Extracto
familia dominio de reclutamiento de caspasas, miembro 8 (CARD8) pueden coordinar inmune innata y adaptativa respuestas y sensibilizar a las células a la apoptosis, que pueden participar en la tumorigénesis del carcinoma inducido por el virus hepatocelular (HCC) y el cáncer de cuello de útero. Por análisis de la bioinformática, hemos identificado varios polimorfismos de nucleótido único (SNP) dentro de una nueva identificado a largo ARN no codificante (lncRNA) como loci de rasgos cuantitativos de expresión (eQTLs) para CARD8. En este estudio, por lo tanto, la hipótesis de que CARD8 eQTLs SNPs en lncRNA puede influir en el riesgo de carcinoma hepatocelular y cáncer de cuello uterino. Se realizó dos estudios de casos y controles independientes de 1.300 casos de CHC VHB-positivo y 1.344 controles normales, junto con 1.486 pacientes con cáncer de cuello uterino y 1.536 sujetos de control para probar la asociación entre eQTLs SNP (rs7248320) para CARD8 y el riesgo de HCC y de cuello de útero cáncer. El genotipo variante rs7248320 se asoció significativamente con un mayor riesgo de carcinoma hepatocelular y cáncer de cuello uterino [GG vs AA /GA: ajustado odds ratio (OR) = 1,28; intervalo de confianza del 95% (IC) = 1,03 a 1,61,
P
= 0,028 para el CHC; OR ajustada = 1,34 IC 95% = 1,09 a 1,66,
P = 0,006
para el cáncer de cuello de útero]. Por otra parte, el efecto de rs7248320 en el riesgo de cáncer de cuello uterino fue más prominente en las mujeres premenopáusicas. Un análisis más detallado interactiva detectó una interacción significativa de multiplicación entre rs7248320 y el estado menopáusico en el riesgo de cáncer de cuello uterino (
P = 0,018
). Estos hallazgos sugieren que CARD8 eQTLs SNP puede servir como un marcador de susceptibilidad para el CHC relacionado con el virus y el cáncer de cuello de útero
Visto:. Yin J, J, Wen, Delta D, Han J, J Jiang, Song C, et al . (2015) Expresión Quantitative Trait Loci de CARD8 contribuye al riesgo de dos cánceres-hepatocelular de infección relacionados con el carcinoma y el cáncer cervical. PLoS ONE 10 (7): e0132352. doi: 10.1371 /journal.pone.0132352
Editor: Yifeng Zhou, Facultad de Medicina de la Universidad Soochow, CHINA
Recibido: Marzo 31, 2015; Aceptado: June 14, 2015; Publicado: 6 Julio 2015
Derechos de Autor © 2015 Yin et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Fondo Nacional de Ciencias Naturales de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81172757); Fundación Nacional de Ciencia para Jóvenes Académicos Distinguidos de la China (81225020); Fondo Nacional de Ciencias Naturales de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81373079); Fundación de la provincia de Jiangsu para Distinguidos jóvenes estudiosos (BK2012042); Programa Nacional de Investigación Básica clave para jóvenes (2013CB911400); Fundación para el Programa para el Nuevo Siglo talentos excelentes en la Universidad (NCET-10-0178); Programa Nacional de Apoyo de primer nivel Jóvenes Profesionales; Provincia de Jiangsu Ciencia Clínica y Proyectos de Tecnología (BL2012008); Centro de Innovación de colaboración para la medicina personalizada del cáncer en la provincia de Jiangsu y la prioridad del programa académico para el Desarrollo de Instituciones de Educación Superior de Jiangsu (Salud Pública y Medicina Preventiva); Fondo Nacional de Ciencias Naturales de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (30901236); Fundación de Ciencias Naturales Pekín (7123225); Programa Nova Pekín (xx2012067); Fundación de Investigación Científica para la Devolución de estudiosos, Ministerio de Educación de China para la realización de la investigación y la preparación del artículo. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el carcinoma hepatocelular (HCC) y el cáncer de cuello uterino son dos cánceres más comunes en todo el mundo. En 2008, se estimó que más del 80% de los casos de cáncer cervical y carcinoma hepatocelular se produjo en los países en desarrollo, incluyendo a China [1,2]. Persistente del virus de la hepatitis B (VHB) y el virus del papiloma humano (VPH) han sido bien establecidos como factores de riesgo para el hígado [3] y el cáncer de cuello uterino [4]. Sin embargo, sólo una pequeña fracción de portadores persistentes virales eventualmente desarrollan cáncer, lo que sugiere que otros factores pueden influir en los resultados clínicos después de la infección por el virus. Se informó que el huésped variaciones genéticas desempeñan un papel crítico en la carcinogénesis del carcinoma hepatocelular y cáncer de cuello uterino [5,6].
La caspasa contratación de dominio de la familia, el elemento 8 (CARD8) representa un nuevo miembro de dominios de reclutamiento de caspasas-asociado (CARD) de la familia, que son módulos de interacción proteína-proteína que se encuentran ampliamente en proteínas que desempeñan un papel importante en la apoptosis y la activación del factor nuclear kappa-B (NFkB) [7]. Los defectos en la apoptosis se observan en prácticamente todos los tipos de cánceres humanos [8]. CARD8 puede suprimir la actividad de NFkB activado por mediadores de la inflamación [9]. Por otra parte, la activación de NFkB, un sello distintivo de la respuesta inflamatoria, se detecta con frecuencia en tumores y puede constituir un eslabón perdido entre la inflamación y el cáncer [10,11], y es fundamental en el desarrollo de los cánceres inducidos por virus, incluyendo HCC y el cáncer cervical [11-13]. Por ejemplo, la activación de la transducción de señales NFkB requiere la interacción entre la proteína de la hepatitis B virus X y AIB1 oncogén [14], y el virus del papiloma humano 16 E5 media la oncoproteína carcinogénesis cervical a través de la regulación de la COX-2 expresión a través de NFkB [11].
Long ARN no codificantes (lncRNAs) se definen como transcripciones no codificantes de proteínas más grandes de 200 nucleótidos. Controlan la expresión de genes en el núcleo mediante la modulación de la transcripción o a través de mecanismos de post-transcripcional de orientación el empalme, la estabilidad, o la traducción de los ARNm [15]. LncRNA AC008392.1 es uno de lncRNAs recientemente identificados, que se localiza en la región aguas arriba de CARD8 en el cromosoma decimonovena y se expresa en varias líneas de células tales como GM12878 (linfocitos B humanos) y HeLaS3 (células de cáncer cervical humano). Por análisis de la bioinformática, hemos identificado dos polimorfismos de nucleótido único (SNP) (rs7248320 y rs12459322) en AC008392.1 puede representar la expresión loci de rasgos cuantitativos (eQTLs) para CARD8 (http://www.regulomedb.org) [16]. Es posible que los SNPs influyen en la interacción entre AC008392.1 y CARD8, alterando así la expresión de CARD8. En este caso, la hipótesis de que CARD8 eQTLs SNPs pueden contribuir a modificar el riesgo de dos HCC relacionada con el virus y el cáncer de cuello uterino. Para probar nuestra hipótesis, se realizaron dos estudios independientes de casos y controles, entre ellos 1.300 casos con VHB-positivo HCC y 1.344 sujetos de control, así como 1.486 casos de cáncer de cuello uterino y 1.536 sujetos de control para evaluar las asociaciones entre eQTLs SNPs para CARD8 y la susceptibilidad de los dos tipos de cáncer.
Materiales y Métodos
sujetos de estudio
Este estudio fue aprobado por el comité de ética del Instituto de cáncer y el hospital de la Academia china de Ciencias médicas y de la Universidad de Medicina de Nanjing . Todos los participantes prestan su consentimiento informado por escrito para participar en este estudio y los comités de ética aprobados este procedimiento de consentimiento. la inscripción de los sujetos fue descrito anteriormente [17-20].
En resumen, los pacientes con HCC fueron reclutados consecutivamente entre enero de 2006 y diciembre de 2010 en el Hospital de tumor Nantong, Instituto de Cáncer de hígado Qidong, y el Hospital Afiliado de la Primera Nanjing Universidad de Medicina de la provincia de Jiangsu, china. El diagnóstico de HCC fue corroborada por un examen patológico y /o elevación de alfa-fetoproteína (& gt; 400 ng /ml) y la resonancia magnética y /o tomografía computarizada. Debido a que la infección por VHC es poco frecuente en la población china, se excluyeron los pacientes con HCC con infección por el VHC. Como resultado, los pacientes con HCC 1.300 HBV-positivos consentimiento para participar en el estudio. Entre septiembre de 2009 marzo de 2010, 149,172 habitantes, que residían en cincuenta y dos pueblos de la provincia de Jiangsu, China por lo menos un año completo, se inscribieron en un estudio transversal basado en la comunidad. Entre ellos, un total de 11.474 participantes eran HBsAg seropositivos. Posteriormente, de septiembre a noviembre de 2010, 8.006 personas (69,8%, 8006/11474) que accedieron a seguir regularmente cada 1-2 años fueron llamados y se comprueban seromarkers virus de la hepatitis, una vez más. Por último, 7.250 individuos que eran seropositivos HBsAg con la recolección de muestras dos veces en al menos 6 meses de intervalo, negativos para el VHC y que tiene la información de la terapia antiviral se inscribieron la cohorte basado en la comunidad. Entre ellos, se seleccionaron al azar un total de 1.344 sujetos como los controles sirvieron como grupo de comparación de casos de CHC. Todos los controles fueron VHB portadores persistentes que fueron positivos tanto para el antígeno de superficie del VHB (HBsAg) y el anticuerpo contra el antígeno central de la hepatitis B (anti-HBc), pero negativo para anticuerpos HCV (anti-HCV). No hay antecedentes de vacunación contra el VHB se informó en estos temas. Estos controles seleccionados fueron agrupados a los casos de CHC en la edad (± 5 años) y el género, y declararon sin malignidad anterior.
Para el estudio del cáncer de cuello uterino, los 1.486 pacientes con cáncer de cuello uterino confirmado histológicamente fueron reclutados consecutivamente entre marzo 2006 a diciembre de 2010, desde el hospital de Tumores Nantong y el primer hospital Afiliado de la Universidad médica de Nanjing, Jiangsu, china. Los 1.536 controles también fueron seleccionados al azar del grupo de control a más de 40.000 personas que tomaron parte en otro programa de cribado basado en la comunidad para las enfermedades no infecciosas llevadas a cabo en la provincia de Jiangsu con la tasa de seguimiento del 98,1%. Los controles fueron emparejados por la frecuencia de los casos de la edad (± 5 años). Todos los controles que no tenían antecedentes de cáncer de auto-reporte.
Después se obtuvo el consentimiento informado por escrito, cada participante fue programado para una entrevista utilizando un cuestionario estructurado para recopilar información sobre los datos demográficos, historia menstrual y reproductiva, y historia de la exposición del medio ambiente. Los individuos que fumaban un cigarrillo al día durante más de 1 año se definieron como los fumadores y los que consumían una o más bebidas alcohólicas por semana durante más de 6 meses fueron clasificados como bebedores de alcohol. Todos los pacientes y controles fueron sin relación étnicos chinos Han. Después de la entrevista, se recogió una muestra de sangre venosa de aproximadamente 5 ml de cada participante (HCC paciente, enfermo de cáncer de cuello uterino y de control).
serológica Exámenes
HBsAg, anti-HBc y anti-VHC fueron detectados a partir de suero de cada participante mediante el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (kehua Bio-Engineering Co., Ltd., Shanghai, china) siguiendo las instrucciones del fabricante, tal como se describe anteriormente [17].
Selección de SNPs y Genotipado
sobre la base de los datos de la base de datos UCSC (GRCh37 /hg19), base de datos Regulome y los criterios de frecuencia menor alelo (MAF) & gt; 0,05 en los chinos Han, encontramos dos SNPs eQTLs comunes para CARD8 en alrededores lncRNA AC008392.1. Los dos CARD8 eQTLs (SNP rs12459322 y rs7248320) se encuentran en alto desequilibrio de ligamiento (LD) (D '= 1,000). Por lo tanto, se optó por rs7248320 SNP como el etiquetado. ADN genómico fue extraído de un pellet de leucocitos por proteinasa K tradicional digestión y seguido por extracción con fenol-cloroformo y precipitación con etanol. rs7248320 SNP se genotipo utilizando la plataforma Sequenom IPLEX MassARRAY (Sequenom Inc). La información sobre los cebadores se muestra en la Tabla 1. La genotipificación se realizó a ciegas sin conocer la situación de la causa o el control. Dos controles en blanco (agua) en cada placa de 384 pocillos se utilizaron para el control de calidad y más de 10% de las muestras fueron seleccionadas al azar para ser repetida, dando una tasa de concordancia del 100%.
Análisis estadístico
las diferencias de las características demográficas y las frecuencias de genotipo SNP rs7248320 de entre los casos y los controles se calcularon mediante la prueba t de Student (para variables continuas) y χ
2 de prueba (para las variables categóricas). Las asociaciones entre los genotipos y los riesgos de cáncer se estimaron mediante el cálculo de la odds ratio (OR) y sus intervalos de confianza del 95% (IC) a partir de los análisis de regresión logística. La heterogeneidad de las asociaciones entre los subgrupos fue evaluada por el basado en 2
Q
prueba χ
. Todos los análisis estadísticos se realizaron con el software R (versión 2.13.0; La Fundación de R estadística). Todas las pruebas fueron de dos caras y el criterio de significación estadística se estableció en
P Hotel & lt; 0.05.
Resultados
Las características demográficas de la 1.300 pacientes con HBV positivo HCC y 1.344 sujetos de control, y 1.486 pacientes con cáncer de cuello uterino y 1.536 sujetos control fueron descritas anteriormente (Tablas 2 y 3) [ ,,,0],17-20]. No hubo diferencias significativas en la proporción de la edad, el sexo y el tabaquismo entre los casos y los controles de HCC. Sin embargo, la proporción de consumo de alcohol fue significativamente más alta en los casos de HCC que en los controles (
P
& lt; 0,001). En comparación con los sujetos control, los pacientes con cáncer cervical tuvieron significativamente mayor proporción de fumadores (
P Hotel & lt; 0,001), el estado premenopáusico (
P
= 0,002), y el mayor número de partos (
P
= 0,001).
las distribuciones de genotipo de rs7248320 en los pacientes y controles se muestran en la Tabla 4. las frecuencias genotípicas de rs7248320 estaban en equilibrio de Hardy-Weinberg en los controles (
P = 0,718
para los controles de HCC y
P = 0,343
para los controles de cáncer de cuello uterino). En los modelos de regresión logística multivariante, rs7248320 variante de genotipo GG se asoció con un mayor riesgo de HCC por 1,28 veces (IC 95% = 1,03 a 1,61,
P = 0,028
) en comparación con los genotipos AA /GA. Del mismo modo, el genotipo GG aumentó el riesgo de cáncer de cuello uterino por 1,34 veces (IC 95% = 1,09 a 1,66,
P
= 0,006) en comparación con los genotipos AA /GA (Tabla 4).
la asociación entre rs7248320 y el riesgo de HCC se examina más adelante en el análisis estratificado (Tabla 5). En el modelo recesivo, el efecto de riesgo para rs7248320 fue ligeramente más prominente en sujetos más jóvenes (≤ 53 años), los sujetos masculinos, y los que habían fumado nunca. Sin embargo, prueba de heterogeneidad no fue significativa para estos estratos. Tabla 6 muestra la asociación de rs7248320 con el riesgo de cáncer de cuello uterino. Aunque el efecto de riesgo para rs7248320 fue ligeramente más pronunciada entre las mujeres más jóvenes (≤ 53 años), los sujetos que nunca habían fumado, los sujetos que no tenían antecedentes familiares de cualquier tipo de cáncer, y menos de paridad (0 ~ 1), sin heterogeneidad entre estos estratos fue observado. Curiosamente, se observó un efecto más fuerte de riesgo de rs7248320 entre las mujeres premenopáusicas (OR ajustada = 1,82; IC del 95% = 1,33-2,48) (
P = 0,014
para la prueba de heterogeneidad). Por su posterior análisis interactivo, se observó una interacción significativa de multiplicación entre rs7248320 y el estado menopáusico para el riesgo de cáncer de cuello uterino (
P = 0,018
). El análisis cruzado sugerido que, en comparación con la menopausia las mujeres con genotipos AA /GA, las mujeres premenopáusicas con genotipo GG tenían el mayor riesgo de cáncer de cuello uterino (OR ajustada = 3,18; IC del 95% = 2,24 a 4,52,
P Hotel & lt; 0,001) (Tabla 7).
Discusión
En estos dos estudios de casos y controles independientes, se investigó la asociación entre rs7248320 y la susceptibilidad de HCC y cáncer de cuello uterino de una población china. Encontramos que SNP rs7248320 eQTLs para CARD8 se asoció con el aumento del riesgo de carcinoma hepatocelular y cáncer de cuello uterino. Por otra parte, también se observó una interacción significativa de multiplicación entre rs7248320 y el estado menopáusico para el riesgo de cáncer de cuello uterino.
Dado que el proyecto ENCODE y análisis de RNA-seq han identificado miles de nuevos lncRNAs, las variantes genéticas y la función biológica de lncRNAs son cada punto caliente en el estudio de enfermedades complejas. Varios estudios informaron que varios lncRNAs se dysregulated en el CHC y el cáncer de cuello de útero, como HOTAIR y MEG3 [21-25]. Además, ya se ha informado de que ZNRD1 eQTLs SNP aumentó el riesgo de HCC [20]. LncRNA AC008392.1 localiza en la región aguas arriba de CARD8, lo que puede influir en la expresión de CARD8. Un estudio previo mostró que el genotipo variante rs7248320 y rs12459322 se asoció con la baja expresión de CARD8 en monocitos [26]. Hay pruebas que sugieren que CARD8 es un regulador negativo de la activación de NFkB, lo que resulta en la supresión de inmune e inflamatoria [27,28]. Además, la reducción de CARD8 sugiere una disminución de la defensa anti-apoptótica [29]. La activación de la señalización de NFkB contribuye a la carcinogénesis y promueve pronóstico de la enfermedad y la metástasis en HCC y el cáncer cervical [30-34]. Por lo tanto, el GG variante genotipo de rs7248320 en lncRNA AC008392.1 puede estar asociada con la activación de NFkB y la inhibición de la apoptosis a través de la baja regulación de CARD8, y por lo tanto promover el desarrollo y progresión del cáncer relacionada con la infección, incluyendo HCC y el cáncer cervical, el cual era consistente con el efecto del riesgo de la GG variante rs7248320 genotipo en los resultados de nuestro estudio.
Hay varias limitaciones del estudio, que necesitan ser resueltos en la investigación ulterior. En primer lugar, se realizó el estudio de casos y controles para una sola etapa sin validación. Se requieren más estudios a gran escala para la validación de las asociaciones entre rs7248320 en AC008392.1 y el riesgo de carcinoma hepatocelular y cáncer de cuello uterino. En segundo lugar, la función biológica de los dos SNPs eQTLs en AC008392.1 no se investigó adicionalmente en este estudio. Las asociaciones entre los SNPs y el riesgo de carcinoma hepatocelular y cáncer de cuello uterino deben ser interpretados con precaución. Si bien, en nuestro estudio anterior [20], encontramos ZNRD1 (dominio de zinc cinta que contiene 1) rs3757328 eQTLs SNP en ZNRD1-AS1 (ZNRD1 antisentido de ARN 1) se asoció con un mayor riesgo para el CHC, y más eQTLs resultados de los análisis indicaron la asociación significativa entre los genotipos de rs3757328 y la expresión de ZNRD1 y ZNRD1-AS1. En experimentos in vitro también mostraron que ZNRD1 knockdown inhibió la expresión de mRNA HBV y promovió la proliferación de las células HepG2.2.15. Teniendo en cuenta que los resultados de nuestro estudio anterior [20], la hipótesis de que lncRNA AC008392.1 podría regular la expresión de la proteína relacionada (CARD8) por sí sola la variación y con ello influir en la aparición y desarrollo de tumores hepáticos y tumores de cuello uterino. En tercer lugar, la infección por VPH, la causa principal y necesaria de cáncer de cuello uterino, no se detectó en las muestras cervicales. Y la interacción entre el tipo de VPH y rs7248320 no se pudo evaluar en la carcinogénesis cervical.
Para nuestro conocimiento, este es el primer estudio que investiga la asociación de CARD8 eQTLs SNPs en el lncRNA AC008392.1 con el riesgo de HCC y cáncer de cuello uterino. Con una población relativamente grande, este estudio reveló que la variante GG genotipo de rs7248320 en lncRNA AC008392.1 influyó en el riesgo de dos cánceres-HCC y el cáncer cervical relacionados con virus. El GG variante genotipo combinado con el estado premenopáusico fortaleció el efecto de riesgo. Estos resultados sugieren que rs7248320 AC008392.1 podrían servir como un marcador de susceptibilidad para el CHC y el cáncer de cuello uterino. Otros estudios utilizando diversas poblaciones y ensayos funcionales están garantizados para validar y ampliar nuestros hallazgos.