Extracto
quimiotaxis celular es la función más conocida de los receptores de quimioquinas que están estrechamente vinculadas con la metástasis tumoral. De hecho, la expresión positiva de receptores de quimioquinas también podría ser identificada incluso en algunos pacientes sin tumores metastásicos, mientras que la importancia clínica de estos datos no se ha establecido completamente. Nuestros estudios fueron diseñados para aclarar los perfiles de expresión de CCR4 y explorar su posible papel en el cáncer histológicamente con ganglios negativos (pN0) gástrico (CG). La inmunohistoquímica (IHC) o análisis immunohistofluorescence (IHF) se realizó en muestras obtenidas de 108 pacientes con pN0 GC. Se encontró que CCR4 fue aberrante sobreexpresados tejidos inpN0 GC, con diferentes patrones de expresión en las células tumorales y estando asociado con T-etapa (
P
= 0,002). El matrigel
vitro
ensayo de invasión en reveló que la sobre expresión de CCR4 en líneas celulares de GC mejora de forma significativa la capacidad invasiva de estas células. Los resultados de tiempo real RT-PCR y gelatinzymography mostraron un aumento significativo de la metaloproteinasa de matriz (MMP) -9 producción inducida por la expresión forzada de CCR4 en líneas celulares de GC. Nuestros datos sugieren que la expresión CCR4 aberrante está implicada en la invasión tumoral de pN0 GC y, posiblemente, los antagonistas de CCR4 podría ser candidatos útiles para el control de los primeros eventos en la progresión tumoral
Visto:. Yang Y, Du L, Yang X, Qu A, Zhang X, Zhou C, et al. (2015) Expresión aberrante CCR4 está involucrada en la invasión tumoral de los ganglios linfáticos negativos de cáncer gástrico humano. PLoS ONE 10 (3): e0120059. doi: 10.1371 /journal.pone.0120059
Editor Académico: Chih-Hsin Tang, de la Universidad Médica de China, Taiwán
Recibido: Septiembre 29, 2014; Aceptó 3 de febrero de 2015; Publicado: 19 Marzo 2015
Derechos de Autor © 2015 Yang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Los autores confirman que sus datos están dentro del manuscrito y su actual archivo de información de apoyo
Financiación:. Este estudio fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Grant números 81271916 y 81301506), el Fondo de Investigación del Programa de Doctorado de Educación superior de China (Nº 20120131110055), Fundación para la Innovación de la Universidad de Shandong Independiente (IIFSDU, 2012TS174), el Proyecto de Desarrollo Tecnológico de Shandong (STDP, 2013GSF11859), la Fundación de Ciencias Naturales de Shandong (Grant No. ZR2013HM104) y la clave Nacional de clínicas Fundación médica de Especialidades
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
al igual que en la mayoría de los cánceres, el cáncer gástrico (CG) es una altamente. malignidad agresiva que tiende a invadir el tejido circundante y metástasis en órganos distantes. Aunque los pacientes con cáncer gástrico con ganglios negativos tienen mejores resultados que aquellos con metástasis ganglionar [1, 2], algunos de los cuales todavía sufrían de recidivas locales o metástasis a distancia después de la resección curativa [3-5]. La identificación de factores eficaces o moléculas clave que asocian con la progresión de la enfermedad en pacientes con cáncer gástrico ganglios negativos por etapas es necesario, teniendo en cuenta que estos pacientes podrían beneficiarse de las terapias adyuvantes.
quimiotaxis juega un papel clave en la metástasis tumoral, la dirección de la motilidad de las células metastásicas a través de gradientes de factores quimiotácticos. En particular, los receptores de quimioquinas median la metástasis de órganos específicos de tumores mediante la interacción con sus quimiocinas que coinciden en los órganos diana [6]. células de cáncer gástrico podrían expresar varios receptores de quimioquinas, tales como receptores de quimioquinas 4 (CXCR4) y del receptor de quimioquinas 7 (CCR7), y co-Opt estas moléculas para la metástasis [7-12]. Otras funciones de los receptores de quimioquinas en la progresión del cáncer, excepto para la quimiotaxis rara vez se han descubierto. CCR4, un receptor de tipo quimiocina C-C, anteriormente se ha centrado en su función biológica en inmunopatogénesis de tumores hematológicos [13]. Hasta la fecha, se ha prestado relativamente poca atención a la función de CCR4 en la promoción de la metástasis de algunos tumores sólidos, incluyendo cáncer gástrico [14-17]. Nuestro grupo ha demostrado que los GCs ricos en linfocitos tienden a ser más frecuentemente positivos para CCR4, y se encontró un nuevo papel de CCR4 en la inmunosupresión inducida por tumor [18], lo que indica diferentes perfiles de expresión de CCR4 en los tejidos de GC y roles multifuncionales de esta molécula en la progresión de GC.
es bien sabido que la invasión es la primera etapa que conduce a la metástasis del cáncer. Evidencias han mostrado que algunos receptores de quimioquinas, tales como CXCR4 [19] y CCR7 [20], promueven de células B invasión de células de leucemia linfocítica crónica a través de la regulación de MMP-9. Recientemente, Yu et al. mostró que CXCR4 podría promover la migración celular y la invasión a través de la inducción de la expresión de MMP-9 y MMP-13 en el carcinoma oral de células escamosas [21]. Li y sus colegas encontraron que CCR7 participó en la invasión del cáncer de colon humano a través de la regulación positiva de la MMP-9 [22]. Sin embargo, no es claro si CCR4 también podría promover la invasión de las células cancerosas.
Dada la amplia distribución de los receptores de quimiocinas dentro de los tumores YSUS posibles papeles en la invasión tumoral y la metástasis, la hipótesis de que pN0 pacientes con cáncer gástrico que transporten determinadas quimiocinas Los receptores pueden ser más propensos a experimentar una mayor progresión. Para probar nuestra hipótesis, investigaron los perfiles de expresión de CCR4 en células de cáncer gástrico de los pacientes pN0 y su papel en la invasión de células de cáncer gástrico.
Materiales y Métodos
Pacientes y muestras
las muestras de tejido se obtuvieron de 108 pacientes (75 varones y 33 mujeres, con edades entre 35-71 años, edad media 62 años) con cáncer gástrico pN0 sometidos a resección curativa del tumor primario en el hospital de la Universidad de Shandong Qilu (Jinan, china). Se utilizó anteriormente se correspondía con los tejidos normales adyacentes del estómago y tejidos de 56 pacientes con displasia gástrica (36 hombres y 20 mujeres, con edades entre 35-68 años, edad media 48 años) como controles. Todos los diagnósticos histopatológicos y clasificaciones malignos fueron determinados por los patólogos de alto nivel en el momento del diagnóstico, según la Organización Mundial de la Salud clasificación histológica Internacional de tumores [23], y la puesta en escena patológica postoperatoria se determinó con base en la Internacional Union Against Cancer (UICC) [24 ]. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Qilu, y también se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes.
La inmunohistoquímica y immunohistofluorescence
IHC o IHF se llevó a cabo en secciones de parafina utilizando anticuerpos contra humana CCR4 (LS-A351; LifeSpanBioSciences, Seattle, WA, EE.UU.) y citoqueratina de anticuerpos (CK) anti-pan (ab80826; Abcam, Cambridge, MA, EE.UU.), siguiendo las instrucciones proporcionadas por cada fabricante. anticuerpos fluorescentes incluyen anticuerpos de cabra anti-conejo conjugado con TRITC-(E031320; Amyjet Scientific, Inc. Wuhan, China), cabra anti-ratón de anticuerpos conjugados con FITC (E0312400; Amyjet Scientific, Inc. Wuhan, China). Las muestras se visualizaron y se observaron con un microscopio de fluorescencia (IX81, Olympus, Tokio, Japón), y los resultados de IHC se analizaron como se informó anteriormente [18]
Cultivo de células
El gástrico humano. líneas celulares de cáncer SGC-7901 y BGC-823 se adquirieron de la Colección Cultura de la Academia de Ciencias de china (Shanghai, china) y se mantuvieron en medio RPMI-1640 (Hyclone, Logan, UT, EE.UU.) suplementado con FBS al 10% (Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) a 37 ℃ en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2.
transitoria sobre-expresión de CCR4 en SGC-7901 y las células BGC-823
transitoriamente la transfección del plásmido EGFP-CCR4 (CCR4) o un vector de expresión de EGFP (Mock) en líneas de células gástricas se realizó utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) como se informó anteriormente [18]. Y las eficiencias de transfección se determinaron por microscopía de fluorescencia, reacción en cadena de transcripción inversa de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR) y citometría de flujo (FCM), respectivamente.
Cuantificación de ARNm por RT-PCR y el tiempo real de RT -PCR
el ARN total fue aislado de las células, utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) e inverso de la transcriptasa reacciones se llevaron a cabo con el kit de acuerdo con el protocolo del fabricante (Fermentas, St. Leon-Rot, Alemania ). Para RT-PCR, se utilizaron los cebadores y las condiciones de PCR para la amplificación de CCR4 tal como se describe anteriormente [25]. Y gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa humana (GAPDH) (cebador directo, 5'-GGTGGTCTC-CTCTGACTTCAACAG-3 '; cebador inverso, 5' GTTGTTGTAGCCA-AATTCGTTGT-3 ') fue usedas un estándar interno. Por tiempo real RT-PCR, se utilizaron cebadores para CCR4, MMP-9 y GAPDH y condiciones de amplificación como se informó anteriormente [18, 25, 26].
FCM análisis
Se recogieron las células se incubaron con una ficoeritrina (PE) conjugado con anticuerpo anti-CCR4 monoclonal (FAB1567P, R & amp; D Systems) o con un control de IgG2b de ratón-PE isotipo (IC0041P, R & amp; D Systems) según las instrucciones del fabricante. Luego se llevó a cabo utilizando el análisis FCM un citómetro (Becton Dickinson, Heidelberg, Alemania) para analizar la expresión en las células CCR4 SGC-7901 y BGC-823, respectivamente.
ensayos de invasión de Matrigel
La
in vitro
ensayo de invasión se realizó en el uso de los insertos de cultivo celular que contenía 24 membranas de 8 mm (BD Biosciences, San Jose, CA). Cada membrana se recubrió con Matrigel (30 mg, Becton Dickinson, San Jose, CA) y se incubó durante 30 min. A continuación, 0,2 ml transfectadas o células de GC de los padres se resuspendieron en suero libre de RPMI-1640 con una concentración de 1,5 × 10
5 /ml y se coloca en la cámara superior, y 0,6 ml de RPMI-1640 que contenía medio 10% de FBS era añadido a la cámara basolateral. Después de 24 h de incubación a 37 ℃ con 5% de CO
2, las células se fijaron y se tiñeron con 0,2% eosina Y. El número de células que habían migrado a la parte basal de la membrana se cuantificó con un microscopio óptico a 200 × magnificación.
viabilidad de las células de ensayo
Las células se sembraron en placas de 96 pocillos a 5 x 10
3 células /pocillo y se cultivaron para los puntos de tiempo indicados. La viabilidad celular se evaluó utilizando CCK8 (Beyotime, Haimen, China) siguiendo las instrucciones del fabricante. La absorbancia se midió a 450 nm de longitud de onda. Cada punto de tiempo se repitió en tres pozos y el ensayo se independentlyperformed por tres veces.
Gelatina zymography
Los sobrenadantes se recogieron por centrifugación después de 24 horas después de la transfección y se resolvieron en un gel de SDS-PAGE que contenía 0.1% (w /v) de gelatina. Después de la electroforesis, las proteínas se renaturalizaron por lavado del gel dos veces durante 40 min en 2,5% de Triton X-100, seguido de una incubación durante 18 horas a 37 ° C en una mezcla que contiene Tris-HCl 50 mM (pH 7,6), CaCl
2 5mMm y NaCl 200 mM. A continuación, el gel se lavó brevemente en agua destilada y se tiñeron con Coomassie ácido 0,25% Brilliant Blue R250 /45% de metanol /10% ácido acético durante 4 horas y después se destiñó en metanol al 45%, ácido acético 8%. Los geles fueron escaneados y se fotografiaron con los sistemas Kodark.
El análisis estadístico
Los datos de al menos tres experimentos independientes se analizaron y se expresaron como la media ± SD. La relación entre la expresión de CCR4 y T-etapa se analizó mediante la prueba de chi-cuadrado. Otros datos se analizaron por la prueba t de Student o ANOVA siempre que sea apropiado. Un
valor de P Red de menos de 0,05 fue considerado estadísticamente significativo. Todos los análisis se realizaron utilizando el software estadístico (versión 13.0, SPSS, Inc., Chicago, IL).
Resultados
El exceso de expresión de CCR4 con distintos patrones de expresión en pN0 tejido de cáncer gástrico precoz
CCR4 expresión en células de cáncer se detectó a niveles variables. Entre 108 tejidos incluidos en parafina, 29 casos (26,9%) mostraron expresión negativa (-), 30 casos (27,8%) mostraron una expresión débil (+), 35 casos (32,4%) mostraron una expresión moderada (++), y 14 casos (13,0%) mostraron una fuerte expresión (+++) (Fig. 1A-D). Todos los tejidos normales del estómago adyacentes mostraron tinción negativa para CCR4, y sólo 2 (3,6%) casos de displasia gástrica mostró débil expresión de CCR4 membrana (Fig. 1E y F).
CCR4 se detectó en los diferentes niveles, incluyendo expresión negativa (-) (A), la expresión débil (+) (B), la expresión moderada (++) (C) y una fuerte expresión (+++) (D). La expresión fue negativa en células no neoplásicas (el área derecha en la imagen) adyacentes a las células CCR4 positivos de cáncer gástrico (E), y la débil expresión de CCR4 membrana fue encontrado en las lesiones preneoplásicas gástricas (F). Ampliación, × 400 (dC, F), × 200 (E).
Tanto expresión en la membrana y el citoplasma de CCR4 se observa con mayor frecuencia en los nidos de tumor bien diferenciado de tipo intestinal, mientras que el menos- células diferenciadas tienden a mostrar un patrón citoplasmático de expresión CCR4 en el cáncer gástrico de tipo difuso (Fig. 2). Un fenómeno interesante fue que las células con potencial altamente invasivos, tales como la invasión del músculo, la penetración de invasión vascular y nervioso, también muestran un patrón de expresión de CCR4 citoplasmática (Fig. 3).
fluorescencia verde representa las células positivas con membrana y distribución citoplasmática de CK, fluorescencia roja representa las células CCR4-positivo, mientras que el amarillo representa la combinación de ambos. Y tanto la expresión membrana y citoplasma de CCR4 se observa con mayor frecuencia en los nidos de tumor bien diferenciado de tipo intestinal, mientras que las células menos diferenciadas tendían a mostrar un patrón de expresión citoplasmática CCR4 en el cáncer gástrico de tipo difuso. Ampliación, × 400.
CCR4 expresión fue baja en células menos agresivas y bien diferenciados de cáncer (A), la expresión de CCR4 whereascytoplasmic fue alta en las células cancerosas altamente invasivos, incluyendo aquellos con invasión muscular (B) , la penetración vascular (C) y la invasión del nervio (D). Ampliación, × 400.
CCR4 sobreexpresión promueve la invasión de células de cáncer gástrico
En las secciones típicas, se muestra también que el nivel de expresión de CCR4 tendió a aumentar con la profundidad de la invasión tumoral (Fig. 3). El análisis IHC mostró claramente que la sobre-expresión de CCR4 se asoció positivamente con el estadio T (
P
= 0,002), la invasión vascular (
P
= 0,001) y la invasión perineural (P = 0,002) pN0 en GC (Tabla 1).
Nos han informado de que los niveles de proteína CCR4 eran bastante bajos en algunas líneas de células gástricas [18], y por lo tanto para obtener más conocimientos en la invasión tumoral mediada por CCR4 , se realizó la sobre expresión de CCR4 en líneas de células gástricas como anteriormente hemos descrito [18]. altas eficiencias de transfección se determinaron por el tiempo real de RT-PCR, FCM y microscopía de fluorescencia, respectivamente (Fig. 4A-C). El EGFP fue expresado en el núcleo, el citoplasma y la membrana de las células de control del vector, que han sido transfectadas con el plásmido MOCK; y la proteína de fusión fluorescente se localizó en el citoplasma y la membrana de las células transfectadas plásmido CCR4. ensayo de invasión Matrigel mostró que el número de células de cáncer gástrico EGFP-CCR4 transfectadas que pasan por el matrigel fueron significativamente mayores que los de las células transfectadas falsamente cáncer gástrico (Fig. 4D). El ensayo CCK8 indicado que la sobreexpresión de CCR4 no tuvo ningún efecto sobre la proliferación celular de cáncer gástrico (S1 Fig).
células SGC-7901 y BGC-823 fueron transfectadas transitoriamente con vacío (MOCK) o CCR4-expresión de vector (EGFP -CCR4) usando Lipofectamine2000, y la eficiencia de transfección se confirmó mediante un microscopio de fluorescencia (a), RT-PCR (B) y FCM (C) a las 24 o 48 horas después de la transfección, respectivamente. D, las células se resuspendieron en 200μl libre de suero RPMI-1640 con una concentración de 1,5 × 10
5 /ml después de la transfección a las 24 h, y después se dejó invadir los insertos Transwell (poros de 8 micras) recubiertas con Matrigel para otro 24h. Las células que invadieron a través de las inserciones se contaron y se fotografiaron bajo un microscopio de luz a 200 × magnificación. Los datos se presentan como imágenes representativas o como la media ± SD (n = 3 en cada columna) a partir de más de tres experimentos individuales. histograma, CCR4 gris-llenado; histograma vacío, isotipo. Los datos se presentan como imágenes representativas y la media ± desviación estándar y para los tres experimentos separados de cada grupo. *,
P Hotel & lt; 0,05; **,
P Hotel & lt; 0.01.
CCR4 reguladas MMP-9 en la producción de células de cáncer gástrico
Para probar los posibles mecanismos que subyacen a la invasión tumoral mediada por CCR4, se evaluó el efecto de CCR4 de MMP-9 expresión y actividad. en tiempo real el análisis de RT-PCR (Fig. 5A) mostró que las células de cáncer gástrico EGFP-CCR4 transfectadas expresaron mayores niveles de mRNA de MMP-9 en comparación con las células falsamente transfectadas a las 24 horas después de la transfección. análisis gelatina zimografía (Fig. 5B) reveló que la secreción y la actividad de MMP-9 fueron significativamente hasta reguladas en los sobrenadantes de células EGFP-CCR4 transfectadas en comparación con células transfectadas de manera simulada a las 48 h después de la transfección, con o sin la adición de CCL22 exógeno.
a, en tiempo real RT-PCR mostró que MMP-9 expresión de ARNm se upregulated en las células CCR4 GC-transfectadas en comparación con la de las células transfectadas de manera simulada a las 24 horas después de la transfección. B, zimogramas que muestra la digestión de gelatina por la pro-MMP-9 (92 kd) y MMP-9 activa (85 kd). La secreción de MMP-9 eran claramente hasta reguladas en los sobrenadantes de las células CCR4 transfectadas en comparación con células transfectadas de manera simulada a las 48 h después de la transfección, con o sin la adición de CCL22 exógeno. Los datos se presentan como imágenes representativas o media ± desviación estándar y para los tres experimentos separados de cada grupo. *,
P Hotel & lt; 0,05; **,
P Hotel & lt; 0.01.
Discusión
Las interacciones entre los receptores de quimioquinas de las células de cáncer y sus quimiocinas coincidentes representan pasos críticos en la metástasis tumoral. Sin embargo, los resultados de nuestro actual studyshowed que un cierto número de pacientes con cáncer gástrico y sin metástasis linfática también fueron positivas para la tinción CCR4. A diferencia de la mayoría de los estudios anteriores sobre las funciones de la quimiotaxis mediada por algunos receptores de quimioquinas, esta investigación reveló una novela, comportamiento invasivo de CCR4.
Los receptores de quimiocinas pertenecen a una familia de receptores acoplados a la proteína G de siete transmembrana que son membrana proteínas, y las consecuencias funcionales de la actividad del receptor de quimiocinas son generalmente se cree que depende de la estimulación por ligandos extracelulares [27]. Sin embargo, las muestras histológicas del presente estudio mostraron que no hubo distintos patrones de expresión de CCR4. CCR4 en células no neoplásicas mostró tinción negativa, con solamente tinción de membrana débil en las lesiones de displasia gástrica. La membrana citoplasmática y la expresión de CCR4 más frecuentemente aparecieron en moderado a nidos tumorales bien diferenciados, mientras que la expresión en células menos diferenciadas tendía a ser confinado principalmente en el citoplasma. Y más intrigante, como se muestra en las secciones típicas, las células tumorales que presentan capacidades invasivas altas, tales como la invasión del músculo, la penetración y la invasión vascular del nervio, con frecuencia mostraron un aumento de la expresión citoplásmica de CCR4. Nuestros datos indican una estrecha relación entre el patrón de expresión de CCR4 citoplasmática y los comportamientos agresivos de células de cáncer gástrico. Este hallazgo es contrario a la suposición común de que el dominio extracelular de un receptor de quimioquinas se requiere necesariamente en la metástasis tumoral a través de la interacción con su ligando. fenómenos similares se han observado con el receptor de quimiocina CXCR4, cuya localización nuclear se asoció con la progresión de diversos tumores [28-30]. Estos datos indictate que las células de cáncer gástrico pueden invadir los tejidos cercanos a través de CCR4 de una manera independiente de ligando. La otra hipótesis era que la internalización CCR4 causada por su ligando podría representar un mecanismo que ha evolucionado en el patrón de expresión CCR4 citoplasmática. CCL22, el ligando CCR4 producido por los tejidos de cáncer gástrico humano [31], también se sabe que causeCCR4 internalización de la membrana a citoplasma [32, 33], lo que sugiere tinción citoplásmica podría mostrar de señalización activadas después de la ligadura CCR4-CCL22. Se necesitan más estudios para revelar los mecanismos exactos que subyacen a estos patrones anormales de la expresión del receptor de quimioquinas implicadas en la progresión tumoral. Además, la expresión lentamente-intensificación de CCR4 en los tejidos premalignos, aunque estadísticamente insignificante mayor que en los tejidos normales con el tumor adyacente, sugirió que CCR4 también puede participar en las etapas preneoplásicas de desarrollo del tumor inicial.
En nuestra anterior estudio, se encontró que CCR4 se sobreexpresa en el tejido GC, pero no encontró diferencias significativas entre los pacientes con y sin metástasis a los ganglios linfáticos [18]. Por lo tanto la hipótesis de que los receptores de quimioquinas también podrían desempeñar un papel importante en el desarrollo del cáncer de los pacientes pN0. En el presente estudio, los resultados mostraron una correlación positiva entre la expresión de CCR4 y T-etapa, que fueron consistentes con nuestros hallazgos inmunohistoquímicos que la expresión de CCR4 tendió a aumentar a medida que la profundidad de la invasión tumoral progresó. El efecto de CCR4 en la invasión de células de cáncer gástrico se confirmó parcialmente por transwell ensayos de invasión celular. Estos ensayos se realizaron en condiciones en que no se añadió ligando de receptor CCR4 exógeno. Era posible que pueden existir diferentes mecanismos para regular invasión de células tumorales mediada por CCR4 de una manera independiente de ligando, de acuerdo con el fenómeno de patrón citoplasmático de CCR4 que estaba relacionado con el comportamiento altamente invasiva de las células tumorales en el tejido GC. Se confirmó que la sobre expresión de CCR4 fue estrechamente asociada con un mayor grado de invasión tumoral, lo que indica que CCR4 sobre-expresión puede conferir potencial metastásico en células de GC y promover aún más la progresión tumoral. También la hipótesis de que los ligandos CCR4 autocrinos también estaban involucrados en la motilidad celular
in vitro
. Las concentraciones de CCL22 en las líneas celulares sobrenadante GC culturales transfectadas con o sin CCR4 eran bastante bajo como evaluamos (datos no mostrados). Sin embargo, la posibilidad no puede excluirse que la producción autocrina o paracrina de CCL22 podría contribuir a la invasión del tumor a través de CCL22 /eje CCR4
in vivo
. CCL17 y CCL22, los ligandos de afinidad CCR4 tan altas, se producen por GC y otros tejidos de cáncer. En particular, CCL22, que se produce ya sea por las células cancerosas o macrófagos asociados a tumores, se ha informado a participar en la metástasis de varios tipos de cáncer [15-17]. Esto sugiere un posible bucle autocrino /paracrino que implica CCL22 y CCR4 entre diferentes tipos de células
.
MMP-2 y MMP-9 son las MMPs más afectados y bien caracterizados con fuerte actividad proteolítica de la matriz extracelular (ECM). La coherencia entre las pruebas en tiempo real de RT-PCR y los experimentos de zimografía de gelatina demostró claramente que la sobre expresión de CCR4 en células de cáncer gástrico aumentó significativamente MMP-9 expresión y actividad. Estos experimentos indicaron acentuarse aún más su papel real en la invasión tumoral en determinadas condiciones, con o sin estimulación por CCL22 exógeno. Se cree que la matriz MMP-9 degrada colágeno tipo IV, que es un constituyente principal de la membrana basal y se relaciona con la invasión de células del cáncer y la metástasis en pacientes con cáncer gástrico [34]. Aquí, proporcionamos nuevas pistas sobre el mecanismo subyacente que CCR4 podría promover la invasión de células de cáncer gástrico mediante la regulación al alza de la MMP-9. Observaciones similares también se han hecho con respecto a la invasión del tumor a través de algunos receptores de quimioquinas, tales como CXCR4 y CCR7 [19, 20, 22]. Y también se informó de MMP-2, la estructura de la cual era similar a MMP-9, que se asocia con el cáncer gástrico [35]. Sin embargo, encontramos MMP-9, pero no MMP-2, era una molécula clave implicada en la invasión tumoral mediada CCR4, que puede ser debido a diferentes co-reguladores que interactúan con CCR4 en diferentes microambientes. Aunque MMP-2 expresión en células de cáncer gástrico CCR4 transfectadas también parecía ser más alta que la de las células transfectadas de manera simulada, la diferencia fue estadísticamente insignificante (datos no mostrados). ensayo de viabilidad celular mostró que la sobreexpresión de CCR4 no tuvo efecto sobre el crecimiento celular de cáncer gástrico
in vitro
, que era consistente con estudios anteriores que mostraron los ligandos CCR4 no pudo inducir la proliferación celular [14], evitando así la posible que puedan afectar a la invasión índice o la cantidad de MMP-9. Estos ensayos se realizaron con o sin CCL22 exógeno, con diferencias significativas en la expresión de MMP-9 entre CCR4 y las células transfectadas falsamente. Especulamos los posibles mecanismos de una mayor expresión de MMP-9-CCR4 por la sobreexpresión podría deberse en parte a la expresión autocrina o paracrina de CCL22
in vivo
. Todavía otras MMP que pudieran estar implicados en este proceso y se mantuvieron las vías de señalización precisas que debe profundizarse en el futuro
En conclusión., Se informó por primera vez que era aberrante CCR4 sobre-expresado en el cáncer gástrico pN0 y podría promover la invasión tumoral. Además, nuestros datos indican que CCR4 inducida por la producción de MMP-9 podría ser la base de al menos parcialmente el nuevo mecanismo de invasión tumoral mediada CCR4. Por lo tanto, los antagonistas de CCR4 podrían ser candidatos útiles para controlar los eventos tempranos en la progresión tumoral.
Apoyo a la Información
S1 Fig. La sobreexpresión de CCR4 no tuvo ningún efecto sobre el crecimiento de células de cáncer gástrico
in vitro
.
Después de la transfección con el plásmido CCR4 o simuladas y con o sin estimulación exógena CCL22, células SGC-7901 y BGC-823 fueron resembrado en placa de 96 pocillos. La viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo CCK8 en los puntos de tiempo indicados
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