sólo las células transfectadas con la construcción BT3.2 teñidas positivamente con el anticuerpo anti-BT3.2 (SDIX Inc.). C. La inmunohistoquímica de los tumores de xenoinjertos de TOV112D transfectadas con el vector vacío o bien constructo BT3.2. Sólo las células infectadas con el constructo BT3.2 teñidas positivamente con el anticuerpo anti-BT3.2 (SDIX Inc.). D. Representante tinción inmunohistoquímica para de BT3.2 en un alto grado seroso EOC TMA. De izquierda a derecha:. Negativa, baja, moderada y alta intensidad
Western blot
Las células se lisaron con tampón de lisis frío (10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 NaCl mM, EDTA 1 mM, DTT 1 mM /mM NaF 1 /0,5% NP-40 /y proteínas inhibidores) y se centrifugó durante 10 min a 13.000 rpm. lisados claros fueron entonces hirvieron en tampón de carga, separados por 10% SDS-PAGE, y se transfirieron sobre una membrana de nitrocelulosa. Las membranas se saturaron con 5% de leche /PBS /0,1% de Tween 20. La inmunodetección se realizó como se describe en el protocolo del kit ECL (Amersham Pharmacia): es decir, se incubaron 2 h a temperatura ambiente o O /N a 4 ° C con la específica anticuerpo, se lavó con PBS /Tween 0,01% y se incubaron durante otros 30 min a temperatura ambiente con anticuerpos conjugado con peroxidasa (Santa-Cruz Biotechnology Inc.). El análisis de Western-blot se realizó con la beta-actina AC-15 (ab6276 de Abcam inc. MA, EE.UU.), anti-CD277 /BT3.1 (# 14-2779 de eBioscience, San Diego, CA, EE.UU.), anti-BT3 0,2 (SDIX, Newark DE, EE.UU.), anti-BT3.3 (HPA007904, anticuerpos del Atlas, Estocolmo, Suecia). Los experimentos se realizaron por triplicado.
Análisis estadístico
La prueba de correlación de Pearson (dos colas) se utilizó para estimar la correlación con las variables y marcadores clínico-patológicas como variables continuas. Las curvas de supervivencia se trazaron utilizando el análisis de la curva de Kaplan-Meier y se utilizó la prueba de log-rank para la prueba de diferencias significativas. Se utilizaron característicos (ROC) del receptor operativos para determinar el valor umbral para cada marcador que corresponde a la mejor sensibilidad y especificidad para la progresión del paciente antes de los 18 meses (progresión de la enfermedad temprana) o después de 20 meses (progresión de la enfermedad tardía) desde el diagnóstico inicial (p & lt; 0,05 y el área & gt; 0,60) como ya se ha informado [5]. modelos de riesgos proporcionales de Cox univariante y multivariante se utilizaron para calcular el índice de riesgo para cada marcador como variables continuas. El análisis multivariante se realizó utilizando un modelo de riesgo por pasos hacia adelante en el análisis univariado se requiere para la entrada en el modelo. Sólo cuatro variables fueron incluidas en el modelo de regresión de Cox para evitar el exceso de ajuste. El análisis multivariante se realizó utilizando un modelo de riesgo entran. Tamaño de la muestra (n & gt; 100 en la que n = 10 k /p) y la distribución normal de expresión BT3.2 se consideraron antes de aplicar el modelo de Cox. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el paquete estadístico para la versión de software 11.0 Ciencias Sociales (SPSS, Inc.), y la significación estadística se fijó en
P
. & Lt; 0,05
Resultados
expresión de BTN3A2 /BT3.2 en EOC tejidos
Para investigar la asociación entre la expresión de BT3.2 en las células EOC y la supervivencia del paciente, se realizó un análisis de inmunohistoquímica en una cohorte de 199 ovario seroso de alto grado pacientes con cáncer. En primer lugar, se evaluó la especificidad de los anticuerpos disponibles contra isoformas BT3. Encontramos 3 anticuerpos diferentes disponibles en el mercado: anti-CD277 (eBioscience Inc.), anti-BT3.3 (Atlas) y anti-BT3.2 (de SDIX Inc.). Los anticuerpos fueron probados por el Western Blot de extractos celulares de la línea celular de cáncer de ovario TOV112D infectado con cualquiera BT3.1, o partículas retrovirales o BT3.2 BT3.3. Como se ve en la Figura 1A, el anti-CD277 reconocido BT3.1 y BT3.2 isoformas. Como se esperaba, el anticuerpo anti-BT3.3 exclusivamente reconoce la isoforma BT3.3 y el anti-BT3.2 reconoció específicamente la isoforma BT3.2. Para confirmar la especificidad del anticuerpo anti-BT3.2 en tejidos embebidos en parafina, también se analizó la tinción de gránulos de las células embebidas en parafina y tejidos de xenoinjerto de células 112D TOV transfectadas ya sea con un vector vacío o construcciones de isoformas BT3. Como se ve en la Figura 1B y 1C, el anticuerpo anti-BT3.2 fue capaz de teñir sólo el sedimento celular BT3.2 y tumor de xenoinjerto BT3.2
.
membrana y la expresión citoplasmática de BT3.2 en cáncer de ovario se observó y se puntuaron los tejidos de acuerdo con la intensidad de la tinción como ausente, bajo, moderado o fuerte (0, 1, 2, 3, respectivamente) (Figura 1D). se observó la presencia de proteínas BT3.2 en las células epiteliales y en algunos núcleos de tejido, sino que también se puede encontrar en el estroma. Casi todos los núcleos de EOC (n = 193, 97,5%) mostraron expresión de BT3.2. En las células epiteliales, tanto citoplasmática y la membrana tinción se observaron (Figura 1D) y varió de ausente a fuerte (Figura 1D, la Tabla 1). Los niveles de expresión epitelial BT3.2 no se correlacionaron significativamente con la edad del paciente al momento del diagnóstico o el grado del tumor. Por el contrario, los pacientes con mayor nivel de BT3.2 epiteliales tienden a tener menor nivel de enfermedad residual y la enfermedad de etapa inferior (p = 0,058 yp = 0,043, respectivamente, Tabla 2).
BT3. 2 expresión proteína está asociada con la supervivencia global y libre de enfermedad Progresión
Hemos investigado previamente la relación entre la expresión de ARNm BT3.2 y pronóstico de los pacientes de cáncer de ovario. Kaplan-Meier y Cox modelo de riesgos proporcionales fueron utilizados para estimar la asociación entre BT3.2 ARNm y el pronóstico según lo definido por la supervivencia libre de enfermedad o la supervivencia global (DFS) dentro de los 18 meses después de la cirugía [5]. En el presente estudio, se investigó si la proteína BT3.2 también podría ser de valor pronóstico. Para este propósito, la expresión de proteínas de BT3.2 se analizó en 199 pacientes serosos de alto grado y los análisis estadísticos se realizaron con respecto a la supervivencia global y DFS. Las características de cohorte se describen en la Tabla 1.
Las curvas de Kaplan-Meier mostró que hubo una fuerte asociación entre la alta expresión de la proteína BT3.2 y el aumento de la supervivencia global de pacientes (p = 0,014; log rank = 6,03) ( Figura 2A). Intervalo medio de supervivencia fue de 85 meses para los pacientes con mayor nivel de BT3.2 en comparación con 59 meses para los pacientes con bajo nivel de BT3.2. Del mismo modo, los pacientes con mayor expresión de BT3.2 tenían un intervalo de progresión media de 86 meses en comparación con 55 meses para los pacientes con baja expresión de BT3.2 (p = 0,002, log rank = 9,65) (Figura 2B).
Las curvas de Kaplan-Meier de supervivencia global (a) y la supervivencia libre de enfermedad (B) en 194 y 171 pacientes, respectivamente. Significación (p) se indica mediante log rank.
En el análisis de regresión de Cox univariante, se evaluó el nivel de continua de la proteína BT3.2 para reflejar la relación entre el aumento del nivel de expresión BT3.2 y un mejor pronóstico . En este análisis, la expresión aumentada de BT3.2 se asoció con un riesgo relativamente alto de riesgo (HR) para la supervivencia (HR = 0,651; IC del 95%: 0,479 hasta 0,884, p = 0,006, Tabla 3). Del mismo modo, el aumento de expresión BT3.2 se asoció significativamente con la progresión de la enfermedad más adelante (HR = 0,642, IC95% 0,483-0,853; p = 0,002) (Tabla 3).
En el análisis de regresión de Cox, cuando las variables de pronóstico estándar se llevaron a cabo (edad, estadio y enfermedad residual), BT3.2 mantuvo una variable independiente para predecir un alto riesgo de supervivencia (HR = 0,597, IC95% desde 0,415 hasta 0,859, p = 0,005) y el riesgo de progresión de la tarde en este modelo multivariado (HR = 0,675, IC95% 0,487-0,935; p = 0,018) (Tabla 3).
relación entre la expresión y BT3.2 inmune Infiltrado
la hipótesis de que la relación entre el epitelio BT3. 2 expresión y un buen pronóstico era debido a la influencia sobre la infiltración de células inmunes tumor, ya que se sabe que las moléculas de la familia B7 tienen funciones de corregulación en las células T. Además, el nivel de infiltración de células inmunes intratumoral se ha relacionado con el pronóstico de pacientes con cáncer de ovario [31]. Para investigar esta hipótesis, se evaluó por inmunohistoquímica la presencia de células T por CD3 +, CD4 + y CD8 + en la misma tinción TMA utiliza para el análisis BT3.2. También se evaluó la importancia de las células intratumoral B (CD20 +) y macrófagos de infiltración (CD68 +). Dos clases de macrófagos se han descrito, anti-tumoral (M1) y pro-tumoral (M2). Dado que en la mayoría de los tumores, los macrófagos asociados al tumor (TAM) tienen un M2-fenotipo [32], [33], se determinó la densidad de la infiltración de células CD206 + como un marcador sustituto de los macrófagos M2 pro-tumorales alternativas ya que tienden a expresar mayor nivel de CD206 marcador de macrófagos M1. Para confirmar la especificidad de la expresión de CD206 por los macrófagos en tumores EOC, se realizó una doble tinción por inmunofluorescencia de control en un número limitado de tejidos (Figura S1). expresión CD206 casi siempre co-localizada con la expresión CD68 sugiriendo expresión de macrófagos.
Como se ve en la Figura 3 y la Figura 4A-B, la infiltración inmune de las células T, las células B y TAM se observó en los tejidos de EOC en diversas densidades en las áreas intraepiteliales. La infiltración intraepitelial de células T, CD3 +, CD4 + o CD8 +, fue altamente correlacionado con la presencia de células CD20 + B (P & lt; 0,001) y CD68 + macrófagos (P & lt; 0,001), incluyendo las células CD206 + (Tabla 4). La infiltración intraepitelial de células B también se asoció con la presencia de CD68 + y células CD206 + (r = 0,364 y r = 0,171, P & lt; 0,001 y p = 0,022, respectivamente). Curiosamente, la proporción de células CD206 + en relación con la densidad total de macrófagos CD68 +, la relación CD206 + /CD68 + expresión, se correlacionó inversamente con la presencia de células T CD3 + y tendió a correlacionarse con la presencia de las células B (r = -0,216, p = 0,005 y r = -0,141, p = 0,063, respectivamente) (Tabla 4).
de manera significativa, la expresión de BT3.2 por las células de EOC se correlaciona con la infiltración intraepitelial de CD3 + células (r = 0,174 , p = 0,018), incluyendo las células CD8 + (r = 0,176, p = 0,018) y las células CD4 + (r = 0,272, P & lt; 0,001). No hay correlación significativa entre la expresión BT3.2 y la presencia de células CD20 + o macrófagos se observó (p = 0,137, Tabla 4).
de alta y baja densidad de células CD3 + (células T), CD4 + (células T), CD8 + (células T) y CD20 + (células B) que se muestran en los paneles izquierdo y medio. Una ampliación en la zona alta de infiltración se muestra en el panel derecho para cada tinción.
Asociación de intratumoral linfocitos, macrófagos y EOC pronóstico del paciente
Según lo informado por otros [ ,,,0],31], la presencia de células CD4 + fue también inversamente correlacionada con la progresión de la enfermedad temprana (r = -0,187, p = 0,021, Tabla 5). De Kaplan-Meier análisis de la curva y la prueba de log rank confirmó que alta densidad intraepitelial de células CD4 + se asocia con un mejor pronóstico (Tabla S2). El intervalo de progresión media de los pacientes con altos células intra-epiteliales CD4 + fue de 69 meses, en comparación con 59 meses para los pacientes con bajo CD4 + intraepitelial densidad (p = 0,011, rango log = 6,5). Sin embargo, no se observó ninguna asociación significativa entre la densidad intraepitelial de células CD3 + o CD8 + y el pronóstico del paciente (Tabla 5 y la Tabla S2). Se encontró una asociación significativa entre CD20 + infiltración celular y la supervivencia global (log rank p = 0,039), mientras que sólo se obtuvo una tendencia hacia una mejor supervivencia libre de enfermedad (log rank p = 0,0677). Sin embargo, la asociación con la supervivencia global no se observó cuando CD20 + fue considerado como una variable continua en el modelo de regresión de Cox univariante (p = 0,21).
Mientras que no observamos una correlación entre la densidad de CD68 + o CD206 + células
y el pronóstico del paciente (Tabla 5), un aumento de la proporción de CD206 + en relación con las células CD68 + se correlacionó positivamente con la progresión de la enfermedad (r = 0,157, p = 0,049, Tabla 5). Esta relación fue confirmada por análisis de la curva de Kaplan-Meier (p = 0,005, rango = 7,83 log, la figura 4D, el cuadro S2) y el análisis de regresión de Cox univariante (HR = 1,355; IC del 95%: 1,223 a 5,332, p = 0,044). Además, la densidad relativa CD206 + tendía a asociar con una pobre supervivencia global (log rank = 3,53, p = 0,06) (Figura 4C, el cuadro S2) con una razón de riesgo de 2.077 (IC del 95%, 0,947-4,558; p = 0,068).
de alta y baja densidad de CD68 + (macrófagos asociados a tumores, TAM) (A) y CD206 + (M2 subtipo de TAM) células (B). Aumentos en la zona alta de infiltración se muestra en el panel derecho para cada tinción (arriba). análisis de C y D. Kaplan-Meier de la proporción de la infiltración de células + /CD68 + CD206 intraepitelial que representan la densidad relativa de CD206 + M2 TAM sobre la densidad total de CD68 + intraepiteliales infiltración de macrófagos. Kaplan-Meier de supervivencia global (C) y la supervivencia (D) libre de enfermedad en 180 y 174 pacientes, respectivamente. Significación (p) se indica mediante log rank.
Discusión
En este estudio, la inmunohistoquímica reveló tinción BTN3A2 /BT3.2 en los tumores serosos de alto grado EOC de 199 pacientes. La expresión se detectó en alta frecuencia (97,5%) de acuerdo con los datos anteriores el análisis de la expresión de ARNm en los tejidos de EOC serosas [5]. El aspecto importante de este estudio es la confirmación de BT3.2 como un potencial marcador pronóstico de EOC seroso de alto grado a nivel de proteínas. El estudio inicial de identificación de BT3.2 ARNm como marcador pronóstico se limita a un conjunto relativamente pequeño de 52 casos. En este caso, no sólo se confirmó la relación entre BT3.2 y un mejor resultado en una gran cohorte, sino también a nivel de proteínas mediante técnicas de inmunohistoquímica. Esto constituye una técnica más fácilmente trasladable en un departamento de patología clínica de la detección de ARNm tales como Q-PCR. Los pacientes con alta tinción epitelial del BT3.2 tenían 1,53 veces menos riesgo de morir de la enfermedad que los pacientes con bajo nivel de expresión BT3.2. La asociación de BT3.2 a la supervivencia y a la progresión de la enfermedad fue de un parámetro independiente dentro de un análisis de regresión de Cox multivariado (Tabla 3). Combinación con otros marcadores moleculares independientes podría mejorar su rendimiento clínico como hasta la fecha ningún marcador individual ha demostrado la suficiente sensibilidad y especificidad.
Una limitación de nuestro estudio es el bajo número de pacientes sin enfermedad residual (n = 23) , lo que no permite analizar como una cohorte independiente. pacientes a citorreducción óptima, en general tienen un mejor pronóstico que los pacientes con enfermedad residual [34] para los cuales un biomarcador pronóstico puede ser menos informativo.