Extracto
Antecedentes
El carcinoma de células renales de células claras (ccRCC) es el la mayoría del tipo común de cáncer renal. Uno de los procesos alterados en este tipo de cáncer es el empalme alternativo, aunque siguen siendo desconocidos los fenómenos que subyacen a estas perturbaciones. Splicing alternativo consiste en la eliminación selectiva de los intrones y la unión de los exones residuales de la transcripción primaria, para producir moléculas de ARNm de diferente secuencia. aberraciones de empalme pueden conducir a la transformación tumoral debido a la síntesis de la alteración de las variantes de empalme con potencial oncogénico. En este trabajo la hipótesis de que perturba splicing alternativo en ccRCC puede ser el resultado de la expresión inadecuada de los factores de empalme, mediadores de reacciones de empalme.
Metodología /Principales conclusiones
El uso de PCR en tiempo real y Western-blot El análisis analizamos la expresión de los siete factores de empalme que pertenecen a la familia de proteínas SR (SF2 /ASF, SC35, SRp20, SRp75, SRp40, SRp55 y 9G8), y uno de los factores no-SR, hnRNP A1 (heterogénea nuclear ribonucleoprotein A1) en 38 pares de muestras ccRCC de control de tumor. Por otra parte, se analizaron los patrones de empalme de cinco genes implicados en la carcinogénesis y parcialmente regulados por factores de empalme analizados:. RON, CEACAM1, Rac1, caspasa-9, y GLI1
Conclusiones /Importancia
Hemos encontrado que la expresión de ARNm de los factores de empalme fue perturbado en los tumores en comparación con controles apareados, de manera similar como los niveles de SF2 /ASF y las proteínas hnRNP A1. Los coeficientes de correlación entre los niveles de expresión de factores de empalme específicos se aumentaron en muestras de tumores. Por otra parte, corte y empalme alternativo de cinco genes analizados también fue perturbado en ccRCC muestras y empalme patrón de dos de ellos, caspasa-9 y CEACAM1 correlacionada con la expresión de SF2 /ASF en los tumores. Llegamos a la conclusión de que la expresión alterada de los factores de empalme en ccRCC, posiblemente, puede conducir a la alteración de splicing alternativo de los genes que regulan el crecimiento del tumor y de esta manera contribuyen al proceso de la carcinogénesis
Visto:. Piekiełko-Witkowska A, Wiszomirska H, A Wojcicka , Poplawski P, Boguslawska J, Tanski Z, et al. (2010) Expresión de Disturbed factores de empalme en el cáncer renal afecta a splicing alternativo de reguladores de la apoptosis, oncogenes y supresores de tumor,. PLoS ONE 5 (10): e13690. doi: 10.1371 /journal.pone.0013690
Editor: Juan Valcárcel, Centro de Regulación Genómica, España |
Recibido: 30 de junio de 2010; Aceptado: 7 Octubre de 2010; Publicado: 27 Octubre 2010
Derechos de Autor © 2010 Piekiełko-Witkowska et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El trabajo fue apoyado por: el Comité de Estado polaco de Investigaciones Científicas Becas NN401354733 (a APW) y NN401073636 (AN), y el Centro Médico de Posgrado Educación otorgan 501-2-25-01 /09 (a APW). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el carcinoma de células renales (CCR) es la lesión sólida más común del riñón y representa ~ 3% de todos los tumores malignos humanos. Cada año en Europa alrededor de 40 000 nuevos casos de CCR son diagnosticados y aproximadamente 20 000 pacientes mueren de la enfermedad [1]. La gran mayoría (80%) de los casos de CCR histológicamente se clasifica como células claras carcinomas renales de células (ccRCC), originarios de los túbulos proximales del riñón. La base molecular de ccRCC no se entiende completamente. Aunque se han propuesto varios marcadores moleculares, ninguno de ellos ha sido aprobado para uso clínico rutinario [2].
Uno de los procesos celulares, a menudo perturbados en los cánceres, es splicing alternativo, el proceso de eliminación selectiva de los intrones y la unión de los exones residuales, en el que se producen las moléculas de ARNm de diversas secuencias. splicing alternativo aberrante puede conducir a la transformación tumoral [3]. splicing alternativo alterada de varios genes también se detectó en ccRCC. Por ejemplo, en nuestro trabajo anterior encontramos la expresión desequilibrada ccRCC-específica de las variantes de corte y empalme de tipo 1 iodothyroine deiodinasa (ESD1) [4], [5] y las regiones no traducidas del receptor de hormona tiroidea TRβ1 [6]. Varios otros informes que muestran alteraciones ccRCC específicos de splicing alternativo incluyen alteraciones en el procesamiento del mRNA de MCL-1 [7], TCF-4 [8], survivin [9], y OGG1 [10]. Anormalmente variantes empalmadas de los genes descritos anteriormente son raramente efectos de las mutaciones en los genes que codifican las transcripciones longitudinalmente y las fuentes de perturbaciones en el splicing alternativo son generalmente desconocida.
El empalme alternativo es un proceso complicado, que implica un número importante de proteínas que incluye factores de empalme denominadas proteínas ricas en serina-arginina (AR proteínas) [11]. La familia de proteínas SR consiste en al menos veinte miembros de los cuales siete: SF2 /ASF (codificada por el gen: SFRS1), SC35 (gen: SFRS2), SRp20 (gen: SFRS3), SRp75 (gen: SFRS4), SRp40 (gen : SFRS5), SRp55 (SFRS6), y 9G8 (SFRS7) constituyen el grupo de las proteínas SR "clásicos". Estos factores se unen a secuencias llamadas potenciadores de corte y empalme, que se encuentra en los exones (ESES, potenciadores de empalme exonic) o en intrones (ISEs, potenciadores de empalme intrónicas). La unión de las proteínas SR de empalme potenciadores promueve la inclusión del exón. La reacción de empalme también está regulada por un gran número de factores no-SR, tales como hnRNPs (ribonucleoproteínas nucleares heterogéneas) que se unen principalmente a las secuencias de empalme silenciadores y actúan como represores de empalme [12]. Por lo tanto, el resultado final de splicing alternativo es un efecto de la acción de concierto antagónicamente actuando factores de empalme. Un par de factores de empalme que exhiben actividades opuestas es SF2 /ASF (una proteína SR) y hnRNP A1 (heterogénea nuclear ribonucleoprotein A1; una proteína no-SR) [13]. El exceso de SF2 /ASF promueve "la selección del sitio de empalme, mientras que de hnRNP A1 favorece distal 5 'del sitio de empalme 5 proximal. miembros específicos de la familia SR también pueden actuar de forma antagonista (por ejemplo SF2 /ASF y SRp20 [14], o SF2 /ASF y SC35 [15]). Por lo tanto, los niveles relativos de los factores de corte y empalme específicos contribuyen a la regulación del splicing alternativo, específico para el tipo de tejido y la etapa de desarrollo.
Se sabe que las alteraciones en corte y empalme alternativo pueden contribuir a la carcinogénesis debido a la producción de tumor supresor o oncogénico variantes de la transcripción de genes, la proliferación que afecta, la motilidad celular y la apoptosis susceptibilidad [16]. transcripción variantes de corte y empalme incorrectamente también pueden servir como biomarcadores tumorales [17]. El creciente cuerpo de evidencia sugiere que los factores de empalme pueden estar involucrados directamente en el proceso de la carcinogénesis, en calidad de proto-oncogenes [18] o la regulación de empalme y la actividad de los proto-oncogenes [19], los supresores de tumores [18] y reguladores de la apoptosis [20 ]. perturbado expresión de factores de empalme se informó en varios tipos de cáncer [11]. En nuestro trabajo reciente se demostró que la expresión de dos factores de empalme, SF2 /ASF y hnRNP A1 se descompone en ccRCC [4], pero a nuestro conocimiento la expresión de factores de empalme como grupo nunca había sido analizada en ccRCC.
en este trabajo la hipótesis de que las alteraciones observadas de splicing alternativo en ccRCC pueden ser una consecuencia de los cambios en la expresión de factores de empalme, en particular, de las aberraciones de las relaciones cuantitativas entre ellos. Para hacer frente a este problema, analizamos la expresión de los siete factores de empalme clásicos: SF2 /ASF, SC35, SRp20, SRp75, SRp40, SRp55, 9G8 y un factor de no-SR, hnRNP A1. Además, para investigar las consecuencias de la expresión alterada de los factores de empalme, se analizaron existencia y la expresión de las transcripciones de cinco genes implicados en la tumorigénesis, que se sabe que están empalmados alternativamente y parcialmente reguladas por los factores de empalme analizados. Hemos encontrado que la expresión de factores de empalme, así como corte y empalme alternativo de los genes analizados fueron perturbados en la mayoría de las muestras de tejido analizadas. Llegamos a la conclusión de que la expresión alterada de los factores de empalme en ccRCC, posiblemente, puede conducir a la alteración de splicing alternativo de los genes que regulan el crecimiento del tumor y, por tanto, contribuir al proceso de la carcinogénesis.
Materiales y Métodos
las muestras de tejido se obtuvieron de nefrectomías unilaterales realizadas en pacientes con cáncer de células renales de células claras (38 pacientes) con la autorización del Comité ético de los Estudios Humanos (el Centro Médico de Postgrado de Educación). Las muestras se dividieron en dos grupos: los tejidos de cáncer (n = 38, T) y los tejidos de control (tejido normal emparejado desde el polo opuesto de la malignos de riñón sin evidencia histológica de tumor; n = 38, C). Claro celular de cáncer de células renales fue diagnosticado por la histología de acuerdo a criterios de la OMS [21]. Los tumores se dividen en tres grupos, en función del grado de diferenciación:. G1 (bien diferenciadas), G2 (grado intermedio de diferenciación), G3 (pobremente diferenciadas cánceres)
aislamiento de ARN
Total el ARN celular se aisló de aproximadamente 100 mg de tejido congelado usando GeneMATRIX universal ARN kit de purificación (EURX, Gdansk, Polonia), de acuerdo con el protocolo del fabricante.
transcripción reversa
600 ng de ARN total fue transcrito inversa usando RevertAidTM H Minus Kit de Síntesis de la primera cadena de ADNc (Fermentas, Vilnius, Lituania) y oligo-dT cebadores de acuerdo con el protocolo del fabricante. Para la posterior análisis de PCR se utilizó 1 ul de cDNA. Por tiempo real las reacciones de PCR se tomó 1 l de 5x cDNA diluido.
análisis de PCR de splicing alternativo
reacción de PCR se realizó en 1 l de 5x ADNc diluida utilizando perpetuo OptiTaq ADN polimerasa HOT START ( EURX, Gdansk, Polonia) en condiciones de 95 ° C, 10 min. (Desnaturalización inicial), seguido de 35 ciclos: [95 ° C, 30 s; 58 ° C, 30 s; 72 ° C, 30 s], elongación final: 61 ° C, 10 min. Las secuencias de los primers específicos (Tabla S1) se tomaron de los informes publicados anteriormente para: RON [19], la caspasa-9 [22], CEACAM-1 [23], Rac1 [24], y GLI1 [25]. Los productos de PCR se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 1.2% teñido con bromuro de etidio.
-PCR en tiempo real
semi-cuantitativa en tiempo real PCR se realizó utilizando ADN LightCycler® 480 SYBR Green I master (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania), por triplicado, de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las secuencias de los cebadores se muestran en la Tabla S2. Condiciones para la PCR en tiempo real fueron las siguientes: desnaturalización inicial: 95 ° C, 10 min, 45 ciclos:. (95ºC, 15 s, 57 ° C, 15 s; 72ºC, 15 s); seguido por la fusión de análisis de la curva: (95 ° C, 5 min; 65 ° C, 1 min; lectura continua de la fluorescencia de 65 ° C a 97 ° C con 0,11 ° C /s velocidad de rampa y 5 adquisiciones por cada ° C). Los resultados se normalizaron a la expresión del gen 18sRNA huésped-
RN18S1
. La estabilidad de la expresión de 18sRNA fue validado y se confirmó en pre-análisis inicial de 32 pares de muestras de control y de tumores en comparación con la expresión ACTB (Figura S1). Los cebadores ACTB se publicaron en otra parte [6].
extracción de proteínas y análisis de transferencia de Western
Para el análisis Western, se tomaron doce pares representativos de muestras de tumor y de control. Las muestras de tejido se homogeneizaron en un tampón que contenía NaCl 150 mM, 1% de Triton X-100, Tris-HCl pH 8,0, cóctel inhibidor de proteasa (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO), y 0,5 mM PMSF 50. El homogeneizado se incubó con agitación durante 2 horas a 4 ° C y se centrifugó a 12.000 rpm durante 20 min, a 4 ° C. El sobrenadante obtenido se utilizó para el análisis de la concentración de proteína con Thermo Scientific Pierce ensayo de proteína BCA (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) según el protocolo estándar. Los extractos de proteínas se dividen en 30 ml de alícuotas y se almacenaron a -70 ° C.
Para SF2 /ASF Western Blot, 30 g de extracto de proteína se resolvió en un 10% SDS-PAGE. Después de la electroforesis las proteínas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa que se bloquearon posteriormente durante la noche a 8 ° C en la leche no grasa 5% en tampón TBS-T (10 mM Tris-HCl, NaCl 150 mM, 0,1% de Tween-20; pH 7,6) . Las membranas se lavaron tres veces en TBS-T durante 10 min a RT, y se incubaron durante la noche a 8 ° C con anti-anticuerpo SF2 /ASF diluyeron 1 (cat no .: 32-4500, Invitrogen, Carlsbad, Ca.): 500 en tampón TBS-T con leche no grasa al 5%. Después de lavar 3 veces durante 10 min con TBS-T, las membranas se incubaron durante 1 h a TA con rábano picante de cabra anti-ratón anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa (1:10000, DakoCytomation, Glostrup, Dinamarca), y se lavó 3 veces durante 10 min con TBS-T.
Western Blot de hnRNP A1 se realizó como para el análisis /ASF SF2 utilizando 15 g de extracto de proteína y el anticuerpo anti-hnRNP A1 (cat. no .: ab10685, Abcam plc, Cambridge, Reino Unido).
Las proteínas se detectaron por un sistema de detección de quimioluminiscencia mejorada (SuperSignal West Pico Substrato quimioluminiscente, Pierce Biotechnology, Rockford, IL) de acuerdo con procedimientos estándar. Posteriormente, las membranas fueron despojados, bloquearon y se incubaron con anti-β-actina de anticuerpos (cat. No. Ab6276, Abcam plc, Cambridge, UK) diluido en tampón 1:10000 TBS-T durante 1 h a TA, se lavaron tres veces en tampón TBS-T y procesado adicionalmente como se describe para el procedimiento de SF2 /ASF.
La cantidad de proteína específica se estimó densitométrica después de la normalización de la expresión de β-actina.
Predicción del factor de empalme de unión motivos
Análisis de CEACAM1 secuencia del exón 7 se realizó con el software ESE buscador [26]. Para la predicción de sitios de unión de SF2 /ASF, se utilizaron dos matrices: "SF2 /ASF /IgM-BRCA1" y "SF2 /ASF". Estas dos matrices se obtuvieron en contexto diferente (diferentes minigenes y el tamaño de las bibliotecas de secuencias aleatorias en SELEX [27]). Los umbrales utilizados para la predicción fueron: 1.956 (SF2 /ASF), 1.867 (SF2 /ASF /IgM-BRCA1), 2.383 (SC35), 2.670 (SRp40) y 2.676 (SRp55). La secuencia del exón 7 se derivó de CEACAM1 transcripción variante 1 (Acc. No. NM_001712.3).
El análisis estadístico
Se utilizó la prueba de Shapiro-Wilk para determinar la normalidad de la distribución de datos. Normalmente, los datos distribuidos se analizaron los datos por t-test y no paramétricas apareados por pares de Wilcoxon prueba.
p & lt;
0,05 fue considerado estadísticamente significativo. La visualización de matriz de correlación se realizó utilizando corrplot en la plataforma R [28].
Resultados
La expresión del ARNm de factores de empalme se descompone en al menos la mitad de las muestras ccRCC
Empalme factores que pertenecen al grupo de proteínas SR comprenden un gran número de proteínas relacionadas estructural y funcionalmente [11]. En nuestro estudio nos centramos en el grupo de las proteínas SR "clásicos", es decir, SF2 /ASF (codificada por el gen: SFRS1), SC35 (SFRS2), Sp20 (SFRS3), SRp75 (SFRS4), SRp40 (SFRS5), SRp55 (SFRS6 ) y 9G8 (SFRS7). También hemos analizado la expresión de un factor de empalme no SR, hnRNP A1 que se cree generalmente para actuar como antagonista de las proteínas SR.
El uso de PCR en tiempo real, se encontró que el patrón de expresión de los factores de empalme diferente entre los pacientes individuales, así como entre muestras de control y de tumor de un paciente particular. la expresión de ARNm de todos los factores de empalme analizados fue perturbado en aproximadamente 50 a 60% (en función del factor de empalme analizado) de las muestras tumorales en comparación con tejidos normales emparejados (Fig. 1). Estos cambios de expresión se debían a abajo o de regulación al alza de los genes analizados y permitieron dividir todas las muestras tumorales en tres grupos: D, T, N y en el que se downregulated la expresión de los genes, upregulated o no cambiado, respectivamente. La dirección de los cambios no se correlacionó con el grado del tumor de diferenciación (fig. 1A).
A. Los cambios en la expresión de determinados pares de muestras de control y tumorales. El diagrama se realizó sobre la base de los datos de análisis en tiempo real PCR (Figura S2). Los colores representan ratio de expresión entre las muestras de control y tumorales. Verde: downregulation en muestras de tumores. Red: upregulation en muestras de tumores. Blanco: ninguna diferencia en los niveles de expresión. se muestra de clasificación tumoral (G1, G2, G3). B. Distribución de los cambios en la expresión de ARNm de factores de empalme. D: grupo de muestras con la regulación por disminución específica de tumor de la expresión; U: grupo de muestras con la regulación positiva específica de tumor de la expresión; N: grupo de muestras que no difieren en la expresión entre las muestras de control y tumorales. El umbral de 30% de diferencia en la expresión entre las muestras de control y tumorales se utiliza para clasificar las muestras.
El número de muestras en cada grupo variado de n = 8 para D y n = 14 para U (para hnRNP A1) para n = 17 para D y n = 4 para U (para SRp40) (Fig. 2). Para la mayoría de las muestras con expresión alterada, Grupo D fue la más abundante (34-45% de todas las muestras analizadas). La única excepción fue la expresión de hnRNP A1 que se downregulated en sólo el 21% de las muestras y aumentada en el 37% de todas las muestras analizadas. Regulación a la baja de los genes en las piscinas d varió de 1,9 veces (SRp20) a 2,6 veces (SC35 anuncio SRp75) en comparación con las muestras de control. Los genes en piscinas U se upregulated de 1,4 veces (9G8) a 2,4 veces (SF2 /ASF) en comparación con muestras de control
Expresión de cada factor de empalme se muestra en dos grupos de muestras:. Con downregulation específico de tumor (D) (izquierda) y la regulación positiva (T) (derecha). El umbral de 30% de diferencia en la expresión entre las muestras de control y tumorales se utiliza para clasificar las muestras. C: muestras de control, T: muestras de tumores. Los datos se expresan como media ± S.E .. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba t pareada. * P & lt; 0,05; ** P & lt; 0,01; *** P & lt;. 0.001
las relaciones cuantitativas entre los factores de empalme difieren entre muestras tumorales y control
Con el fin de explorar si los cambios en la expresión de factores de empalme están correlacionados, se analizaron las proporciones entre los niveles de expresión de factores de empalme así como los ratios entre pares específicos de factores de empalme (Fig. 3). Se encontró que el patrón de correlaciones difería entre las muestras de control y tumorales, con tendencia general para el aumento de los coeficientes de correlación en muestras de tumor (Fig. 3A). Se observaron los cambios fuertes de correlación para hnRNP A1. Por ejemplo, no hubo correlación significativa entre hnRNP A1 y SRp20, hnRNP A1 y SRp75, y hnRNP A1 y 9G8 en las muestras de control, mientras que en las muestras de tumor la expresión de estos genes correlacionó significativamente. Además, la correlación entre SF2 /ASF y el residuo seis analiza los factores de empalme fue más fuerte en las muestras tumorales.
A. Matriz que muestra coeficientes de correlación entre la expresión de ARNm de los factores de empalme analizados. La trama se genera en base a Pearson coeficientes de correlación entre los valores de expresión de los factores de empalme. El paciente número 16 fue retirado de análisis debido a la desviación de la distribución normal. Para SC35 (gen: SFRS2) la correlación no paramétrica de Spearman se utilizó como datos no se distribuyen normalmente en este grupo. Los valores de Pearson o Spearman r se dan a continuación el diagrama de puntos. los nombres de genes factores de empalme 'se muestran entre paréntesis. P & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativo. B. mRNA ratios de expresión de los factores de empalme se sabe que actúan antagónicamente. Los datos se expresan como media ± S. E. (Por SF2 /ASF: hnRNP A1 y hnRNP A1: SC35) o como valores medios e IC del 95% (por SC35: SRp55 como datos no se distribuyen normalmente en este grupo). El análisis estadístico se realizó mediante la prueba de t pareada (por SF2 /ASF: hnRNP A1 y hnRNP A1: SC35) o Wilcoxon emparejados prueba (por SC35: SRp55). . N = 37 para C, n = 37 para T, ** p & lt; 0,01
Hay pares de factores de empalme que se sabe que funcionan de forma antagonista [13] - [15], [29] . Por lo tanto, se analizaron las proporciones de los siguientes factores de empalme específicos: SF2 /ASF: hnRNP A1, SF2 /ASF: SRp20, SF2 /ASF: SC35, SRp40: SRp55, SC35: SRp55, y hnRNP A1: SC35. Se encontró que para los tres pares de empalme factores de las proporciones diferían significativamente en muestras de tumores cuando se compara con muestras de control (Fig. 3B). El SF2 /ASF: relación de hnRNP A1 se redujo en muestras de tumores en un 26% (1,07 ± 0,06 S. E. para C vs 0,78 ± 0,06 S. E. para T; p = 0,0022). La relación de SC35: SRp55 se aumentó en las muestras tumorales en aproximadamente un 40% (mediana 1,12, rango de 0,60 a 5,91 para C; mediana de 1,57, rango de 0,59 a 12,29 por T; p = 0,0073). Para una relación de hnRNP A1: SC35 había una pequeña (15,3%) pero estadísticamente significativo aumento en los tumores en comparación con muestras de control (0,77 ± 0,05 SE para C vs 0,89 ± 0,064 SE para T; p = 0,0197)
La expresión de la proteína de SF2 /ASF y hnRNP A1 se descompone en ccRCC
Para comprobar si los cambios en el nivel de ARNm en consecuencia alteraciones concomitantes de la expresión de la proteína se realizó un análisis de transferencia Western de dos factores de empalme, SF2 /ASF y hnRNP A1 sobre doce pares representativos de las muestras de control y de tumor (Fig. 4). De hecho, encontramos diferencias significativas entre los niveles de proteína de factores de empalme en las muestras de control y tumorales. Del mismo modo que en el caso del análisis de mRNA, los cambios fueron variables, pero no se correlacionaron con la expresión de ARNm. En la mayoría de muestras de tejidos emparejados analizamos la expresión de factor de empalme se redujo en T muestras en comparación con las muestras C (SF2 /ASF: 9 pares; hnRNP A1: 8 pares).
se muestran los grados del tumor de diferenciación ( G1, G2, G3). Western blots de SF2 /ASF (A) y hnRNP A1 (B) se utilizaron para el análisis semicuantitativo de las bandas de proteínas después de la normalización de ß-actina. Las barras grises representan las muestras de control. Las barras negras representan muestras tumorales.
En varias muestras adicionales o cambiaron bandas eran visibles, especialmente en las transferencias de SF2 /ASF (Fig. 4A). Tal cuadro se caracteriza por moléculas fosforiladas de manera diferente SF2 proteína ASF /[30].
El empalme alternativo de genes implicados en la tumorigénesis y regulados por factores de empalme se descompone en ccRCC
SF2 regula /ASF splicing alternativo de un número significativo de genes, incluyendo RON proto-oncogén [19], la caspasa-9 [22] regulador de la apoptosis, y Rac1, un miembro de la familia Ras de los proto-oncogenes (regulado por SF2 /ASF y SRp20) [14 ]. Para investigar si las alteraciones en cantidades de factores de empalme son seguidos por cambios en el procesamiento alternativo de los genes diana, se analizaron sus patrones de empalme (Fig. 5). Además, se analizaron los perfiles de empalme de dos genes adicionales:. GLI1 oncogén [25] y CEACAM1 supresor de tumores [23] cuya empalme perturbada se sabe que contribuyen a la progresión del tumor
A. análisis de PCR de patrones de empalme alternativos en doce pares de control (C) y muestras de tejido tumoral (T). 1) RON; 2) CEACAM-1; 3) Rac1; 4) la caspasa-9; 5) GLI1. Las posiciones de los cebadores utilizados para la PCR se muestran en relación a los exones. exones empalmados alternativamente están sombreados. Gradaciones de diferenciación del tumor se muestran (G1, G2, G3). B. Gráfico que muestra las proporciones de expresión de variantes de corte y empalme como se determinó por análisis densitométrico de los productos de PCR a electroforesis. Tenga en cuenta diferentes escalas de los ejes. Las barras grises representan las muestras de control. Las barras negras representan muestras tumorales.
Se encontró que los niveles de las diferentes variantes de corte y empalme de genes analizados variaron entre la mayoría de los doce analizaron pares de control y las muestras tumorales en las que el nivel de proteína de SF2 /ASF y hnRNP A1 se analizó (Fig. 5B). La expresión de RON empalme proto-oncogén variantes Ron y ΔRon diferían entre las muestras de los grados específicos de diferenciación. En todas las muestras tumorales G3 la relación ΔRon /Ron fue mayor que en las muestras de control apareados. En las muestras de proporción de G1 específico de tumor ΔRon /Ron fue mayor o similar en comparación con muestras de control. En las muestras tomadas de número de paciente 13 ambas isoformas estaban ausentes en muestras de tumores y de control. En muestras de tumores clasificados como G2 la relación ΔRon /Ron era variable: en dos muestras de tumor que era similar a la de los controles emparejados, en una muestra que era más alto que en el control emparejado y en una muestra que fue menor que en el control emparejado. los patrones de empalme de CEACAM1 no dependen del grado de diferenciación del tumor muestra. En siete pares de muestras la relación CEACAM1 S /CEACAM1-L fue mayor en tumores que en las muestras de control. En dos pares de muestras CEACAM1-S no fue detectado. patrón de empalme de Rac1 fue similar en la mayoría de las muestras analizadas. La relación Rac1b /Rac1 fue mayor en las muestras de control que en los tumores emparejados en once de pares de tejidos analizados. Siete de pares de muestras analizadas reveló relación más alta de la caspasa-9b /Caspasa-9a en los tumores que en las muestras de control de forma independiente de los grados de diferenciación. patrón de empalme de GLI1 era el más variable. La relación de GLI1-FL /GLI1-Delta N en siete muestras de tumores fue mayor que en los controles emparejados. En dos pares de muestras no hubo diferencias entre las proporciones de variantes de empalme analizados; sin embargo bandas adicionales eran visibles, lo que sugiere la presencia de variantes de corte y empalme no identificados.
Con el fin de encontrar la posible conexión entre los cambios en la expresión de SF2 /ASF y empalme de genes SF2 /ASF-regulada se realizó un análisis de correlación de Pearson entre el expresión de factores de empalme y el empalme exón diana (Fig. 6). Se observó una correlación positiva (r = 0,6915, p = 0,0127) entre la caspasa-9a y proteína /ASF SF2 en el tumor pero no en muestras de control (r = 0,004644, p = 0,9886). También se encontró una correlación positiva (r = 0,6187, p = 0,0320) entre CEACAM1-L y la proteína SF2 /ASF en los tumores, pero no en las muestras de control (r = 0,4482, p = 0,1439). No hemos encontrado ninguna correlación entre la expresión de SF2 /ASF (o hnRNP A1) y las proteínas de las variantes de corte y empalme de Ron, Rac1 o GLI-1 (datos no mostrados).
análisis de correlación de Pearson se llevó a cabo en los datos de doce pares de muestras de control y de tejido tumoral. P & lt;. 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Si bien se sabe que SF2 /ASF regula empalme de la caspasa-9 [22], no hay datos que muestran que CEACAM1-L es un objetivo de SF2 /ASF o de cualquier otro factor de empalme. Sin embargo, se encontró que el exón 7 de CEACAM1 contiene cis-actuando empalme elementos reguladores [23]. Por lo tanto, analizamos la secuencia del exón 7 CEACAM1 utilizando matrices de secuencias de predicción necesarios para la unión de empalme factores SF2 /ASF, SC35, SRp40, Y SRp55 (Fig. 7). Este análisis reveló varios motivos alta puntuación por SF2 /ASF, dos motivos para SC35, tres motivos para SRp40, y un motivo para SRp55.
Predicción de motivos se realizó con el software ESE Buscador [26] utilizando matrices para predicción de secuencias requeridas para la unión de factores de empalme. Para la predicción de sitios de unión de SF2 /ASF, se utilizaron dos matrices: "SF2 /ASF /IgM-BRCA1" (barras blancas) y "SF2 /ASF" (barras grises). Estas dos matrices se obtuvieron en contexto diferente (diferentes minigenes y el tamaño de las bibliotecas de secuencias aleatorias en SELEX [27]). Sólo se muestran los motivos de alta puntuación por encima de los umbrales de SF2 /ASF (1.956), SF2 /ASF /IgM-BRCA1 (1.867), SC35 (2.383), SRp40 (2.670), y SRp55 (2.676). La secuencia de nucleótidos del exón 7 CEACAM1 se da en el eje x.
Discusión
En este trabajo se muestra que la expresión de ARNm de ocho factores de empalme se descompone en ccRCC. La expresión de la proteína de dos factores de empalme, se sabe que actúan antagónicamente, SF2 /ASF y hnRNP A1 también se altera. Estas aberraciones se acompañan de alteración de corte y empalme alternativo de genes dependientes de SF2 /ASF, RON, caspasa-9, y Rac1. También se encontraron alteraciones de tumor específico de corte y empalme alternativo para oncogén GLI1 y supresor de tumor CEACAM1.
Los cambios en la pre-mRNA de empalme son un fenómeno común en tumores malignos humanos. De acuerdo con nuestros resultados, improperties en la expresión de factores de empalme se producen en al menos un medio (50-60%) de las muestras analizadas, aunque las perturbaciones son diversas y el resultado de tanto arriba y regulación a la baja de los factores de empalme (Fig. 1 y 2). La dirección de los cambios no es específico para los grados de diferenciación del tumor ya que se observaron tanto hacia arriba y regulación a la baja en todas las gradaciones. Es notable que, aunque la mayoría de las publicaciones se refieren a aumento específico de tumor de la expresión de factores de empalme, el porcentaje de muestras en las que se produce la expresión alterada rara vez se muestra. Karni et al. [18] informó de que entre 50 analizaron muestras ccRCC más de sobreexpresión 2 veces de SF2 mRNA /ASF se observó en menos de 5% de las muestras. De acuerdo con nuestro análisis el porcentaje de muestras con la sobreexpresión de más de 2 veces era un poco más alto (8%), pero esta diferencia puede ser resultado de número relativamente pequeño de muestras analizadas.
Curiosamente, encontramos que los patrones de ARNm y expresión de proteínas de factores de empalme diferente entre los pacientes individuales y también entre las muestras de control y de tumor de un paciente dado. Esto está de acuerdo con nuestro estudio anterior que muestra los patrones de empalme de tipo 1 yodotironina deiodinase [4] y con otros estudios específicos de tumor y específica del paciente, lo que demuestra que ccRCC se caracteriza por la heterogeneidad molecular y se puede separar en subgrupos de expresión de genes [31] - [33]. En el estudio de Zhao et al. [33] aquellos subgrupos de expresión correlacionada con la supervivencia después de la cirugía, pero, al igual que en nuestro estudio, no se correlacionó con los grados tumorales. Por desgracia, en el caso de nuestro estudio los pacientes no fueron seguidos por lo que no es posible analizar las correlaciones entre los perfiles de expresión y la supervivencia de los pacientes. Klein et al. [34] analizaron las células tumorales residuales individuales de varios tipos de tumores (origen, pero no de riñón) y se encontró una alta heterogeneidad de la expresión génica entre las células de cáncer en particular. Esas células fueron heterogéneos con independencia de si residieran en el mismo compartimento o en diferentes sitios de recalada. variación específica del paciente en la expresión génica También se informó de mama y el cáncer de próstata [35], [36]
Esta variabilidad de la expresión génica es una cuestión interesante, y al menos dos orígenes posibles se debe considerar:. que las variaciones reflejar la especificidad tumor o que reflejen las características individuales del paciente que resultan en una imagen específica de la expresión génica en el tumor. La primera situación se describió para el cáncer de hígado en el que los tumores independientes de un único paciente mostraron diferencias dramáticas en los patrones de expresión de genes [37]. Por otro lado, Perou et al. [35] informaron de que los patrones de expresión génica de diferentes muestras de tumor de mama tomadas de un paciente eran más similares entre sí que a las muestras obtenidas de otros pacientes. No está claro qué situación se refiere a nuestro estudio se analizaron muestras individuales por paciente. Como hemos demostrado recientemente, sin embargo, los tumores ccRCC también pueden revelar patrones de expresión génica más homogéneas [6]. En ese estudio en el que se utilizó parcialmente el mismo material que en el presente trabajo, hemos encontrado tumor ccRCC altamente consistente alteraciones específicas de la vía de la hormona tiroidea: disminución de β1 tiroidea de receptores hormonales (TRβ1) ARNm y proteínas, pérdida de tipo 1 iodothyonine deiodinasa proteínas y rebajado nivel de la hormona tiroidea, triyodotironina (T3).