Extracto
El factor nuclear-2 p45-eritroide relacionada con el factor 2 (Nrf2) es un factor de transcripción que regula la expresión de muchos genes citoprotectores. En el presente estudio, se encontró que la expresión de Nrf2 fue suprimida en tumor de próstata de la transgénico adenocarcinoma de próstata de ratón (TRAMP) ratones. Del mismo modo, la expresión de Nrf2 y la inducción de NQO1 también fueron suprimidas sustancialmente en las células C1 TRAMP tumorigénico pero no en las células TRAMP C3 no tumorigénicas. El examen de la región promotora del gen de ratón Nrf2 identificado una isla CpG, que fue metilado CpG en los sitios específicos en tumor de próstata TRAMP y en las células TRAMP C1 pero no en próstata normal o células TRAMP C3, como se muestra por la secuenciación genómica con bisulfito. Reportero ensayos indicaron que la metilación de estos sitios CpG inhibe dramáticamente la actividad transcripcional del promotor de Nrf2. immunopreceipitation cromatina (ChIP) ensayos reveló aumento de unión de la proteína metil-CpG vinculante 2 (MBD2) y proteínas H3 trimetil-histona (Lys9) a estos sitios CpG en las células TRAMP C1 en comparación con células TRAMP C3. Por el contrario, se redujo la histona unión de la ARN Pol II y acetilado H3 al promotor Nrf2. Además, el tratamiento de las células TRAMP C1 con ADN metiltransferasa (DNMT) inhibidor de la 5-aza-2 'desoxicitidina (5-aza) y la histona desacetilasa (HDAC) inhibidor de tricostatina A (TSA) restauró la expresión de Nrf2, así como la inducción de NQO1 en las células TRAMP C1. Tomados en conjunto, estos resultados indican que la expresión de Nrf2 se suprime epigenetically por metilación promotor asociado con MBD2 y modificaciones de las histonas en el tumor de próstata de los ratones TRAMP. Nuestros resultados actuales revelan un nuevo mecanismo por el cual la expresión Nrf2 se suprime en tumor de próstata TRAMP, arrojar nueva luz sobre el papel de Nrf2 en la carcinogénesis y ofrecer posibles nuevas direcciones para la detección y prevención del cáncer de próstata
Cita.: Yu S, A Khor, Cheung KL, Li W, Wu TY, Huang Y, et al. (2010) Expresión Nrf2 está regulada por mecanismos epigenéticos en el cáncer de próstata de ratones TRAMP. PLoS ONE 5 (1): e8579. doi: 10.1371 /journal.pone.0008579
Editor: Andy T. Y. Lau, Universidad de Minnesota, Estados Unidos de América
Recibido: 13 Septiembre, 2009; Aceptado: 6 de diciembre de 2009; Publicado: 5 Enero 2010
Derechos de Autor © 2010 Yu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado en parte por los Institutos nacionales de Salud subvenciones R01-CA118947 y R01-094828 a A.-N. T. Kong. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El cáncer de próstata, así como muchos otros tipos de cáncer relacionados con la edad, se caracteriza por un aumento del estrés oxidativo intracelular [1], [2]. estrés oxidativo crónico y sus estados patológicos asociados incluyendo trastornos inflamatorios y metabólicos se han postulado para conducir mutaciones somáticas y la transformación neoplásica, por tanto, podría desempeñar un papel importante en el desarrollo y progresión del cáncer de próstata [3]. El aumento del estrés oxidativo o especies reactivas de oxígeno (ROS) niveles podrían ser una consecuencia del aumento de la generación de ROS y /o disminución de la capacidad antioxidante y la desintoxicación o ROS. Recientemente, el deterioro del sistema de defensa antioxidante en la carcinogénesis del cáncer de próstata ha ido ganando el aumento de atenciones.
El sistema de defensa antioxidante celular comprende una batería de antioxidante /desintoxicación de enzimas y proteínas tales como la superóxido dismutasa (SOD), catalasa, hemeoxgenase ( HO), UDP-glucuronosiltransferasas (UGT), glutatión peroxidasa (GPx), glutatión S-transferasas (GST), y NAD (P) H: quinona oxidorreductasa (NQO) [4]. Down-regulación de GST por la metilación del ADN parece ser bastante común en el cáncer de próstata humano que ha sido desarrollado como un marcador de diagnóstico [5]. La expresión y la actividad de SOD, se ha informado de la catalasa y la GPx ser disminuido en los tejidos de carcinoma de próstata, así como en el plasma y los eritrocitos [6] - [8]. Estudios recientes de nuestro laboratorio y otros han encontrado que los niveles de expresión de SOD, UGT1A1, NQO1 y varios genes de la familia GST se suprimieron significativamente en los tumores de próstata en Transgenic Adenocarcinoma de Ratón de próstata (TRAMP) ratones [9] - [11]. A pesar de la baja regulación de las enzimas GST en el cáncer de próstata humano se han relacionado con el promotor de la hipermetilación de los genes GST [5], [12]; la hipermetilación del promotor de ADN no parece causar la represión de genes GST en los tumores TRAMP [9]. En su lugar, la regulación por disminución del factor nuclear eritroide 2p45 (NF-E2) -relacionado factor de 2 (Nrf2), un regulador clave de las enzimas antioxidantes celulares, pueden ser responsables de la represión transcripcional de GST y otra fase II genes de enzimas desintoxicantes [11 ].
Nrf2 es un factor de transcripción de cremallera de leucina básica hélice-bucle-hélice que regula la expresión de muchos de desintoxicación en fase II y enzimas antioxidantes a través de su unión al elemento de respuesta antioxidante (ARE) en la región promotora [ ,,,0],4]. Knockout de Nrf2 en ratones abrogada sustancialmente la expresión inducible de desintoxicación mediada por ARE y enzimas antioxidantes, y rindió estos ratones muy susceptibles a los carcinógenos y /o daños oxidativos [13], [14]. En estos contexto, previamente se ha encontrado que los niveles de expresión de proteínas de Nrf2 y el gen Nrf2-objetivo hemo-oxigenasa-1 (HO-1) se atenuaron en los tumores de la piel de un modelo de carcinogénesis de piel de ratón [15]. Del mismo modo, la expresión de Nrf2, así como sus genes diana aguas abajo tales como UGT1A1, GSTM1 y NQO1 resultaron ser poco a poco hacia abajo-regulada en los tumores de próstata con la progresión de la tumorigénesis de próstata en ratones TRAMP [10]. Frolich et al. informó recientemente de la expresión de Nrf2 y los genes de la familia GST mu se redujo significativamente en el tumor de próstata TRAMP, y vinculado a este fenómeno al aumento del estrés oxidativo y el daño del ADN en el cáncer de próstata. Meta-análisis de la expresión tisular de datos de perfiles de base de datos Oncomine (www.oncomine.org) sugirió que las expresiones de Nrf2 y varios genes GST mu son también poco a poco hacia abajo-regulada en los cánceres de próstata humanos [11].
La transcripción de Nrf2 ha sido recientemente demostrado ser regulado por el receptor de aril hidrocarburos (AHR) y Nrf2 misma [16], [17]. Sin embargo, el paradigma actualmente aceptado de la regulación Nrf2 parece lograrse principalmente a través de mecanismos postraduccionales. Como tal, Nrf2 se suprime funcionalmente por la proteína derivada de las células eritroides Kelch-como con CNC homología (ECH) Protein -asociado 1 (Keap1), que se une a y secuestra Nrf2 en el citoplasma que conduce a la degradación de Nrf2, y por lo tanto Nrf2 evita la translocación nuclear y la transactivación de sus genes diana [18]. Al desafíos por oxidativo o tensiones electrófilos que podrían involucrar potencial modificación de los residuos de cisteína críticos en Keap1 y o la propia Nrf2 junto con la fosforilación por quinasas, Nrf2 es liberado de Keap-1, translocates en el núcleo, dimeriza con pequeñas proteínas Maf, se une a ARE y transcripcionalmente activa Nrf2 son genes diana [4]. Hasta la fecha, no está claro en cuanto a cómo se suprime la expresión de Nrf2 en el cáncer de próstata humano o en el tumor de ratón TRAMP.
epigenética o mecanismos epigenómicos, especialmente la metilación del ADN, han sido implicados con frecuencia en las alteraciones del gen expresión en el cáncer de próstata [19], [20]. hipermetilación coordinada de APC y GSTP1 en la carcinogénesis temprana se ha utilizado como potenciales marcadores de diagnóstico para detectar el cáncer de próstata [21]. Además, la alteración de los perfiles de metilación del ADN se ha relacionado con la progresión del cáncer [20]. La metilación del ADN, junto con modificaciones de las histonas, afectaría a las interacciones de los promotores de los genes críticos con corepressors transcripción y coactivadores que conducen a cambios en la expresión de los genes, que podría ser una de las fuerzas impulsoras de la carcinogénesis de próstata. El silenciamiento de genes múltiples de la metilación del ADN se ha informado en los tumores de próstata TRAMP y líneas celulares derivadas de tumores de próstata TRAMP [22] - [24]. La inhibición de la actividad de metiltransferasa de ADN por 5-aza-2 'desoxicitidina (5-aza) se ha demostrado para prevenir la tumorigénesis de próstata en ratones TRAMP [25]. Además, se ha informado de la expresión de Keap1 ser regulados por la metilación del ADN en el cáncer de pulmón [26]. En el presente estudio, se identificó por primera vez una isla CpG en la región aguas arriba 5 'de flanqueo del gen murino Nrf2 seguido de interrogación del estado de metilación de ADN de toda la isla CpG mediante secuenciación genómica de bisulfito. Hemos encontrado que ciertos sitios CpG en la región distal de la isla CpG se hypermethylated en los tejidos tumorales TRAMP, así como en tumorigénico TRAMP-C1 y C2 las células, pero no en tejido normal de próstata y células TRAMP-C3 no tumorigénicas. Utilizando ensayo indicador metilado, inmunoprecipitación de la cromatina y el ensayo de tratamientos (chip) con tricostatina A (TSA) /5-aza, nos presentó pruebas convincentes de que la expresión de Nrf2 se epigenetically regulada durante el desarrollo de los tumores de próstata en ratones TRAMP. Nrf2 expresión fue suprimida por la metilación de ciertos sitios CpG y esto fue acompañado por el reclutamiento de MBD2 y H3 trimetil-histona (Lys9) al promotor del gen Nrf2 en el tumor de próstata de los ratones TRAMP.
Resultados
la hipermetilación de sitios específicos CpG en la isla CpG en el gen murino Nrf2
la secuencia genómica del gen Nrf2 (NC_000068.6: desde 75544698 hasta 75.513.576 Mus musculus cromosoma 2, el conjunto de referencia (C57BL /6J), incluyendo 2 kb de su secuencia 5'-aguas arriba) se analizó para determinar isla CpG utilizando CpG Buscador isla (http://people.usd.edu/~sye/cpgisland/CpGIF.htm). Desde varios mRNA variantes con diferentes sitios de inicio de transcripción (TSS) se han reportado en la literatura [16], [27], [28], por lo tanto, en el presente estudio se define el sitio de iniciación de la traducción (TIS) como la posición 1 para evitar cualquier posible confusión. Se identificó una isla CpG entre -1175 y 1240, con un contenido de GC de 61,53%, CpG observó /proporción esperada de 0,66 y un total de 150 CpG. La isla CpG incluye el promotor Nrf2 murino, el primer exón y parte del primer intrón (Figura 1A). Se obtuvieron resultados similares cuando se utilizan otros criterios y algoritmo (http://www.uscnorris.com/cpgislands2/cpg.aspx, datos no mostrados). 10 conjuntos de cebadores de secuenciación genómica de bisulfito (BGS) fueron diseñados utilizando el servidor web BiSearch (http://bisearch.enzim.hu/, [29]) para cubrir la región 5'-acompañamiento que abarca desde -1.226 mil a +844 de la gen Nrf2 murino (Tabla S1). Se utilizó ADN genómico con bisulfito convertido derivado de 12 tumores de próstata de los ratones TRAMP palpables edad de 24 semanas y 10 tejidos de la próstata aparentemente normales de los ratones C57BL /6J como plantillas. Como se muestra en la Figura 1B, aunque la mayoría de la isla CpG es apenas metilado, se encontró que los primeros 5 sitios CpG a hypermethylated (96%) en los tumores de próstata en comparación con tejidos de la próstata de apariencia normal (4%). cromatógrafos de secuenciación representativo que muestra los primeros 5 GPC en tumor de próstata y la próstata normal se muestran en la Figura S1. Los siguientes 10 CpG que están separados por dos lagunas sin CpG (-1131 a -1060 y -886 a -798) también muestran el estado de metilación diferencial en los tumores (34%) en comparación con los tejidos normales (2%). Además, otra región situada en el primer intrón parece ser escasamente CpG metilado en el tumor de próstata (4,5%).
(A) Una isla CpG se identificó en la región flanqueante 5 'del gen de ratón Nrf2 , que abarcan desde la posición -1175 hasta 1240 con el sitio de iniciación de la traducción establecer como posición 1. las secuencias incluidas en la secuencia genómica de bisulfito (-1226 a 844) y contienen CpG metilados se presentan esquemáticamente con sitios CpG indicados por líneas verticales. (B) Los patrones de metilación y las extensiones de sitios CpG en el promotor del gen Nrf2 en tumor de próstata TRAMP y de próstata aparentemente normal se determinaron mediante la secuenciación genómica con bisulfito como se describe en Material y amp; Métodos. Los puntos negros indican los CpG metilados y los círculos abiertos indican los CpG no metilados. (C) Se determinaron los patrones de metilación y las extensiones de sitios CpG en el promotor del gen Nrf2 en TRAMP C1 y las células C3. Los CpG en la secuencia entre 296 a 594 no se muestran porque la metilación es insignificante.
TRAMP C1, líneas de células C2 y C3 se originó a partir de un tumor heterogéneo de 32 semanas de duración del ratón TRAMP [30 ]. Mientras que las células TRAMP C1 y C2 son tumorigénicas cuando injertados en singénicos C57BL /6J hosts, células TRAMP C3 no lo son. El ADN genómico de las células C1 y C3 fue secuenciado-bisulfito como anteriormente para detectar el estado de metilación de la isla CpG en el gen Nrf2. Sorprendentemente, los metilados CpG "puntos calientes" que se encuentran más arriba en el tumor de próstata TRAMP también se metilado en las células oncogénicas C1 pero no en TRAMP no tumorigénicos células C3 (Figura 1C).
La metilación de los primeros 5 CpG de manera significativa, suprimía la actividad transcripcional del promotor del ratón Nrf2
Para investigar el papel funcional de metilación de CpG sitios específicos, en particular los primeros 5 GPC en la isla CpG, reporteros de luciferasa dirigido por el promotor Nrf2 con o sin el primer 5 CpG (designado como -1,367 y -1,065, respectivamente) se construyeron como se describe en Materiales y Métodos (figura 2A). Los plásmidos se metilado CpG mediante M. LICE metiltransferasa
in vitro
y el estado de metilación fue confirmada por HpaI /HhaII la digestión (Figura S2). Como se muestra en la Fig. 2B, el promotor -1065 Nrf2, que había sido informado anteriormente [17], [28], se incrementó sustancialmente la actividad de luciferasa a alrededor de 200 pliegues. En contraste, el promotor -1367 Nrf2 mostró una actividad transcripcional menos potente (~67 pliegues). Es importante destacar que,
in vitro
CpG-metilación del constructo reportero resultó en una disminución dramática de la actividad transcripcional del promotor -1367 Nrf2 (disminución 84%); mientras que, la actividad del promotor -1065 desciende sólamente en 23,4% en CpG de metilación. Se obtuvieron resultados similares en células de hepatoma Hep G2 y HEK de riñón embrionario humano 293 células (Figura S3).
(A) La construcción de la prensa de luciferasa se presenta esquemáticamente. promotores Nrf2 con (-1.367-1) o sin (-1065-1) la secuencia adicional que contiene los primeros 5 CpG fueron amplificados a partir de ADN genómico de ratón y se insertó en pGL 4,15 vector. Los reporteros resultantes se designaron como PGL-1367 y PGL-1065, respectivamente. (B) pGL-1367 o reporteros pGL-1065, ya sea metilado por metiltransferasa CpG o no, fueron co-transfectadas con pGL 4,75 vector que contiene un Renilla reniformis gen de luciferasa dirigido por el promotor CMV en las células TRAMP C1, y se midieron las actividades de luciferasa después de 24 horas. Las actividades transcripcionales de cada uno de los constructos se calcularon mediante la normalización de las actividades de luciferasa de luciérnaga con actividades de luciferasa de Renilla correspondiente, y se representan como pliegues de la inducción en comparación con la actividad de vacío pGL 4,15 vector. Los valores son la media ± SD de cuatro muestras separadas.
hypermethylated CpG Island se asoció con dominio (MBD2) y modificaciones de las histonas, que es reversible por la 5-aza /TSA Tratamiento
La represión de la expresión génica mediante la metilación de CpG se consigue generalmente proteínas MBD que se unen al ADN metilado que conduce a la contratación de la remodelación de la cromatina y los complejos represor transcripcional [31]. En el presente estudio, se emplearon ensayos de chip para examinar las proteínas que podrían ser potencialmente asociados con el promotor Nrf2 en las células TRAMP C1 y C3. Con base en el estado de metilación del promotor de Nrf2, conjuntos de cebadores fueron diseñados para cubrir los primeros 5 CpG y la SAT para detectar la asociación de proteínas de unión al ADN especificadas, así como ARN polimerasa II (pol II). La especificidad de los ensayos de chip se verificaron mediante IgG no específica que no tire hacia abajo nada. Como control positivo, β-actina promotor está igualmente asociada con Pol II en C1 y C3 (Figura 3A). La unión de Pol II al gen Nrf2 TSS se redujo significativamente en las células C1 en comparación con en las células C3, lo que indica una transcripción suprimida de Nrf2 en las células C1 (Figura 3A & amp; B). De acuerdo con esta observación, la unión de MBD2 y tri-metilado de la histona 3-Lys9, (H3K9me3) a los CpG metilados en promotor Nrf2 era mayor en las células C1 que en las células C3, mientras que la asociación de la histona acetilada 3 (H3Ac) representada un patrón invertido (Figura 3A & amp; B). proteína metil CpG de unión 2 (MeCP2) y Sin3A mamíferos (mSin3A) también se ensayaron para su unión con este promotor Nrf2; sin embargo no detectable se observó unión (datos no mostrados). Se realizó el ensayo
(A) de chips para detectar la unión de proteínas que se indican a regiones específicas del gen Nrf2 reticulado y se inmunoprecipitaron a partir de TRAMP C1 y las células C3. Los resultados de 3 experimentos independientes se cuantificaron por densitometría como se muestra en (B). las células (C) TRAMP C1 se trataron con vehículo, o 5-aza-5 aza + TSA como se describe, a continuación, las células se sometieron a ensayo de ChIP. Los resultados de 2 experimentos independientes se cuantificaron por densitometría como se muestra en (D). Chip ensayos se realizaron como se describe en Materiales & amp; Los métodos que utilizan anticuerpos contra Pol II, MBD2, H3K9m3 y AcH3. 3 series de cebadores se utilizaron chip (Tabla S2), con Nrf2P1 cubre los primeros 5 CpG (-1190 a -1092) en la isla CpG y Nrf2P2 cubre una región cercana a los SAT (-62 a +20). No específica de IgG se utilizó como control negativo y la unión de Pol II de la ß-actina promotor se utilizó para verificar la eficiencia del chip de ensayo. Los experimentos se repitieron al menos dos veces con resultados similares.
El estado de metilación del ADN está regulada por el ADN metil-transferasas (DNMTs) y 5-aza es un inhibidor de DNMT, a menudo se utilizan para examinar la efectos de la metilación del ADN [32]. Como se muestra en la Figura 3C & amp; D, tratamiento de 5-aza de las células C1 disminuye la unión de MBD2 y H3K9me3 al promotor Nrf2, mientras que el H3Ac exhibe ningún efecto observable. Sin embargo, el tratamiento combinado de C1 células con un inhibidor de histona deactylase (HDAC), TSA 5-aza y, aumenta sustancialmente la unión de H3Ac al promotor Nrf2, y disminuye aún más los enlaces de MBD2 y H3K9me3 al promotor Nrf2. En consonancia con los resultados anteriores, el reclutamiento de Pol II al promotor Nrf2 también aumenta correspondientemente, mientras que la unión promotor de beta-actina de Pol II no cambió (Figura 3C).
El transcripcional Inducción de Nrf2 y NQO- 1 en TRAMP líneas celulares se correlacionó con las islas CpG metilación de estado y podría ser restaurado por la 5-aza /TSA tratamiento
Nosotros y otros han informado anteriormente de que la expresión de Nrf2 y sus genes diana se suprime en los tumores de próstata TRAMP [10], [11]. Marvis et al., Se había informado de que la expresión de genes de la familia GST fue suprimida en las células TRAMP C2 y 5-aza y tratamiento TSA podría restaurar la expresión [9]. Aquí hemos examinado la expresión de Nrf2 y uno de sus genes diana aguas abajo NQO1 en células TRAMP C1 y C3. Como se muestra en la figura 4A, el nivel de mRNA de Nrf2 es significativamente menor en las células C1 que en las células C3. La expresión de NQO1 fue inducida fácilmente por tBHQ, un agonista de Nrf2 clásico, en las células C3, mientras que dicha inducción fue mitigado en las células C1 (Figura 4A & amp; C). El tratamiento de células C1 con 5-aza y TSA modestamente restaurado Nrf2 expresión y mejora de forma significativa la inducción de NQO1 por tBHQ. Sin embargo, el tratamiento de células C3 en las mismas condiciones no mostró efecto sobre la expresión de Nrf2 o NQO1 (Figura 4A, B & amp; C). Western Blot se realizó para examinar los niveles de expresión de proteínas de Nrf2, NQO1, MBD2, H3Ac y H3K9me3 (Figura 4D). Los niveles de proteína de Nrf2 y NQO1 fueron inferiores en C1 células que en las células C3, y 5-aza y tratamiento TSA mejoran la inducción de la proteína de NQO1 por tBHQ. Aunque 5-aza y tratamiento TSA no aumentó el nivel basal de la proteína Nrf2 el tratamiento significativamente aumentada expresión de la proteína Nrf2 tBHQ inducida. TSA tratamiento incrementado fuertemente acetilado histona 3 proteínas, mientras que no tuvo efecto sobre el estado de metilación de la histona 3. Curiosamente, aunque el nivel de proteína de MBD2 no fue afectada por 5-aza y tratamiento TSA, era mucho mayor en las células C1 que en las células C3 (Figura 4D).
células TRAMP C1 y C3 se trataron con 2 M 5-aza, 200 TSA nM, o 1 M 5-aza más 100 nM TSA durante 60 horas o 48 horas seguido de incubación en presencia de 5 mM tBHQ para otras 12 hrs. Después de los tratamientos, se recogieron las células para la proteína o el ARN total extracciones. (A) los niveles de ARNm de Nrf2 y NQO1 se determinaron por RT-PCR, con GAPDH que sirve como control interno, y los resultados de 3 experimentos independientes se cuantificaron por densitometría, y los resultados se muestran en B y C. (D) la proteína niveles de Nrf2, NQO1, MBD2, H3K9me3 y H3Ac se determinaron por transferencia de Western, con la actina como control de carga. Cada experimento se repitió al menos dos veces con resultados similares.
Discusión
Resultados anteriores de varios laboratorios incluyendo nuestro laboratorio han demostrado que Nrf2 juega un papel esencial en el desarrollo de diversos tipos de cáncer [ ,,,0],33]. Nrf2 regula la expresión de enzimas antioxidantes y fase II detoxificantes incluyendo NQO1, HO-1 y GST [33]. Por lo tanto, el control de la activación transcripcional de genes Nrf2 y Nrf2 objetivo parece ser un mecanismo homeostático importantes que protegen las lesiones celulares o daños resultantes de estrés oxidativo [33]. La deficiencia de Nrf2 podría conducir a un defecto en el sistema de defensa celular contra el estrés oxidativo, potencialmente resultando en el cáncer de iniciación, promoción y progresión [34]. La expresión reprimida de enzimas antioxidantes y desintoxicantes tales como GSTP1 en cáncer de próstata se ha estudiado ampliamente [2], [5]. Sin embargo, el papel de Nrf2 en el cáncer de próstata no se ha prestado suficiente atención hasta hace poco tiempo [10], [11].
Frolich et al. informó que la baja regulación de Nrf2 parece ser responsable de la reducción de expresión GST, elevado estrés oxidativo y el daño del ADN en la tumorigénesis de próstata en ratones TRAMP [11]. Hemos encontrado recientemente que la expresión de Nrf2, así como genes Nrf2 objetivo es gradualmente reducido regulado durante la progresión del cáncer de próstata en ratones TRAMP [10]. análisis previo de los conjuntos de datos de expresión de genes de próstata humano en línea demostró que la expresión de Nrf2 y GST [11], así como NQO1 se disminuyen gradualmente durante la carcinogénesis de próstata humano (figura S4). Por otra parte, se ha informado de que varios genes GST están regulados hacia abajo en la primaria, pero no en los tumores metastásicos TRAMP [9]. En el estudio actual, se encontró que la expresión de Nrf2 y la inducción de NQO1 se vio comprometida en las células C1 TRAMP tumorigénico pero no en las células TRAMP C3 no tumorigénicas (Figura 4A). Esta supresión de la expresión Nrf2 y Nrf2-objetivo NQO1 gen en ambas de estas líneas de células TRAMP excluiría la posibilidad de que la expresión de Nrf2 se vería afectada por el transgén SV40, ya que estas líneas de células TRAMP no expresan el transgén SV40 [30].
metilación del ADN ha sido implicada en el silenciamiento del gen GSTP1 en cáncer de próstata humano, y de manera similar el silenciamiento de la metilación del ADN de varios otros genes también están implicados en tumor TRAMP próstata [5], [23], [24]. Sin embargo, el análisis curiosamente análisis MassARRAY cuantitativo de metilación de ADN (MAQMA) de la región 5 'de varios genes GST no mostró diferencias significativas entre las células epiteliales prostáticas normales y de tumor de próstata de los ratones TRAMP [9]. Recientemente, varios informes muestran que tanto en TRAMP y Rb - /- tumores de próstata, un aumento Rb /E2F-dependiente de la expresión y la actividad DNMT1 metilación [25], [35]. la hipermetilación del promotor Nrf2 se descartó el uso de MSP y que el tratamiento 5-aza no tuvo ningún efecto sobre la expresión de Nrf2 (con datos no mostrados) [11]. Se analizaron la región flanqueante 5 'del gen Nrf2 y se identificaron una isla CpG que se extiende a la posición -1175 (Figura 1A). El uso de la secuenciación de bisulfito, lo que sería más específico en la identificación de la metilación CpG y revelaría más detalles acerca de la metilación del ADN de MSP, se encontró que los primeros 5 GPC en la isla CpG se hypermethylated en tumores TRAMP próstata y en el vagabundo tumorigénicos células C1 no, pero en los tejidos normales de la próstata y células TRAMP C3 no tumorigénicas (Figura 1B). Sorprendentemente, estos 5 CpG se encuentran adyacentes al promotor Nrf2 se informó anteriormente [17]. Por lo tanto, el estado de metilación de estos CpG específicos parece estar correlacionada con la tumorigenicidad así como la expresión y la inducción Nrf2 NQO1 (Figuras 1 y 4). Notablemente, patrón similar de metilación específica de la isla CpG distal también se ha observado en el gen Keap1 en células de cáncer de pulmón [26]. Es importante tener en cuenta que algunos de nuestros resultados actuales parecen ser algo contradictoria con los resultados reportados anteriormente [11], los resultados obstante anteriores de extensa regulación a la baja de Nrf2 y GST durante la progresión de tumores de próstata en ratones TRAMP [11], son consistentes con nuestros resultados actuales.
Para determinar el papel funcional de metilación de estos 5 CpG en la supresión de Nrf2 expession, reporteros de luciferasa del promotor Nrf2 con o sin estos 5 CpG se construyeron (Figura 2A). El promotor Nrf2 posee promotor no canónica rica en GC muy no contiene ni caja TATA ni una caja CCAAT [28], sin embargo, este Nrf2-promotor potentemente activa la transcripción de gen indicador de luciferasa (Figura 2B). Curiosamente, la adición de secuencias -1065--1.367 parece ser represivo a la actividad transcripcional del promotor de Nrf2 (Figura 2B). Tal secuencia represivo podría funcionar mediante el reclutamiento de factores represoras específicas [36], pero el mecanismo exacto que representa esta función represiva de esta secuencia, incluso en ausencia de metilación requeriría más investigación. Sin embargo, cuando se metilado los reporteros
in vitro
por CpG metiltransferasa, la actividad de indicador de luciferasa del promotor Nrf2 con la secuencia adicional que contiene los 5 CpG (pGL-1367) se redujo en aproximadamente 84%. En contraste, la metilación del reportero sin la secuencia adicional dio como resultado aproximadamente 23% de reducción (Figura 2B). Esto es probablemente debido a la fuerte metilación de todo el constructo que incluye el gen de la luciferasa (pero se necesitan más estudios para demostrar esto). En conjunto, estos resultados sugieren que los 5 CpG extra (-1065 a -1367) podrían desempeñar un papel fundamental en la supresión dependiente de la metilación del promotor de la actividad Nrf2.
El papel de la metilación CpG en la supresión de la expresión de Nrf2 y la activación era probado por el tratamiento con 5-aza en las células TRAMP. 5-Aza ha sido previamente demostrado ser capaz de prevenir la progresión de la enfermedad temprana, retrasar la enfermedad independiente de andrógenos y mejorar la supervivencia de los ratones TRAMP [25], [37]. Además, la etapa y la metilación isla y ADN metiltransferasa expresión CpG-fenotipo específico han sido bien documentados durante la progresión del cáncer de próstata en ratones TRAMP [38], [39]. Estos hallazgos publicados sugieren la importancia de la utilización de este sistema TRAMP para interrogar el posible papel de las alteraciones epigenéticas en la carcinogénesis de próstata. tratamiento con 5-aza de células TRAMP C1 aumentó ligeramente el nivel de mRNA de Nrf2, mientras que los tratamientos combinados de 5-aza y TSA inducen un aumento más prominente de Nrf2 (Figura 4A). Este resultado es consistente con el informe de Mavis et al., En la que combina tratamientos 5-aza y TSA aumentó significativamente la expresión de genes GST [9]. El nivel de proteína Nrf2 en las células TRAMP C1 no se vio afectado por cualquiera de las 5-aza o tratamientos /TSA 5-aza, sin embargo, la adición de un tBHQ Nrf2-activador potente mejoraría la acumulación de la proteína Nrf2 (Figura 4B). Como era de esperar, la inducción de NQO1 ARNm y los niveles de proteína muestra una tendencia similar a la de la proteína Nrf2. Es muy probable que, puesto que la señalización de Nrf2 está regulada principalmente a través de mecanismos de post-traduccionales, sin desafíos con Nrf2-activadores tales como tBHQ, la proteína Nrf2 se volvió rápidamente durante por proteosoma dependiente de la degradación de [18]. La razón exacta de por qué tBHQ es necesaria para la inducción de NQO1 requeriría un mayor estudio.
Para definir con mayor precisión el mecanismo molecular por el que el CpG metilación específica suprime la expresión Nrf2, se realizaron ensayos de chip. El resultado revela que la unión de MBD2 y H3K9m3 a las GPC específica era sustancialmente mayor en las células TRAMP C1 que en las células TRAMP C3 se correlaciona con el hecho de que las GPC se metilado mínimamente en las células TRAMP C3 (Figura 3A). Por el contrario, AcH3 muestra un patrón de unión opuesta a la misma secuencia de CpG en las células TRAMP C1 en comparación con células TRAMP C3, y de manera similar la unión de Pol II al sitio de inicio de transcripción mostró patrón similar como AcH3 (Figura 3A). Estas asociaciones de metilación dependiente de corepressors podrían ser modulados por los tratamientos de 5-aza y TSA y nuestros resultados (Figura 3B) se correlacionaron muy bien con el nivel de transcripción de Nrf2 (nivel de ARNm) en estas dos líneas celulares (Figura 4A). MBD2 ha informado para mediar el silenciamiento epigenético de 14-3-3σ en las células TRAMP C1 y células LNCaP de próstata humanos [24], y se ha demostrado estar implicado en la represión transcripcional de GSTP1 en MCF-7 células de cáncer de mama [40] . MBD2 y otras proteínas MBD se unen a los CpG metilados y reclutan corepressor complejos que contienen HDACs, proteínas remodelación de la cromatina, así como otras proteínas que conducen a la represión de la expresión de genes hypermethylated [31]. Curiosamente, el nivel de proteína de MBD2 era mucho mayor en las células TRAMP C1 que en TRAMP C3 células (Figura 4A), lo que sugiere una posible supresión epigenética mediada por MBD2 común de Nrf2 en las células TRAMP C1. Por el contrario, el nivel de proteína de AcH3 era aparentemente inferior en las células TRAMP C1 que en las células TRAMP C3 pero se aumentó enormemente mediante tratamiento TSA (Figura 4D). Dado que la expresión de MBD2 sería dependiente de las actividades de HDAC, nuestros resultados anteriores serían potencialmente explican el requisito de inhibidores de HDAC para modular eficazmente corepressors de unión y para restaurar al máximo la reexpresión de Nrf2, así como la inducción de NQO1 en las células TRAMP C1. Además, cuando esta secuencia de supresión que contiene el extra de 5 CpG se analizó adicionalmente utilizando el transcripcional elementos de búsqueda del sistema (TESS, http://www.cbil.upenn.edu/tess), basado en la base de datos TRANSFAC V6.0, varios factor de transcripción se identificaron sitios de unión, incluyendo los sitios de unión de E2F1-p107 y NF-E2 (datos no mostrados).