Extracto
Las células tumorales progenitoras representan una población de células resistentes a los medicamentos que pueden sobrevivir a la quimioterapia convencional y conducir a la recaída del tumor. Sin embargo, poco se sabe del papel de los progenitores en la metástasis de tumores de cáncer de próstata. Los estudios presentados en este documento muestran que el eje CXCR4 /CXCL12, un regulador clave de la diseminación del tumor, juega un papel en el mantenimiento de las células madre, como el cáncer de próstata. La vía CXCL4 /CXCR12 se activa en el CD44 población de progenitores
+ /CD133
+ de próstata y afecta potencial de diferenciación, la adhesión celular, el crecimiento clonal y tumorigenicidad. Además, los estudios de xenoinjerto de tumor de próstata en ratones mostraron que una combinación de la AMD3100 CXCR4 antagonista de los receptores, que se dirige a las células madre, como el cáncer de próstata, y el fármaco quimioterapéutico convencional Taxotere, que se dirige al tumor mayor, es significativamente más eficaz en la erradicación de tumores en comparación a la monoterapia
Visto:. Dubrovska a, Elliott J, Salamone RJ, Telegeev GD, Stakhovsky AE, Schepotin IB, et al. (2012) La expresión de CXCR4 en células de cáncer de próstata progenitoras. PLoS ONE 7 (2): e31226. doi: 10.1371 /journal.pone.0031226
Editor: Diane Renee Bielenberg, el Hospital de Niños & amp; Escuela de Medicina de Harvard, Estados Unidos de América
Recibido: 30 Agosto, 2011; Aceptado: January 4, 2012; Publicado: 16 de febrero 2012
Derechos de Autor © 2012 Dubrovska et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyada por Susan G. Komen para la Cura de Grant PDF0707903 (AD). Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Investigación Novartis y el Instituto Skaggs de Biología Química. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
los cánceres de próstata son la segunda causa más común de muerte por cáncer en los hombres. La mayoría de los cánceres de próstata son dependientes de hormonas y responden a la terapia de ablación de andrógenos. Sin embargo, la terapia de ablación no es curativa para los cánceres de próstata metastáticos, ya que estos tumores eventualmente se convierten en refractario a hormonas y crecen a pesar de la ablación de andrógenos, a pesar de que el tratamiento inicial exitoso apareció [1], [2]. regímenes de quimioterapia que incluyen el fármaco docetaxel (Taxotere) extienden la supervivencia media de dos a tres meses en los pacientes con cáncer de próstata avanzado que ya no responde a la terapia hormonal. Sin embargo, con una tasa de supervivencia a los 5 años del 17% de los pacientes y un período de supervivencia media de 2-3 años, el pronóstico de los pacientes con cáncer de próstata metastásico sigue siendo pobre [3].
Se ha argumentado que la progenitora del tumor células juegan un papel crucial en el desarrollo de tumores y representan una población de células resistentes a los medicamentos que pueden sobrevivir al tratamiento y la enfermedad causa recaída convencional [4]. Esta idea sugiere que las terapias dirigidas a los progenitores tumor puede conducir a tratamientos más eficaces contra el cáncer [5], [6]. Las poblaciones de células que expresan los marcadores de superficie CD133 y CD44 han sido identificados como poblaciones de células madre putativas en la glándula de la próstata [5], [7], [8], [9]. Nosotros y otros han demostrado que CD133
+ /CD44
+ células de líneas celulares de cáncer de próstata establecido también son auto-renovación y multipotentes, y tienen fuerte potencial tumorigénico
in vivo
[5], [ ,,,0],7], [10], [11], [12]. Mientras que las líneas celulares de cáncer de próstata cultivadas bajo condiciones de cultivo monocapa a largo plazo contienen menos de 2% progenitores de cáncer de próstata, esto CD133
+ /CD44
+ población de progenitores cáncer se puede ampliar en condiciones libres de suero independientes de anclaje (formando esfera condiciones) [5], [11]. Esta población de progenitores enriquecido mantiene una mayor capacidad de auto-renovación y tumorigenicidad [5]. análisis de la expresión mRNA reveló que el receptor de quimiocinas CXCR4 es muy upregulated en estas células en comparación con células cultivadas en condiciones de crecimiento monocapa [5]. Se sabe que la activación de la vía de CXCR4 /CXCL12 altera la adhesión, la migración y la invasión de células de cáncer, incluyendo el cáncer de próstata [13], [14], [15]. Sin embargo, se sabe poco sobre el papel de esta vía en el mantenimiento de tumor de próstata iniciar las poblaciones de células. Aquí nos presenta estudios que sugieren el eje /CXCL12 CXCR4 se activa en progenitores de cáncer de próstata y juega un papel en la auto-renovación, potencial de diferenciación, la adhesión celular, y la tumorigenicidad. Por otra parte, los estudios de xenoinjertos de ratón sugieren que la inhibición de la vía de CXCR4 puede ser beneficioso en la focalización de los progenitores de cáncer de próstata
in vivo
.
/CXCR12pathway se activa
Resultados
El CXCL4 en el CD44
+ /CD133
+ de próstata población de progenitores
Varias poblaciones de células madre putativas se han identificado en la próstata y se caracterizan por la CD44 marcadores de superficie celular, CD133, y la integrina α2β1
alta [5], [7], [8], [9], [10], [11], [12]. células de cáncer de próstata que expresan marcadores de superficie celular CD44 y CD133 se pueden enriquecer de líneas celulares de cáncer de próstata por el crecimiento de ellos como esferas en condiciones de medios progenitoras [5]. Nosotros y otros han confirmado que CD133
+ /CD44
+ población celular constituye un subconjunto de células de cáncer de próstata que son auto renovando, diferenciarse en tumores heterogéneos, y son altamente tumorigénicas en ratones inmunodeficientes [5], [ ,,,0],7], [8], [9], [10], [11], [12]. Para identificar las vías de señalización activadas selectivamente en este CD133
+ /CD44
+ población, se realizó un análisis de microarrays de expresión génica en DU145 y PC3 células usando vectores Affymetrix U133 [5]. perfiles de expresión génica mostró que el receptor de quimiocinas CXCR4 es muy upregulated en ambas líneas celulares cultivadas bajo esfera formando en comparación con condiciones de crecimiento monocapa (un aumento de 13 veces y aumento 104,6 veces para células PC3 y DU145, respectivamente) [5]. El alto nivel de expresión de CXCR4 observado en experimentos de microarrays fue confirmada por RT-PCR cuantitativa y análisis de Western blot (Figura 1A)
.
Las células (a) cultivados en condiciones de formación de la esfera mostró un aumento del nivel de expresión de CXCR4 como se analiza por RT-PCR y análisis de transferencia Western. Para la formación de la esfera, las células individuales se sembraron a 500 células /ml en placas de 10 cm con una superficie de fijación ultrabajo y se cultivaron en medio basal epitelial libre de suero durante 7 días. (B) La citometría de flujo análisis mostró enriquecimiento significativo de la CXCR4
+ población dentro de CD44
+ /CD133
+ células en comparación con la población total de células de DU145 y PC3 células (p & lt; 0,001). Las células fueron triples de colores y se analizaron con un flujo BD LSR II citómetro. (C) imágenes fluorescentes representativos de CD133 y CD44 co-inmunotinción muestran que CXCR4 células
+ DU145 y PC3 tienen una mayor proporción de CD44
+ /CD133
+ células en comparación con CXCR4
- células. Las células que expresan alto de los niveles bajos de CXCR4 eran FACS-purificada, se sembraron en 384 claras placas de fondo negro a una densidad de 100 células /pocillo en medio basal epitelial libre de suero. Después de 18 horas, las células se fijaron con 3,7% de formaldehído en PBS y se tiñeron con anticuerpos anti-CD44 anti-CD133 y. Las células en al menos cinco campos seleccionados al azar de vista fueron contados para cada condición. Las flechas muestran las células positivas triples. Las barras de escala indican 15 micras. * - Valor de p & lt; 0,05. (D) La inmunotinción de secciones en parafina de los tumores de xenoinjertos formados por CD44 FACS purificada
+ /CD133
+ y CD44
- /CD133
- células mostraron más del 13% CXCR4
+ Las células en los tumores derivados de CD44
+ /CD133
+ células en comparación con el 2,2% CXCR4
+ células en los tumores de xenoinjertos derivados de CD44
- /CD133
- células. Un total de 10
3 FACS-ordenados DU145 CD133
+ /CD44
+ o CD133
- C.C. se inyectaron células embebidas en BD Matrigel - /CD44
en ratones NOD /SCID. Se permitió que los tumores crecieran durante 42 días hasta que los tumores producidos por DU145 CD133
+ /CD44
+ alcanzaron un tamaño de 400 mm
3 y los tumores producidos por DU145 CD133
- /CD44
- alcanzado un tamaño de 125 mm
3. Las células en al menos cinco campos seleccionados al azar de vista fueron contados para cada condición. Las barras de escala indican 30 micras. (E) CXCR4 inmunotinción de secciones en parafina de los tumores de xenoinjertos hechas por las células cultivadas en la esfera de formación y las condiciones de monocapa mostró más de un 6% CXCR4
+ células en tumores esfera derivados en comparación con el 1,4% de CXCR4
+ células en tumores de xenoinjertos monocapa derivado. ** - Valor de p & lt;. 0.01.Scale barras indican 30 micras
Un creciente cuerpo de evidencia ha demostrado que CXCR4 juega un papel importante en la proliferación del cáncer, la difusión, la invasión y la resistencia a los medicamentos [13], [14], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21], [22]. Sin embargo, se sabe poco sobre el papel de la vía de señalización CXCR4 /CXCL12 en el mantenimiento de progenitores de cáncer de próstata. Para verificar que la expresión de CXCR4 es upregulated en las células del tumor de próstata iniciar, se examinaron los niveles de CXCR4 en CD44
+ /CD133
+ células progenitoras cáncer de próstata y poblaciones de células totales en el DU145 y líneas celulares PC3 por citometría de flujo. Se observó un enriquecimiento 10.3- y 2,3 veces en el porcentaje de CXCR4
+ células CD44 en el
+ /CD133
+ población en comparación con el porcentaje de CXCR4
+ células en la población total de células DU145 y PC3, respectivamente (Figura 1B). En consonancia con esta observación, se purificó en FACS DU145 CXCR4
+ y PC3 CXCR4
+ poblaciones tienen una proporción considerablemente mayor de CD133
+ /CD44
+ células en comparación con el CXCR4
- células ( un aumento de 5,8 veces y 2,8 veces para DU145 y células PC3, respectivamente) (Figura 1C). Este aumento del nivel de expresión de CXCR4 en el CD133
+ /CD44
+ población celular sugiere un papel importante para CXCR4 señalización en el mantenimiento de progenitores de cáncer de próstata.
Para determinar si existe la misma correlación
in vivo
analizamos la expresión de CXCR4 en los tumores de ratones inyectados con CD133
+ /CD44
+ células enriquecidas, así como células cultivadas bajo condiciones de formación de esfera. Ambas poblaciones celulares de próstata han sido previamente demostrado tener una mayor tumorigenicidad [5], [12]. El análisis histológico de xenoinjertos de tumores DU145 derivados de purificado por FACS CD44
+ /CD133
+ células reveló una significativamente mayor CXCR4 población
+ células que en los tumores formados por CD44
- /CD133
- las células (Figura 1D). Del mismo modo, el análisis de la expresión de CXCR4 en los tumores de xenoinjertos de ratones inyectados con las células DU145 cultivadas en condiciones esfera o monocapa mostró que las células que expresan CXCR4 compensar 6,1% de la población total de células en tumores esfera derivados, mientras que los tumores monocapa derivados tienen 1,4% de CXCR4 células positivas (Figura 1E). Por lo tanto, un mayor porcentaje de células que expresan CXCR4 también está asociada con tumores derivados de tanto CD44
+ /CD133
+ células o células cultivadas en condiciones de formación de la esfera.
A continuación, se analizó la relación entre CXCR4 expresión y la capacidad de auto renovación y la tumorigenicidad de las células progenitoras de cáncer de próstata. Ambos FACS ordenados DU145 y PC3 CXCR4
+ poblaciones mostraron un aumento de la esfera y de formación de colonias potencial sobre CXCR4
- células (aumento de 2,3 veces y 3,9 veces, respectivamente) (Figura 2A, B). Del mismo modo, CD44
+ /CD133
+ /CXCR4
+ células tienen mayor potencial spherogenic en comparación con CD44
+ /CD133
+ /CXCR4
- células (Figura 2C). Para evaluar la capacidad de auto-renovación de células CXCR4
+, esferas secundarias fueron generados a partir esferas primarias disociados derivados de PC3 CXCR4
+ CXCR4 y PC3
- células (Figura S1 A). El número de esferas secundarias por 1000 o 500 células fue mayor con esferas derivadas de CXCR4
+ células que de CXCR4
- células (un aumento de 5,5 veces y aumento de 3,2 veces, respectivamente). Para determinar si la activación del eje CXCR4 /CXCL12 estimula la proliferación de los progenitores de cáncer de próstata, PC3 y DU145 células se trataron con CXCL12 en 10 y 100 ng /ml durante 5 días en medio de crecimiento epitelial libre de suero. Como se muestra en la Figura 2D, la activación de la vía de señalización /CXCL12 CXCR4 aumenta significativamente la CD44
+ /CD133
+ población para las dos líneas celulares de cáncer PC3 y de próstata DU145 en una manera dependiente de la dosis (hasta 3,5 veces y aumento de 2,6 veces, respectivamente). Del mismo modo, la sobreexpresión mediada por adenovirus de CXCR4 en las células DU145 resultó en un aumento de más de 2,5 veces de la CD44
+ /CD133
+ población (Figura 2E y la Figura S1B), pero tuvo poco efecto sobre la CD44
- /CD133
- y las poblaciones de células totales. Para caracterizar mejor el potencial de formación de tumores de CXCR4
+ células, 1000 purificado con FACS CXCR4
+ y CXCR4
se inyectaron células -DU145 vía subcutánea en ratones NOD /SCID. CXCR4 fueron encontrados
+ células tener tumorigenicidad significativamente más alto que el CXCR4
- células (un aumento de hasta 3,8 veces en el crecimiento de tumores de xenoinjertos, Figura 2F, Figura S1C). De hecho, el CD44
+ /CD133
+ y CXCR4
+ células exhibieron un potencial tumorigénico similares
in vivo
. Estos resultados indican que la expresión de CXCR4 contribuye a potencial tumorigénico de líneas celulares de cáncer de próstata refractario a los andrógenos.
CXCR4
+ DU145 y PC3 células mostraron un incremento en (A) clonogenicidad y (B) de formación de esfera capacidad durante CXCR4
- células. (C) CD44
+ /CD133
+ /CXCR4
+ DU145 células mostraron un aumento de la capacidad de formación de ámbito comparación con CD44
+ /CD133
+ /CXCR4
- células. Las células se purificaron por FACS y se sembraron en 24 pocillos placa de bajo apego a una densidad de 100 células /pocillo en medio basal epitelial libre de suero y se cultivaron durante 10 días. ** - Valor de p & lt; 0,01. (D) La citometría de flujo análisis mostró que CXCL12 estimula la proliferación de los progenitores de cáncer de próstata en DU145 y líneas de células PC3 de manera dependiente de la dosis. células DU145 y PC3 se cultivaron en, medio EBM libre de suero con suplementos y se trataron con las concentraciones indicadas de CXCL12 se repone al día durante 5 días. (E) La sobreexpresión de CXCR4 en células de cáncer de próstata dio lugar a un aumento de 3 veces de CD44
+ /CD133
+ población. células DU145 se infectaron con adenovirus que codifica CXCR4 bajo el control del sistema regulador tet-off, y con adenovirus de control y se analizaron 4 días después de la infección. la expresión de CXCR4 fue validado por citometría de flujo. (F) CXCR4
+ células poseen propiedades oncogénicas más alta en comparación con CXCR4
- células. 10
3 CXCR4
+, CXCR4
-, CD44
+ /CD133
+ y CD44
- /CD133
- células DU145 recogidos por FACS se incrusta en BD matrigel y se inyectaron sc en ratones NOD /SCID. Cada grupo experimental contenía al menos cinco ratones. Las barras de error representan SEM
Finalmente, determinamos si CXCR4
+ y CXCR4
-. células exhiben potencial de diferenciación clara mediante el análisis de estas poblaciones de células para la expresión de marcadores de linaje de próstata. Estudios previos demostraron que el cáncer de próstata puede provenir de CK5
+ células basales con potencial de diferenciación multilinaje [23], [24]. células DU145 y PC3 se clasificaron en el CXCR4
+ y CXCR
- fracciones y se cultivaron en plástico tratado de cultivo de tejidos en condiciones de diferenciación. Curiosamente, CXCR4
+ poblaciones en DU145 y líneas de células PC3 son más heterogéneas en comparación con CXCR4
- células e incluyen una CK5
+ población de células epiteliales basales, población intermedia de CK5 de tipo basal
+ /CK18
+ células, y CK18
+ población de células epiteliales luminales. Por el contrario, CXCR4
- las células se diferencian para CK5
- /CK18
+ y CK5
+ /CK18
+ células pero no dan lugar a CK5
+ células epiteliales basales ( Figura 3). Este resultado sugiere que el CXCR4
+ población alberga células basales similares más oncogénicas, lo cual es consistente con los hallazgos recientes de que las células epiteliales basales son una célula de origen para el cáncer de próstata [25].
FACS CXCR4 purificado
+ y CXCR4
- células DU145 y PC3 se cultivaron bajo condiciones de diferenciación en presencia de FBS.CXCR4
10% + células diferenciar toCK5
+ células epiteliales basales (10,7%), CK5
+ /CK18
+ células intermedias (32,2%), y CK18
+ células epiteliales luminales (57,1%). Por el contrario, CXCR4
- las células se diferencian para CK18
+ células (91,9% de la población total de células) y CK5
+ /CK18
+ células (8% de la población total de células), pero epitelial no basales Células. Las barras de escala indican 15 micras.
CXCR4 vía /CXCL12 regula las células de cáncer de próstata a través de una vía PI3K /AKT /FOXO3A retroalimentación depende de bucle
Recientemente hemos demostrado que la activación de la vía PI3K /AKT es importante para el cáncer de próstata progenitora auto-renovación y tumorigenicidad [5], [12]. Por otra parte, un estudio previo demostró que la interacción /CXCL12 CXCR4 activa PI3K señalización /AKT en las células del cáncer de próstata [26]. Por lo tanto CXCR4 puede contribuir al mantenimiento de progenitores de cáncer de próstata a través de la activación del eje PI3K /AKT. PI3K señalización /AKT regula la transcripción a través de la familia forkhead de factores de transcripción (FOXO) por fosforilación de residuos de serina /treonina conservadas. Transcripcionalmente activos Foxos afectan a una amplia gama de procesos biológicos, incluyendo la supervivencia celular, la reparación del ADN, la respuesta al estrés oxidativo, y la longevidad [27]. Entre los miembros de la familia FOXO, FOXO3A ha demostrado ser importante para el mantenimiento de neural, hematopoyético y las células madre endoteliales [28], [29], [30], y las poblaciones de células madre, como el cáncer de próstata [5] , [12]. En concordancia con los experimentos anteriores que mostraron que la expresión de genes FOXO3a dependientes se inhibe en el CD44
+ /CD133
+ progenitores de cáncer de próstata en comparación con CD44
- /CD133
- células [5], se encontró que la FACS purificado CXCR4
población + células PC3 mostró disminución de los niveles de expresión de FOXO3A genes de respuesta tales como p21, GADD45, p130, Bim1, y Ciclismo2 comparación con CXCR4
- las células, lo que sugiere que el aumento de expresión de CXCR4 se asocia con PI3K la activación (figura 4A). El tratamiento de células de cáncer de próstata con CXCL12 a una concentración de 100 ng /ml inducida por la activación de la vía PI3K /AKT (hasta 1,5 a 2,0 veces de incremento en la fosforilación de AKT en las células PC3 y DU145, respectivamente) (Figura 4B), además de el aumento de la CD44
+ /CD133
+ población para las dos células PC3 y DU145 (Figura 2D). A la inversa, la inhibición de PI3K abolió por completo el efecto de CXCL12 en la proliferación de CD44
+ /CD133
+ progenitores (Figura 4C), y redujo el nivel de expresión de CXCR4 en tanto DU145 y células PC3
in vitro Opiniones y
in vivo gratis (Figura 4D, e).
células
(a) Aislados CXCR4
+ PC3 mostraron disminución de los niveles de expresión de genes de respuesta FOXO3A tales como p21, GADD45, p130, Bim1, Ciclismo2 en comparación con CXCR4
-PC3 células. los niveles de ARNm se determinaron mediante RT-PCR cuantitativa y normalizado para GAPDH ARNm. (B) El tratamiento de células de cáncer de próstata con la activación CXCL12 inducida de la vía PI3K /AKT. células DU145 y PC3 se cultivaron en, medio libre de suero EBM con suplementos y se trataron con las concentraciones indicadas de CXCL12 y NVP-BEZ235 durante 18 horas. (C) proliferativa efecto de la señalización /CXCL12 CXCR4 en CD44
+ /CD133
+ progenitores podría ser completamente abolida por la inhibición de PI3K. células DU145 y PC3 se cultivaron en, medio libre de suero EBM con suplementos y se trataron con las concentraciones indicadas de CXCL12 y NVP-BEZ235 reponían a diario durante 5 días. (D) Tratamiento de DU145 y células PC3 con inhibidores de PI3K LY294002 y NVP-BEZ235 redujo el nivel de CXCR4. inhibición (E) PI3K disminuye la expresión de CXCR4
in vivo
. Se inyectaron células DU145 por vía subcutánea en ratones NOD /SCID. Cuando los tumores habían crecido hasta un tamaño de 300 mm
3, los ratones fueron tratados con NVP-BEZ235 (12,5 mg /kg administrados por vía oral todos los días) o con vehículo durante 5 semanas. El análisis histológico de las secciones embebidas en parafina demuestra la reducción de la expresión de CXCR4 en los tumores de xenoinjertos tratados con el inhibidor de PI3K. Las barras de escala indican 15 micras. células DU 145 (F) transfectadas de forma estable con FOXO3A-GFP han disminución de la expresión de CXCR4. El análisis de transferencia Western muestra endógeno y proteínas de fusión FOXO3A sobreexpresados (flechas). ensayo (G) ChIP demuestra que FOXO3A se une al promotor CXCR4. células DU145 y PC3 se transfectaron de forma estable ya sea con GFP o FOXO3A-GFP como se describe [17]. Las células fueron reticuladas con formaldehído y la cromatina se inmunoprecipitó con anticuerpo /FKHRL1 anti-FOXO3A. El promotor CXCR4 genómico reticulado fue detectado por PCR. FOXO3a gen regulado eNOS se utilizó como control positivo. La cantidad de promotor FOXO3A-CXCR4 precipitado se aumenta en las células DU145 transfectadas de forma estable con la proteína FOXO3A-GFP.
También observó una disminución en los niveles de proteína CXCR4 en respuesta a la sobreexpresión FOXO3A en células DU145 (Figura 4F ) lo que sugiere que podría FOXO3A regular los niveles de CXCR4 directamente a través de la regulación transcripcional CXCR4 o indirectamente a través de un gen diana FOXO3A diferente. Inspección del promotor CXCR4 [31] reveló una supuesta secuencia de unión FOXO GCAAACA [32] a partir de las posiciones -187 a -181. Con el fin de confirmar que FOXO3A se une al promotor CXCR4, se realizó un ensayo de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP). La cantidad de promotor CXCR4 precipitado se incrementó en células DU 145 transfectadas de forma estable con la proteína FOXO3A-GFP (Figura 4G) que demuestran que FOXO3A se une al promotor CXCR4. Estos datos muestran una relación entre la activación de PI3K /AKT señalización, la expresión de CXCR4 y la capacidad de auto renovación y tumorigenicidad de CD44
+ /CD133
+ células progenitoras cáncer de próstata.
CXCR4 regula la adhesión de células progenitoras tumor
el papel de CXCR4 en la progresión del cáncer en general, se ha analizado en el contexto de la metástasis de las células del cáncer [19], [20], [21], [22], [33]. A nivel molecular, CXCR4 es un importante mediador de la interacción de las células de tumor de próstata con proteínas de la matriz extracelular tales como laminina, fibronectina y colágeno que contribuye al proceso metastásico [14], [34], [35]. A pesar de que CXCR4 no modula directamente la unión celular, el acoplamiento del receptor CXCR4 por CXCL12 desempeña un papel esencial en el manejo de la adhesión celular por la modulación de la expresión de integrina, la fosforilación de FAK, y la activación de MAPK p38 y las quinasas ROCA [34], [36]. Para examinar el papel de CXCR4 en la adhesión celular y la migración de las células iniciadoras de tumores de próstata, se compararon FACS CD44
+ /CD133
+ /CXCR4
+ células con otras poblaciones en los ensayos de adhesión celular. Hemos encontrado que CD44
+ /CD133
+ /CXCR4
+ células tienen significativamente mayor adherencia CXCL12 dependiente de fibronectina de CD44
+ /CD133
+ /CXCR4
- o CD44
- /CD133
- /CXCR4
- las poblaciones de células (Figura 5A). La adhesión CXCL12 inducida de las células de cáncer de próstata a la matriz extracelular está mediada por integrinas. Curiosamente, los niveles de expresión de α2, α5, y β3 integrina subunidades están fuertemente regulados por incremento en CD133
+ /CD44
+ DU145 frente a CD133
- /CD44
- DU145 células (Figura 5B), consistentes con estudios recientes que muestran que la activación de la vía /CXCL12 CXCR4 en las células DU145 conduce a una mayor expresión de α5 y las integrinas beta 3 [14]. Además, la inactivación de la vía PI3K con NVP-BEZ235 (200 nM) disminuyó significativamente la adhesión CXCR4 dependiente de CD133
+ /CD44
+ DU145 células a la fibronectina, y esta inhibición podría ser abolida en presencia de 200 ng /ml CXCL12 (Figura 5C). Sorprendentemente, la adhesión de CD133
- /CD44
- células DU145 no respondieron al tratamiento o CXCL12 señalización PI3K inhibición (Figura 5C). En conjunto, estos estudios sugieren que la expresión de CXCR4 podría proporcionar una ventaja selectiva para la interacción con la matriz extracelular y facilitan preinvasora unión de las células progenitoras del tumor que permitan una mayor diseminación tumoral.
(A) DU145 CD44
+ /CD133
+ /CXCR4
+ células tienen significativamente mayor adherencia CXCL12 dependiente de fibronectina de CD44
+ /CD133
+ /CXCR4
- o CD44
- /CD133
- /CXCR4
- las poblaciones de células. Las células fueron FACS ordenados y se sembraron en placas recubiertas de fibronectina y se dejaron adherir durante 1 h. Se contaron las células en tres pocillos por condición utilizando un microscopio de contraste de fase * - p valor. & Lt; 0,05. (B) El nivel de expresión de α2, α5, e integrinas subunidades beta 3 está fuertemente aumentada en CD133
+ /CD44
+ DU45 en comparación con CD133
- /CD44
- células DU45. (C) La inactivación de la vía PI3K con NVP-BEZ235 disminuye significativamente la adhesión CXCR4 dependiente de CD133
+ /CD44
+ DU45 células a la fibronectina. La adhesión de CD133
+ /CD44
+ DU45 células podría ser restaurado en presencia de CXCL12. La adhesión de CD133
- /CD44
- DU45 no respondió a la modulación de señalización CXCR4 y PI3K, * Valor de p. & Lt; 0,05
La inhibición de la vía de CXCR4 conduce a una disminución de las poblaciones progenitoras de cáncer de próstata
para proporcionar evidencia adicional de que la señalización /CXCL12 CXCR4 es importante para el mantenimiento de células madre similares y la orientación de esta vía puede conducir a la inhibición del crecimiento de células progenitoras del cáncer de próstata, hemos probado si la inactivación de el eje /CXCL12 CXCR4 por un anticuerpo neutralizante afecta a los progenitores de cáncer de próstata
in vitro Opiniones y
in vivo
. células DU145 se trataron con 10 mg /ml de neutralización-CXCR4 contra (IgG de ratón monoclonal, clon 44716, R & amp; D Systems) o anticuerpo de control (control de IgG de ratón de isotipo, vida útil Bioscience Inc.) durante 5 días en medio de crecimiento epitelial libre de suero y se midió la capacidad de formación esfera. El tratamiento con anticuerpo anti-CXCR4 conduce a una disminución de 2,2 veces en la esfera capacidad en las células DU145 en comparación con las células tratadas con anticuerpo de control (Figura 6A) que forma. Además, la citometría de flujo El análisis reveló una disminución de más de 2 veces en el CD44
+ /CD133
+ población en células DU145 tratadas previamente con anticuerpo anti-CXCR4 (Figura 6B), así como la inhibición de la señalización de PI3K /AKT1 vía (Figura 6C). La preincubación de las células DU145 con anticuerpo anti-CXCR4 antes de la inyección subcutánea en ratones NOD /SCID retrasó significativamente el crecimiento del tumor (Figura 6D), en comparación con las células tratadas con el anticuerpo de control.
células DU145 (A) se sembraron en 96- y placas de fijación bajo en 100 células por pocillo (5 repeticiones) y las esferas se hicieron crecer en, medio libre de suero EBM con suplementos. Los anticuerpos se repone diariamente. Las celdas eran imágenes con una microplaca Acumen EX3 citómetro y esferas fueron detectados utilizando el software de análisis de imágenes. El tamaño de la esfera se midió mediante la intensidad de GFP. Las esferas fueron discriminados de los restos celulares mediante un filtro de Gauss. Las esferas incluidas en el análisis se resumen en rojo y indican con flechas. Los datos representativos de uno de dos experimentos independientes se muestran; * - Valor de p & lt; 0,05. (B) La citometría de flujo análisis reveló atenuación de CD44
+ /CD133
+ población de células DU145 tratado con 10 mg /ml de neutralización contra CXCR4 (IgG monoclonal de ratón, clon 44716, I + amp; D Systems) mg o 10 /ml de anticuerpo de control (control de isotipo IgG de ratón, vida útil Bioscience Inc.) durante 5 días. La célula se cultivaron en medio suplementado con 2% de FBS. El medio de cultivo se renovó cada dos días; * - Valor de p & lt; 0,05. (C) Análisis de transferencia Western de las células DU145 tratadas con 10 mg /ml de anticuerpos neutralizantes anti-CXCR4 durante 5 días regulación a la baja de la activación de la vía PI3K /AKT en comparación con las células tratadas con 10 mg /ml de anticuerpo controlar demostradas. La célula se cultivaron en medio suplementado con 2% de FBS. El medio de cultivo se renovó cada dos días. (D) La preincubación de las células de cáncer de próstata con anticuerpos neutralizantes anti-CXCR4 retrasa significativamente el crecimiento del tumor. 5 × 10
5 DU145 células pretratadas con la neutralización de anti-CXCR4 o el control de anticuerpos durante 5 días fueron incorporados en BD Matrigel y se inyecta por vía subcutánea . En ratones NOD /SCID * - Valor de p. & Lt; 0,01
A continuación, prueba los efectos de la AMD3100 pequeña molécula antagonista de CXCR4-específica sobre la supervivencia de la población de progenitores (CD44
+ /CD133
+) en líneas celulares de cáncer de próstata. células PC3 se trataron con 0,5 mM AMD3100 o con 75 mM del fármaco 5-fluorouracilo quimioterapéutico convencional para 4 días en medio de crecimiento epitelial libre de suero. Citometría de flujo El análisis reveló una disminución de 2,2 veces en el CD44
+ /CD133
+ población con el tratamiento AMD3100 (Figura 7A y la Figura S2A), mientras que esta población se incrementó hasta 2,1 veces en respuesta a la terapia convencional. En contraste, el CD44
- /CD133
- población fue sensible a la quimioterapia convencional que muestra una disminución de 2,1 veces, pero no respondía al tratamiento AMD3100. Además, la combinación de AMD3100 y el fármaco quimioterapéutico resultó en una disminución simultánea de CD44
+ /CD133
+ y CD44
- /CD133
- poblaciones de células (≥1.8 veces disminución y 1.7 -fold disminuir respectivamente)
(A) el tratamiento con antagonista de CXCR4 AMD3100 disminuye el CD133
+ /CD44
+ población, pero no afectó significativamente el CD133
-. /CD44
- población dentro de las células del cáncer de próstata. El uso de fármacos citotóxicos resultados solo en una disminución en la proliferación de células tumorales, sino que conduce a un aumento general de la población relativa de las células iniciadoras de tumores. tratamiento combinatorio de células PC3 con AMD3100 y el fármaco quimioterapéutico convencional 5-fluoracilo disminuye las poblaciones de células indiferenciadas y diferenciadas tanto. células PC3 se cultivaron en, medio libre de suero EBM con suplementos y se trataron con las concentraciones indicadas de AMD3100 y 5-fluoracilo. En la 5
TH días las células se sometieron a análisis de citometría de flujo; * Valor de p & lt; 0,05. (B) La terapia combinatoria
in vivo
demuestra una inhibición significativa del crecimiento del tumor en comparación con el tratamiento solo medicamento. Los ratones fueron tratados con Taxotere (20 mg /kg, 1q.w., p.o.) como se describe (19). Alzet bombas se utilizan para entregar AMD3100 a una velocidad constante de 0,25 g /kg /hora. Las bombas cargadas con AMD3100 o solución salina se implantaron subcutáneamente. Los ratones se observaron durante 8 semanas para aparición y desarrollo de tumores. (C) CD133 y CD44 inmunotinción de secciones congeladas de tumores de xenoinjertos tratados con combinatoria o mono-terapia a partir de (B) reveló la inhibición selectiva de la CD133
+ /CD44
+ población por el AMD3100 antagonista de CXCR4; * Valor de p & lt; 0,05. (D) Análisis de transferencia Western mostró una disminución significativa en la fosforilación FOXO3A en los tumores tratados con AMD3100.
La terapia de combinación dirigirse a las células tumorales progenitoras y a granel conduce a la regresión del tumor mejorada
Para determinar