Extracto
El proceso de transformación celular implica cascadas de cambios moleculares que se modulan a través epigenética alterada, transcripción, después de la traducción y de las redes de regulación de proteínas. Por lo tanto, la identificación de alteraciones de proteínas de transformación asociada puede proporcionar una visión de las principales vías de regulación activados durante la progresión de la enfermedad. En el enfoque de perfiles de expresión de la proteína presente, hemos identificado conjuntos de diferencial de proteínas en una pantalla de electroforesis en gel bidimensional de un modelo de progresión adenocarcinoma de ovario seroso. categorización basado en las funciones de las proteínas asociadas exclusivamente con células pre-transformado identificaron cuatro procesos celulares de los que se conoce RXR-γ para modular la diferenciación celular y la apoptosis. Así, probaron la relevancia funcional de la expresión de RXR-γ y de señalización en estas dos vías durante la progresión del tumor. se observó expresión de RXR-γ para modular la diferenciación celular y la apoptosis en las células pre-transformadas de estado estable. Curiosamente, se encontró que el tratamiento con retinoides para mejorar la expresión de RXR-γ en células transformadas y sensibilizarlos sobre la apoptosis
in vitro
, y también reducir el crecimiento de xenoinjertos derivados de las células transformadas. Nuestros resultados hacen hincapié en que la pérdida de los niveles de RXR-gamma parece proporcionar beneficios mecanicistas de células transformadas a la adquisición de resistencia a la apoptosis sello distintivo del cáncer, mientras que el tratamiento eficaz retinoide puede presentar un enfoque viable hacia la sensibilización de las células tumorales a la apoptosis a través de la inducción de la RXR- γ expresión
Visto:. Kalra RS, Bapat SA (2013) expresión Proteómica Pronósticos Pérdida de RXR-γ durante la progresión del cáncer ovárico epitelial. PLoS ONE 8 (8): e70398. doi: 10.1371 /journal.pone.0070398
Editor: Rajeev Samant, Universidad de Alabama en Birmingham, Estados Unidos de América
Recibido: 8 Febrero 2013; Aceptado: 18 Junio 2013; Publicado: 6 Agosto, 2013
Derechos de Autor © 2013 Kalra, Bapat. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Departamento de Biotecnología del Gobierno de la India, Nueva Delhi a SAB [subvención no. BT /PR7186 /MED /14/965 /de 2006]. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
una visión contemporánea de la tumorigénesis es que los resultados de la transformación como un proceso de múltiples etapas que implica cambios genéticos, epigenéticos, asociada a tejido celular y [1], [2], [3]. Estas alteraciones de efecto en varias redes reguladoras y funcionales dentro de la célula que conducen a una adquisición progresiva de las capacidades de autosuficiencia en las señales de crecimiento, insensibilidad a las señales anti-crecimiento, potencial de replicación ilimitado, la evasión de las señales de apoptosis, invasión de tejidos y metástasis, y angiogénesis sostenida [4]. Más recientemente, la energía reprogramación metabolismo y evadir la destrucción inmune han recibido el reconocimiento como características adicionales de transformación [5].
cáncer ovárico epitelial (EOC) es reconocido como el quinto cáncer más común y la causa más frecuente de cáncer relacionados muertes entre la mujer [6], [7]. Una limitación de los estudios de EOC es la falta de identificación de las lesiones pre-neoplásicas que conducen a la metástasis rápida y agresiva, etapa en la cual la enfermedad se diagnostica con mayor frecuencia. Esto se hace aún más compleja a partir de los hallazgos más recientes que sugieren EOC de alto grado que se originan en el epitelio de las trompas de Falopio, en contraste con la opinión clásica de los epitelios de la superficie del ovario siendo la célula de origen [8], [9]. Aunque proteoma contemporánea análisis proporcionan una fuente dinámica y eficiente de identificación de los supresores de tumores, oncogenes, el diagnóstico del cáncer y la terapéutica [10], [11], [12], [13], una comprensión ampliada de la multi-etapa de eventos de transformación en EOC vis-a-vis expresiones moleculares alterados entre los transformados y aún no se ha resuelto células pre-transformado
.
El presente estudio se basa en perfiles proteómicos de un
in vitro
modelo de adenocarcinoma de ovario seroso ( SeOvCa) establecida anteriormente en nuestro laboratorio [14]. En pocas palabras, habíamos establecido varios cultivos derivados de clones de una sola célula de la ascitis maligna de un adenocarcinoma de ovario seroso paciente Grado IV. Diecinueve de éstas se sometieron a la inmortalización espontánea y se establecieron como líneas continuas. El clon A4 fue uno de estos clones. En sus pasajes iniciales, se ve que es lento en bicicleta y no cancerigeno Sin embargo, alrededor de 20-25 pasaje se transforma en un clon de manera agresiva tumorigénico con capacidades metastásicas. Estos datos sugieren que las células A4 primeros, aunque carece tumorigenecity ya habían adquirido algunas de las características de transformación. Por lo tanto nos referimos a ellas como siendo pre-transformado (A4-P), mientras que las células transformadas derivadas de células A4-P se denomina como A4-T. Esto nos proporcionó un modelo progresión adecuada de dos grupos de células funcionalmente discretas derivadas de un único clon en el tumor. perfiles proteoma de este modelo de progresión A4 resueltos a través de 2 dimensiones electroforesis en gel (2DE), seguido de la EM (MALDI-TOF /TOF) condujeron a la derivación de grupos específicos de la proteína en base a sus patrones de expresión exclusivos y diferenciales
.
caracterización de las redes funcionales definidos por dichas proteínas proporcionan una visión clara de la funcionalidad celular y alterado principales vías implicadas en la transformación de células de ovario. De éstos, modulada RXR-γ la diferenciación celular y la apoptosis eran exclusivos de las células pre-transformado. Modulación del metabolismo de retinol se ha sugerido en asociación con la progresión de EOC [15], [16] en el que disminuyó los niveles de CRBP1 (celular retinol-proteína de unión-1) se considera un paso crucial en la progresión del proceso de transformación [17]. Sin embargo, la relevancia precisa de la señalización de RXR-γ permanece en gran medida sin caracterizar. Se resolvieron su papel funcional en las células transformadas de nuestro modelo de progresión a través de la inducción de la expresión mediante el tratamiento con retinoides selectivos incluyendo 9
Cis
-retinoico (CRA), Adapalane (ADA) y 4 - [(E) - 2- (5,6,7,8-tetrahidro-5,5,8,8-tetrametil-2-naftalenil) -1-propenil] benzoico (TTNPB). Dicha modulación de la diferenciación celular y la apoptosis por RXR-γ en SeOvCa amplía aún más nuestra comprensión actual de la transformación celular.
Resultados
Análisis comparativo de expresión de proteínas de A4 y A4-P-T cáncer epitelial de ovario modelo de progresión
los funcionalmente diferentes células de cáncer de ovario epiteliales A4-P y A4-T exhiben un fenotipo distinto, con el primero ser mientras que el segundo parece epitelial-como en la morfología en forma de huso (Fig. 1A). 2-DE geles se prepararon usando muestras proteoma de células A4-P y A4-T. Dos conjuntos de técnicas de 2-DE geles analíticos fueron preparados de cada fenotipo en cada experimento, que se llevó a cabo por triplicado (un total de 6 repeticiones) y teñido con plata. Las imágenes escaneadas fueron procesados mediante PDQuest y proteínas con expresión diferencial fueron anotados. Un promedio, 400-500 manchas de proteínas diferenciales fueron así demarcadas. Anotación de puntos condujo a la obtención de conjuntos de proteínas en base a sus patrones de expresión de cada tipo de célula. Hacia identificación de la expresión diferencial de proteínas, manchas de proteínas seleccionadas fueron digeridos y los espectros de masas se generó en MS /MS análisis. software de GPS Explorer (v.3.6) se utiliza para enviar los datos de MS y MS /MS combinados de MALDI-TOF /TOF de Mascot contra la base de datos SwissProt. Por lo tanto todas las proteínas analizadas, la cobertura de secuencia razonable, bajo índice de errores de masas y de intervalos de alta confianza (IC ≥95%) fueron obtenidos.
A. Las diferencias morfológicas entre las células pre-A4 transformado (A4-P) y A4 transformadas (A4-T) (Bar 100 micras). B, tubería analítica; Panel de imágenes de gel-Representante inferiores que muestran las proteínas expresadas exclusivamente en las células A4-P (izquierda - EEx) y células T (A4-derecha - LEX). C, Diagrama de Venn que muestra proteínas clasifican en los 4 subgrupos. D.I-II, diagrama de sectores que muestra la funcionalidad molecular y vías asociadas con identificada A4-P y proteínas A4-T, respectivamente. E, la expresión de proteínas cuantitativa de vimentina, citoqueratina-8 y citoqueratina-18; los datos mostrados son representativos de 3 experimentos independientes representadas como media ± SEM *
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derivación de los grupos de proteínas basado en el patrón de expresión
MS /MS identificación de proteínas basada llevó a derivación de dos grupos de proteínas expresadas diferencialmente (Fig. 1B).
Grupo I
compuesto de proteínas que se expresan cualitativamente (exclusivamente) en cualquiera A4-P o A4-T (EEx denomina como Lex y proteínas, respectivamente), mientras que
Grupo II
incluye proteínas expresadas en cuantitativamente diferentes niveles (expresión diferencial mínimo de dos veces entre los dos tipos de células). Ambos grupos se dividieron en dos subgrupos en función de sus respectivas expresiones de tipos de células. Anotación de las expresiones cualitativas y cuantitativas se realizó dentro de cada conjunto de replicación de las células A4 y A4-P-T. Un total de 10 y 34
Grupo I
proteínas y, 31 y 48
Grupo II
proteínas fueron identificados como se expresa en A4-P y células A4-T, respectivamente (Figura 1C;. Tabla S1). Cuadros 1 & Amp; 2 enumera el identificada
Grupo I
y
proteínas Grupo II
con números de punto específico, descripción molecular y funcional, junto con los detalles de los partidos péptidos, proteínas, puntuación de cobertura de secuencia (%) y la expresión relativa pliegue de cambio.
Clasificación de las vías funcionales basados en ontologías reportados y validación de expresión
gene ontología análisis moleculares distintas funcionalidades se determinaron nuevos y vías asociadas con los perfiles de proteínas identificadas en los dos tipos de células (Fig. 1D.i). Por lo tanto, varios mecanismos reguladores celulares, incluyendo la biosíntesis de proteínas, la organización del citoesqueleto, la transducción de señales, regulación de la apoptosis y la degradación de proteínas se enriquecieron en gran parte en y contribuyeron a la funcionalidad de las células A4-P. Estos se sugiere tener una conversación cruzada con otras vías tales como proteínas y metabolismo de la energía, el metabolismo del RNA, la diferenciación celular y reacciones redox
.
A la inversa vías, agrupación funcional de las proteínas en las células A4-t situados asociados con las características clásicas de las células cancerosas
a saber
. resistencia a la apoptosis, el metabolismo energético, la proliferación celular, la angiogénesis y la invasión y metástasis (Fig. 1D.ii). Por lo tanto, las moléculas que participan en la biosíntesis de proteínas asociada con, plegamiento y el transporte de controlar el proceso dinámico de metabolismo de las proteínas en las células transformadas hacia búsqueda de sus actividades proliferativas.
Hacia confirmando niveles de algunas de las proteínas identificadas, sus expresiones fueron validados entre células A4-P y A4-T a través de inmunotransferencia (Fig 1E;. la Fig. 2A, B, C, D). SeOvCa es único en que, la transformación se asocia con la expresión de marcadores epiteliales [21]. vimentina expresión mejorada en las células A4-P sugieren mesenquimales mientras que los niveles elevados de citoqueratina 8 y 18 en las células A4-T se correlacionan con características epiteliales, respectivamente (Fig. 1E), además de estar en concordancia con su morfología celular y la hipótesis prevalente.
validación cuantitativa de la expresión y doble cambio de algunas proteínas, identificados en ambos grupos; I proteínas del grupo A, expresados exclusivamente en A4-P y B, en la celda A4-T, respectivamente; mientras que D, proteínas del grupo II-cuantitativamente hasta reguladas en las células A4-P y E, en A4-T. E. expresión relativa de RXR-γ y β-actina en CRA, ADA o TTNPB retinoides células tratadas A4-T (T) validados por medio de inmunotransferencia A4-P (P) y. F. La cuantificación de la expresión de RXR-γ relativa en A4 y A4-P-T células. El análisis estadístico que muestra la prueba de significancia (* -control A4-P y retinoides células tratadas; $ - células tratadas de control A4-P y retinoides) .Los datos mostrados son representativos de tres experimentos separados y se representa como media ± SEM *
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caracterización funcional de RXR-gamma una exclusiva Grupo I proteínas
Diez proteínas del grupo I se expresa exclusivamente en las células A4-P (proteínas EEx). anotación funcional basado en la literatura condujo a su categorizat iones en cuatro grupos funcionales
a saber
La diferenciación celular y la apoptosis -
RXR-γ, PRDX4;.
La proliferación celular CD - GNA11, PIBF-1, ANXA5, catepsina D (CTSD);
La mitosis y la citocinesis CD - KLH9;
transición epitelio-mesenquimal (EMT) CD -. TPM1, ANXA5
Si bien todas las funciones anteriores son relevantes en el proceso de transformación, nos hemos centrado en el estudio de la funcionalidad de la diferenciación celular y la apoptosis que es fundamental en el mantenimiento de la homeostasis del tejido y que se sabe están regulados por RXR-γ a nivel transcripcional por dimerización con ácido retinoico o receptores de ácido X retinoico (RAR o RXR, respectivamente) u otros socios heterodímero permisiva como PPAR-γ [22], [23 ], [24]. por lo tanto decidimos investigar el papel de RXR-γ en nuestro modelo de progresión del cáncer epitelial de ovario.
interacciones RXR-gamma con los receptores nucleares y la modulación de la diferenciación celular en células A4-P por tratamiento retinoides
tratamiento con retinoides niveles mejorados RXR-gamma en las células A4-P; y curiosamente, reanudado expresión significativa en células A4-T, así (Fig. 2E, F). CRA y ADA tratamiento individual elevados niveles de RXR-gamma en ambos tipos de células, aunque esta inducción fue menos eficaz en combinación con TTNPB. Hacia la validación de las interacciones RXR-gamma con otros receptores nucleares, co-inmunoprecipitación e inmunotransferencia interacciones afirmados con PPAR-γ, RAR-γ, RXR-α y RAR-α en las células pre-transformado (Fig. 3A, B). La evaluación de la participación de RXR-γ en la diferenciación celular se logró a través de perfiles de marcadores epiteliales E-cadherina (E-cad), citoqueratina 18 (CK-18) y mucina-1 (Muc-1) en la expresión génica y los niveles de proteína, en estado estacionario y en la exposición a los desastres naturales
a saber
. CRA y los retinoides sintéticos (ADA y TTNPB) (Fig. 3C). En el estado estacionario, se observó una menor expresión de E-Cad en las células A4-P. La expresión de E-Cad aumentó aún más con CRA y también con ADA; CRA es administrado solo o en combinación con ADA y TTNPB. Los niveles de E-Cad, CK18 y Muc-1 endógena eran más altos en las células A4-T. Synthetic ADA retinoide solo o en combinación con CRA upregulated expresión CK18 en ambos tipos de células. Aunque, el papel específico de TTNPB en la diferenciación celular es desconocida, el tratamiento TTNPB resultó en la regulación positiva de menor importancia de marcadores de diferenciación. Los tres marcadores se han mejorado en respuesta a la exposición de retinoides en células A4-P afirmando así la participación de RXR-γ en la modulación de la diferenciación celular. tratamiento con retinoides en las células A4-T resultó en la inducción de RXR-γ sin alteraciones significativas en los niveles de estas marcador de diferenciación epitelial en la expresión génica y los niveles de proteína (Figs. 3D, 3E).
A. Co-inmunoprecipitación (Co-IP) con RXR-γ que muestra eluyó inmunocomplejo mediante tinción con plata. B. Validación de RXR-γ que indica la interacción en el Co-IP con RXR-γ-γ con PPAR, RAR-γ, RXR-α y RAR-α en células A4-P validados por medio de inmunotransferencia. C. De perfiles de expresión de CK-18, Muc-1 y E-cadherina en la transcripción (Tr) y proteína (Pr) realizado por semi-cuantitativos RT-PCR e inmunotransferencia de CRA, ADA o TTNPB retinoides tratada A4-P (P) y A4-T células (T). D. La cuantificación de la expresión de ARNm de E-Cad, CK18 y marcadores de diferenciación epitelial MUC1 en A4-P (P; línea) y células A4-T (T; línea de trazos) en el tratamiento retinoides validado a través de RT-PCR. E. La cuantificación de la expresión de la proteína de E-Cad, CK18 y fabricantes de MUC1 en A4-P (P; línea) y células A4-T (T; línea de puntos) tras el tratamiento retinoides validadas a través de inmunotransferencia. Los datos mostrados son representativos de tres experimentos separados representados como media ± SEM *
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retinoides inducida por los niveles de RXR-gamma sensibilizar a las células transformadas hacia la apoptosis a través de la vía intrínseca
se evaluó Papel de RXR-γ en la mediación de la apoptosis en respuesta a los retinoides naturales y sintéticos (Fig . 4A). En el estado estacionario, la apoptosis fue significativamente menor en las células A4-T en comparación con células A4-P que indica la adquisición de resistencia a la apoptosis durante el proceso de transformación. La apoptosis se mejoró en ambos tipos de células por exposición a la CRA y ADA - ya sea solo o en combinación (figura 4B). Mientras TTNPB por sí mismo no inducir la muerte celular, en combinación con ADA y CRA que sensibiliza las células A4-T a la apoptosis. También se encontró la activación mediada por retinoides de expresión RXR-γ de correlacionar directamente con los niveles más altos de apoptosis (Fig. 2E, F). Estamos perfiladas expresión del factor de transcripción Snail (que antagoniza mediada por p53 señalización a través de la represión activa de las moléculas pro-apoptóticas PUMA /BBC3, ATM y PTEN en las células del cáncer de ovario bajo estrés favor de la supervivencia; [19]) para evaluar el efecto de RXR-γ llevó apoptosis en él. La caspasa 9, un marcador de apoptosis vía intrínseca, upregulated durante RXR-γ y la inducción de PPAR-γ y Bcl-2 como marcadores de la apoptosis [25]. Snail y Bcl-2 expresión se redujeron, mientras significativamente elevados de expresión de RXR-γ, PPAR-γ y la caspasa 9 fueron evidentes en tratamiento con retinoides (Fig. 4C, 4D, 4E). La expresión de estas moléculas se mejoró aún más en tratamiento con retinoides combinatoria. Nos probaron aún más los efectos de los retinoides en los perfiles del ciclo celular (Fig. S1A, 1B). Como era de esperar, las células en estado estacionario A4-T poseen más alta de S & amp; poblaciones G2 /M que las células A4-P que indican la proliferación activa. tratamiento CRA potencia la apoptosis, junto con G2 /M detención en las celdas A4-P, mientras ADA y TTNPB inducen solamente G2 /M detención. En los tratamientos combinatorios, CRA con ADA o la presencia de los tres retinoides induce una detención en G1 /S en las células transformadas.
A. datos del ensayo de Anexina V-FITC que muestran apoptosis en las células A4-P y A4-T en diferentes regímenes de tratamiento retinoides; donde. que no tiene tratamiento con retinoides, ii. tratado con CRA, iii. con ADA y iv. con ambos con tratamiento alternativo de otro retinoide sintético es decir, TTNPB. B. El análisis estadístico de ensayo de apoptosis que muestra apoptosis significativa entre ambos tipos de células en diferentes conjuntos de tratamiento con retinoides. C. Expresión análisis de RXR-γ, PPAR-γ, Bcl-2, caspasa 9 y el caracol en la transcripción (Tr.) Y el nivel de proteínas (Pr.) A través de RT-PCR e inmunotransferencia, respectivamente. D. La cuantificación de la expresión de ARNm, i. expresión de RXR-γ, PPAR-γ, caspasa 9, Bcl-2 y el caracol en el tratamiento retinoides en células A4-P mientras que, ii. muestra sus niveles en las células A4-T en la validación a través de RT-PCR. E. Cuantificación de la expresión de la proteína, i. expresiones de RXR-γ, PPAR-γ, caspasa 9, Bcl-2 y el caracol en las células A4-P mientras que, ii. espectáculos de sus niveles en las células A4-T en el momento del tratamiento retinoides validadas a través de inmunotransferencia.
En vivo tratamiento con retinoides reducir significativamente el crecimiento de xenoinjertos en ratones NOD-SCID través de RXR-γ mediada de sensibilización de las células transformadas hacia la apoptosis
Hemos ampliado aún más por encima de la re-sensibilización de los niveles de RXR-gamma en células T-A4 efectos obtenidos
in vitro
a los tumores experimentales (Fig. 5A). La media de volumen del tumor (Figs. 5B, 5C) en cada punto de tratamiento a lo largo de media el volumen del tumor y el peso en séptima semana (Figs. S1C, S1D) mostró una reducción significativa en tratados retinoides tumores ratones frente a los de DMSO tratados controles. En general, el tratamiento con retinoides combinatoria era más eficaz. Las expresiones RXR-gamma claramente aumentada en los tumores tratados con retinoides sugieren fuertemente sensibilización de las células transformadas A4 a la apoptosis. Se encontró efecto combinado de los retinoides para ser más letal para el crecimiento tumoral a través reanudado RXR-γ mediada por apoptosis de las células tumorales
in vivo
. los niveles de RXR-gamma se encontraron significativamente más alta en los 5 lotes incluyendo CRA, CRA & amp; TTNPB, ADA, ADA & amp; TTNPB y CRA, ADA & amp; TTNPB; en comparación con el control del vehículo DMSO. Se trata de una correlación definitiva con la estimulación de RXR-γ y la inducción de la apoptosis en estas células
in vitro gratis (Fig.5D).
A. Procedimiento experimental que ilustra los retinoides régimen de tratamiento en ratones NOD-SCID. Los ratones se observaron hasta 3 semanas hasta que el tamaño del tumor crece 25-30 mm
3, el tratamiento de DMSO, CRA, CRA + TTNPB, ADA, ADA + TTNBP y CRA + ADA + TTNBP comenzó el 4
ª semana y procedió hasta 7
ª semana. B. representación gráfica que muestra los volúmenes tumorales del control y retinoides tratados ratones NOD-SCID en diferentes puntos temporales. C. tamaños de los tumores de control comparativo de los retinoides y los tumores tratados. D. Expresión cuantitativa de RXR-γ en los tumores de control y tratados con retinoides validadas a través de inmunotransferencia. Los datos mostrados son representativos de tres experimentos separados (n = 6 para
in vivo
experimentos) y representan como media ± SEM *
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Discusión
La existencia de varios subtipos histológicos que se correlacionan con diferentes células (s) -de origen en el cáncer de ovario [26] sigue siendo un obstáculo en el establecimiento de modelos de progresión representativos en esta enfermedad. Esto está en contraste con otros tumores malignos tales como cáncer de próstata en los que tales modelos se han aplicado en las últimas dos décadas en la elucidación de los mecanismos moleculares de la enfermedad [1], [27], [28], [29]. En el presente estudio, detallado exclusivo y diferencial de perfiles de proteínas de un modelo de progresión establecida anteriormente en nuestro laboratorio proporcionan nuevos conocimientos sobre los patrones moleculares alterados durante la progresión SeOvCa. células A4-P con la inmortalidad replicativa representan una etapa pre-neoplásica mientras que las células A4-T con características agresivas y metastásicos son representativos de la transformación y progresión de la enfermedad.
Nuestros datos afirma que los dos estados funcionales del modelo se asocian con perfiles de proteínas distintas. Dentro del grupo de las proteínas exclusivos a las células A4-P, la caracterización de la función de RXR-γ reveló una sensibilidad de las células pre-transformado a la apoptosis y la diferenciación como se describió anteriormente [30]. Comprometidos niveles RXR-gamma también se presentan en varios tumores malignos, incluyendo el cáncer de pulmón de células no pequeñas [31]; donde también se ha informado de que el silenciamiento epigenético de RXR-γ se correlacionó con la disminución de la supervivencia global de los pacientes [32]. En nuestras células pre-transformado, RXR-γ coopera con PPAR-γ, RAR-γ, RAR-α y RXR-α para formar complejos heterodiméricos funcionales, donde RXR-γ con PPAR-γ coordina la apoptosis celular a través de la vía intrínseca confirmado con elevación de los niveles de caspasa-9. Además, se observó que la activación en las células transformadas RXRγ re-sensibiliza a la apoptosis como un efecto sinérgico de los agonistas que median efectos citotóxicos
in vitro
así como en tumores experimentales (Fig. 6). Esta es una identificación importante hacia la aplicación de las terapias basadas en retinoides. En este estudio, hemos caracterizado la naturaleza pleotropic de la señalización de RXR-γ en nuestro modelo de sistema SeOvCa de progresión. La pérdida de los niveles de RXR-gamma indicados para facilitar las prestaciones mecánicas a las células transformadas hacia la adquisición de resistencia a la apoptosis; en consecuencia, las células tumorales sensibilizadas con retinoides regulan al alza los niveles de RXR-gamma que conducen a la muerte celular significativa.
A. modulación RXR-γ en el estado estacionario en las células pre-transformado; tratamiento retinoides RXR-gamma aumenta los niveles y ampliar la apoptosis (tras la interacción de RXR-γ-γ con PPAR) y la expresión de marcadores específicos de diferenciación epitelial (en las interacciones RXR-gamma con RAR-γ, RXR-α y RAR-α). B. La deficiencia de RXR-γ proporcionar beneficios de resistencia a la apoptosis de las células transformadas; indujo niveles RXR-gamma de tratamiento retinoide sensibilizar a estas células hacia la apoptosis significativa.
El enfoque actual de la proteómica es una primera cuenta de los cambios en SeOvCa que reflejan en varias vías funcionales de transformación asociada. De manera significativa, la señalización de RXR-γ podría ser una puerta de enlace potencial en la prevención de la progresión de la enfermedad. La elucidación de la señalización de RXR-γ se extiende enfoques contemporáneos de la transformación celular en SeOvCa que ahora se pueden explotar aún más en el desarrollo y evaluación de nuevas modalidades terapéuticas.
Material y Métodos
Declaración de Ética
Todo el trabajo con animales se llevó a cabo con el Centro Nacional para la Ciencia la aprobación de la célula Comité de Ética Animal (NCCS) Institucional (AICE) de experimentos en las instalaciones de la NCCS Experimental Animal House (EAH), y se llevó a cabo de acuerdo con las normas, leyes y políticas establecido por el comité.
cultivo celular y transfecciones, tratamientos
Derivación del modelo de progresión de las células A4 SeOvCa pre-transformadas y transformadas (A4 A4-P y T-células) se describe anterior [14], [18]. Retinoides tratamiento (ligando RXR-γ) se llevó a cabo utilizando ya sea de retinoides naturales
viz
. 9
Cis
El ácido retinoico (CRA; 10 mM) o retinoides sintéticos adapaleno (ADA; 2 M; RAR agonista) o 4 - [(E) -2- (5,6,7,8 Tetrahidro - 5,5,8,8 tetrametil - 2 naftalenilo) - 1 propenil] ácido benzoico arotinoide ácido (TTBPB; 10μM; RXR y RAR agonista) durante 48 h
preparación de la muestra, electroforesis en gel en 2 dimensiones (. 2DE) y análisis de imagen
Los sedimentos celulares (10
7) de A4-P y A4-T se suspendieron en 500 l ml de tampón de lisis que contiene urea 8 M urea, 2 M tiourea, 100 mM de DTT , 2% CHAPS y 0,2% de anfolitos con cóctel inhibidor de la proteasa (Amersham Directriz USB). Se dejó que el extracto de la célula para ser mezclado durante al menos 15 minutos y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente para facilitar solublisation proteína adecuada. Las muestras de proteína se centrifugaron adicional (110,000g durante 1 hora a 4 ° C) y se recogió la suspensión. La concentración de proteína se estimó con el kit de quant 2DE (GE Healthcare) a 480 nm (Bekman Coulter). Las muestras preparadas se ejecutan en primera dimensión (pI) seguido de segunda dimensión en desnaturalizante SDS-PAGE (Mw). Un total de 350 g de proteína lisado de células enteras fue tomada en 18 cm inmovilizados gradiente de pH (IPG) de la tira (pH 4-7) y rehidratadas durante la noche. Un programa de tensión IEF tres pasos se preparó para las tiras en una célula Protean IEF (Bio-Rad): 50 V durante 20 minutos, 10.000 V durante 2 horas minutos y 10.000 V de 45.000 V-hr. Las tiras se reducen aún más por incubación en el tampón de equilibrado /reducción (6 M de urea, 0.375 M Tris pH 8,8, 2% SDS, 20% de glicerol, 2% (w /v) DTT (Sigma)) y después se alquila el mismo tampón pero que contiene 2,5% (w /v) yodoacetamida (Sigma) en lugar de la TDT. La segunda dimensión se llevó a cabo mediante la ejecución de las tiras IPG en 1,0 mm de espesor de 10% - (w /v) - SDS-PAGE. Los geles se tiñeron con espectrometría de masas compatibles azul de Coomassie modificado (Pierce, Thermo-Fisher) y tinción de plata. La adquisición de imágenes de gel de proteínas se realizó utilizando el software One ® Cantidad de sistema VersaDocTM (Bio-Rad Laboratories, EE.UU.) con los valores paramétricos iguales. El análisis de imágenes y detección de puntos se realizaron en PDQuest 2-DE software de análisis de versión avanzada 8.0 (Bio-Rad). Para la comparación punto cuantitativa y cualitativa a través de ambos geles, match-conjuntos (set master) de seis réplicas de A4 y A4-P-T-2DE geles se prepararon y analizaron. El software facilita la anotación de cada individuo y la mancha, se proporcionaron las identidades únicas para cada proteína puntos de gel de replicar. Un conjunto de análisis de proteínas han sido preparados para identificar puntos que son significativamente diferentes. Análisis conjunto se hicieron sobre la base de las proteínas identificadas lugares únicos a A4 y A4-P-T y los puntos comunes entre los dos grupos de replicación con un umbral de variación de 2,0 veces la cantidad. Una estimación total de puntos coincidentes y no coincidentes se preparó con las imágenes y las proteínas diferenciales definitiva se identificaron en el intervalo entre dos tipos de células geles representativos.
En la digestión-gel y la identificación de proteínas mediante MALDI-TOF /TOF
se seleccionaron puntos de proteínas en la Eco-2D muestran expresión diferencial y que cumplan los criterios estadísticos y extirpados para la digestión en gel y análisis más detallados MS. escisión contado se realiza manualmente con la ayuda de cortador punto afilado estéril. En resumen, los cortes de gel se destained en bicarbonato de amonio 25 mM, después se deshidrataron con una mezcla 02:01 de bicarbonato de amonio 50 mM: 100% de acetonitrilo (ACN) para repetidos 3 veces cada 5 minutos. cortes de gel se redujeron con DTT 10 mM a 60 ° C durante 1 hora. Después de enfriar, cortes de gel se incubaron durante 15 min a temperatura ambiente con ácido yodoacético 50 mM. Después del lavado y la deshidratación de los cortes de gel con bicarbonato de amonio 25 mM y ACN durante 10 min, se secaron al vacío y la digestión tríptica realizaron con bicarbonato de amonio 50 mM que contenía 20 ug /mL modificado tripsina grado proteómico (Sigma-Aldrich) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se mantuvo en hielo durante 30 min. Se añadió bicarbonato de amonio 25 mM adicional y la digestión se continuó durante una noche a 37 ° C. péptidos extraídos se secaron por completo utilizando un SpeedVac y re-suspendieron en 10 l de 20% de bicarbonato de amonio y solución de ácido fórmico al 1%.
Después de procesar a través de las puntas de pipeta Zip-Tip (Millipore, USA), mezclas de péptidos se disolvieron con una solución de matriz. La matriz utilizada para el análisis MALDI fue el ácido a-ciano-4-hidroxicinámico (Sigma) a 20 mg /ml en 50% de acetonitrilo, ácido trifluoroacético al 0,1%. Volúmenes iguales de solución de péptido y de la matriz se mezclaron, y 1 l de la solución resultante fue descubierto en una placa de muestra de MALDI de acero inoxidable. Spectra de péptidos digeridos se adquirieron en un espectrómetro de masas MALDI-TOF /TOF 4800 (AB Sciex, Framingham, MA) unido a 4000 software de la serie Explorer (versión 3.5.3). Los espectros de masas se registraron producidos en un modo de reflector dentro de un rango de masas 800 a 4000 Da, utilizando un láser de Nd: YAG de 355 nm. La tensión de voltaje de aceleración y la extracción se establecieron en 20 kV y 18 kV, respectivamente. Seis puntos de calibración del instrumento se realizó con el péptido kit estándar (AB Sciex). Todos los espectros de MS se obtuvieron de acumulación de 900 disparos. MS /MS espectros fueron adquiridos con una acumulación total de 1.500 disparos de láser y la energía de colisión de 1Kv. A la finalización de exploraciones estudio de EM, los datos se procesan para generar una lista de iones precursores para ser interrogado por MS /MS. Las listas de pico MS y MS /MS combinados se analizaron utilizando el GPS
TM Explorador de software de la versión 3.6 (AB Sciex). Identificación de proteínas se realizó mediante la búsqueda de iones MS /MS utilizando MASCOT (versión 2.1) del motor (http://www.martixscience.com) búsqueda contra la base de datos SwissProt.