Extracto
Antecedentes
El cáncer de próstata (CaP) es el cáncer más frecuentemente diagnosticado en los hombres de América del Norte. la terapia de privación de andrógenos (ADT) acentúa la infiltración de células inmunes dentro de la próstata. Sin embargo, las vías inmunosupresores regulados por los andrógenos en el CaP no están bien caracterizadas. Arginase 2 (ARG2) la expresión por células de CaP conduce a una activación reducida de las células T específicas de tumor. Nuestra hipótesis era que los andrógenos podrían regular la expresión de ARG2 por células de CaP.
Metodología /Principales conclusiones
En este informe, se demuestra que tanto ARG1 y ARG2 se expresan mediante sensible a hormonas (SA ) y (líneas HR) de células CaP refractarios a las hormonas, con las células LNCaP que tienen la actividad más alta de la arginasa. En muestras de tejido de próstata, ARG2 fue más expresa en tejidos normales y no malignas prostáticas en comparación con tejidos tumorales. Después de la estimulación de andrógenos de las células LNCaP con 10 nM R1881, tanto ARG1 y ARG2 se sobreexpresa. La regulación de la expresión de arginasa después de la estimulación de andrógenos era dependiente de la del receptor de andrógenos (AR), como un tratamiento de siRNA dirigidos a la AR inhibió tanto ARG1 y la sobreexpresión ARG2. Esta observación se correlacionó
in vivo
en los pacientes mediante técnicas de inmunohistoquímica. Los pacientes tratados por ADT antes de la cirugía tuvieron expresión ARG2 inferior en ambos tejidos no malignos y malignos. Por otra parte, ARG1 y ARG2 eran enzimáticamente activa y su disminución de la expresión de siRNA resultó en reducción de la actividad de la arginasa y L-arginina metabolismo en general. La disminución de la expresión ARG1 y ARG2 también tradujo con el crecimiento celular células LNCaP disminución y el aumento de la activación de PBMC después de la exposición a las células LNCaP medios condicionados. Finalmente, se encontró que la interleuquina-8 (IL-8) también se upregulated después de la estimulación androgénica y que aumenta directamente la expresión de ARG1 y ARG2 en ausencia de andrógenos.
Conclusión /Importancia
Nuestros datos proporciona la primera detallada
in vitro Opiniones y en
In vivo
cuenta de una vía inmunosupresor regulada por andrógenos en el CaP humano a través de la expresión de arg1, ARG2 e IL-8.
Visto: Gannon PO, Godin-Ethier J, M Hassler, Delvoye N, M Aversa, Poisson AO, et al. (2010) La expresión regulada-andrógenos de la arginasa 1, 2 arginasa y la interleucina-8 en el cáncer de próstata humano. PLoS ONE 5 (8): e12107. doi: 10.1371 /journal.pone.0012107
Editor: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 17 Marzo, 2010; Aceptado: July 6, 2010; Publicado: 11 Agosto 2010
Derechos de Autor © 2010 Gannon et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. La investigación fue apoyado por una beca de investigación Sanofi Aventis (FS), por un premio de investigación Uro-Oncology Group /AstraZeneca Canadá (FS) y por una beca de la Fundación de investigación de próstata cáncer de Canadá (RL). Los proveedores de fondos no tiene función alguna en el diseño del estudio, la recogida de datos y análisis, el intercambio de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. Además, F.S. sostiene la Universidad de Montreal Cátedra de cáncer de próstata. R. L. es apoyado por una beca del Fonds de recherche en santé du Québec (FRSQ). P.O.G. es un receptor de un Ph.D. beca de la FRSQ y recibió apoyo adicional del cáncer de Institut du Montréal /Canderel beca y del programa de Biología Molecular de la Universidad de Montreal
Conflicto de intereses:. Este proyecto fue financiado en parte por una investigación de Sanofi Aventis subvención (FS) y por un premio de investigación Uro-Oncology Group /AstraZeneca Canadá (FS). Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
El cáncer de próstata (CaP) es el cáncer más frecuentemente diagnosticado y la tercera causa principal de cáncer muertes relacionadas para los hombres de América del Norte [1]. la organogénesis y la carcinogénesis de la próstata dependen de la presencia de andrógenos [2]. Como tal, la modalidad de tratamiento más común para hombres con una fase avanzada o CaP recurrente es la terapia de privación de andrógenos (ADT). ADT conduce a la apoptosis de la hormona sensible células epiteliales de la próstata [3]. Por desgracia, de uno a cinco años siguientes a la iniciación de ADT, la mayoría de los pacientes desarrollan CaP hormono-refractario (CPRH), cuyo tratamiento sigue siendo paliativa [4]. Nuevas modalidades de tratamiento, tales como la inmunoterapia, intento de abordar estas etapas posteriores de CaP. Sin embargo, las inmunoterapias actuales contra CaP se han traducido en un éxito limitado en los entornos clínicos. Una comprensión detallada del microambiente tumoral inmunológica en pacientes con cáncer de próstata debería proporcionar nuevos conocimientos sobre la forma de mejorar los protocolos actuales de base inmunológica.
Los datos recientes demuestran que diversos mecanismos inmunosupresores están presentes dentro de la próstata y pueden obstaculizar la lucha contra la respuesta inmune tumoral en el contexto de una inmunoterapia (revisado en [5]). Arginase 2 (ARG2) se expresa en PCa humana [6] y su inhibición, concomitante con iNOS, aumenta la activación de los linfocitos infiltrantes de tumor (TIL) [7]. Mientras que las propiedades inmunosupresoras de arginasas a través del metabolismo de la L-arginina están bien documentados (revisado en [8]), la regulación de la expresión de la arginasa humana, sin embargo, no está definida actualmente.
Los andrógenos se sabe que tienen propiedades inmunosupresoras , que se ilustra por la inflamación intra-prostática siguiente ADT [9], [10]. La expresión de genes análisis y estudios murinos sugieren que los andrógenos regulan la expresión de ARG2 y otras enzimas de la vía de poliamina [11], [12], [13]. Por lo tanto, teniendo en cuenta las funciones fundamentales de los andrógenos en la carcinogénesis de próstata y en la escultura del microambiente de la próstata, se evaluó si los andrógenos podrían regular la expresión de células de CaP arginasas por
in vitro
y
in vivo
.
En este estudio, mostramos que las líneas celulares de CaP expresan tanto ARG1 funcionalmente activa y ARG2. Curiosamente, sensible a las hormonas (SA) y la hormona refractaria (HR) tejidos expresó ARG2 menos que los tejidos no malignos. En la línea celular LNCaP del SA, la estimulación de andrógenos condujo a la expresión aumentada de tanto ARG1 y ARG2 en un receptor de andrógenos (AR) de manera dependiente. Esta expresión regulada por andrógenos también se observó en el tumor primario de los pacientes tratados con ADT que expresaron menos ARG2 tanto en los tejidos no malignos adyacentes al tumor y los tejidos tumorales en comparación con los pacientes control. Finalmente, descubrimos que la IL-8 también fue regulada por andrógenos bajo el control de la AR, y participó en la regulación de la expresión ARG1 y ARG2. En conjunto, nuestros datos proporcionan la primera detallada
in vitro Opiniones y en
in vivo
cuenta de una vía inmunosupresor regulada por andrógenos en el CaP humano.
Resultados
ARG1 expresión y ARG2 en el CaP
en primer lugar, la expresión evaluada arginasas partir de líneas celulares de CaP y muestras clínicas. Nuestros datos demuestran que las líneas celulares de CaP expresan tanto ARG1 y ARG2. La expresión génica análisis de qPCR demostró que
ARG1
ARNm fue más abundante en la línea celular 22Rv1 (Figura 1 A), mientras que la proteína ARG1 fue un poco más expresada por las dos líneas celulares (HR CaP Du145 y PC3) que en el células LNCaP (Figura 1B, panel inferior). expresión de la proteína ARG1 no se correlacionó con el análisis de la expresión génica que sugiere una posible regulación post-transcripcional. En cuanto a la expresión ARG2, la línea celular LNCaP expresa los más altos niveles de
ARG2
ARNm (Figura 1A). Bajo
ARG2
expresión de mRNA se detectó en las dos líneas celulares DU145 y PC3 HR en comparación con las dos líneas celulares SA CaP. ARG2 abundancia de proteínas se correlacionó con la qPCR resultados con células LNCaP que expresan significativamente más ARG2 que las otras tres líneas celulares (Figura 1B, panel inferior). Además, las células LNCaP tuvieron la mayor actividad de la arginasa lo que sugiere que ARG2 es la enzima predominante con respecto a la actividad de la arginasa de células de CaP (Figura 1B, panel superior).
líneas celulares de CaP (LNCaP, 22Rv1, DU145 y PC3) se mantuvieron en RPMI suplementado con 10% FBS. A) La expresión de genes de
ARG1 gratis (panel izquierdo) y
ARG2 gratis (panel derecho). expresión relativa media (n = 3) con el error estándar de la media (barras de error). B) Panel superior: la actividad de arginasa de líneas celulares de CaP cuantificados en mU /mg de proteínas. Panel inferior: transferencia de Western de ARG1 y ARG2. Ran sirvió como control de carga. C) imagen representativa de la tinción inmunohistoquímica de la expresión ARG2 en el tejido prostático. Tenga en cuenta que la expresión de ARG2 se limitaba a las células epiteliales sin tinción estromal. D) Cuantificación de la expresión ARG2 por inmunohistoquímica en muestras de próstata. * Diferencia estadísticamente significativa en la expresión ARG2 entre PIN y de recursos humanos tejidos (p = 0,033, Mann-T). ** Diferencia estadísticamente significativa en la expresión ARG2 entre los tejidos tumorales y tejidos normales (p & lt; 0,001, Mann-U), tejidos no malignos adyacentes al tumor (p & lt; 0,01, Mann-U) y tejidos PIN (p & lt; 0,001, Mann U).
la expresión de la proteína ARG2 se evaluó en muestras clínicas mediante técnicas de inmunohistoquímica en tres diferentes micro-arrays de tejido (TMA) de reagrupamiento muestras de próstata a partir de una cohorte de 99 pacientes con CaP y 50 de la próstata normal, obtenido mediante autopsias. No se evalúa la expresión de proteínas ARG1 como, en nuestras manos, los anticuerpos anti-ARG1 probados no eran adecuados para inmunohistoquímica en tejidos incluidos en parafina fijado en formol archivados. Hemos observado que la expresión ARG2 fue restringido al epitelio de la próstata y ausente de la estroma (Figura 1C). ARG2 fue estadísticamente significativamente menos expresa en los tejidos tumorales en comparación con normal (p & lt; 0,001, Mann-U), a no maligno adyacente normal (p & lt; 0,01, Mann-U) y a próstata neoplasia intraepitelial (PIN) de tejidos (p & lt; 0,001 , Mann-U) (Figura 1D). tejidos de recursos humanos también expresaron menos ARG2, aunque sólo significativamente diferentes de tejidos PIN (p = 0,033, Mann-T). No hubo correlación entre la expresión ARG2 dentro de los tejidos adyacentes normales y tumorales (Tabla S1). Por último, se evaluó si la expresión ARG2 correlacionado con los parámetros clínico-patológicas tales como la puntuación de Gleason, antígeno prostático específico preoperatorio niveles (PSA) y la recurrencia bioquímica. Nuestros resultados muestran que la expresión ARG2 dentro del tejido normal adyacente inversamente correlacionada con la vesícula seminal invasión (Tabla S1). En conjunto, estos
in vitro
y
in vivo
datos demuestran la expresión diferencial de ARG1 y ARG2 entre las diversas etapas de la progresión del CaP, independientemente del estado de los recursos humanos.
andrógenos expresión regulada de ARG1 y ARG2
La expresión diferencial de ARG1 y ARG2 entre las líneas celulares del SA y HR CaP nos llevó a investigar las funciones de regulación de andrógenos en la expresión de la arginasa. Para ello, se evaluaron arginasas expresión génica y proteica después de la estimulación androgénica.
ARG1
expresión mRNA no fue estadísticamente significativamente upregulated en cualquiera 22Rv1 líneas celulares después de la estimulación R1881 (Figura 2A) o LNCaP. Sin embargo, en las células LNCaP,
ARG2
la expresión de ARNm se incrementó a las 48 horas (p = 0,002, Mann-U) y a las 72 horas (p = 0,016, Mann-U) del panel después de la estimulación R1881 (izquierda, Figura 2B). La sobreexpresión de
ARG2
en 22Rv1 no fue estadísticamente significativa (p = 0,248, Mann-U) (panel derecho, Figura 2B). De hecho,
ARG2
expresión correlaciona con la mayor sensibilidad de andrógenos de las células LNCaP en comparación con 22Rv1 (Figura S1 A). Como tal, se utilizaron células LNCaP para experimentos adicionales. Corroborando los datos de PCR, transferencias de Western de células LNCaP demostraron que la estimulación R1881 aumento de la expresión de proteínas ARG2 (Figura 2C). Curiosamente, aunque no se observaron cambios significativos en
ARG1
la expresión del ARNm en células LNCaP tratadas con R1881, la expresión de proteínas ARG1 se incrementó significativamente. No se observó ningún aumento en ARG1 o proteína ARG2 expresión en DU145 y PC3 estimulados con 10 nM de R1881 (Figura S1B).
AB) células LNCaP (paneles de la izquierda) y 22Rv1 (paneles de la derecha) se estimularon durante un período de 72 horas con 10 nM R1881 después de un período de incubación de 72 horas en medios con carbón vegetal y la expresión génica de a)
ARG1
y B)
ARG2
analizó por qPCR. De control (barras de color gris claro) y estimuladas con R1881 (barras negras). * Diferencia estadísticamente significativa (p & lt; 0,05, Mann-U). La media de la expresión relativa (n = 4) con el error estándar (barras de error). C) El aumento de la expresión de proteínas tanto de ARG1 y ARG2 después de la estimulación R1881 por Western blot. células LNCaP se estimularon con 10 nM R1881 tal como se describe anteriormente. PSA sirvió como control positivo. experimento representativo, (n = 6). D) La inhibición de la actividad de AR con bicalutamida (Casodex). células LNCaP fueron estimuladas con R1881 durante 72 horas como se describió anteriormente en presencia de dosis crecientes de bicalutamida (0, 10, 20 y 40 mM). ARG1 y los niveles de expresión ARG2 se evaluaron por transferencia de Western. se muestra experimento representativo, (n = 3). Tenga en cuenta el efecto agonista de bicalutamida en ausencia de R1881 se ilustra por un aumento de la expresión de PSA y ARG2. E) La inhibición de la expresión de AR de siRNA. células LNCaP fueron transfectadas como se describió anteriormente. AR, los niveles de expresión y ARG1 ARG2 se evaluaron por transferencia de Western. se muestra experimento representativo, (n = 4). F) la actividad de arginasa se cuantificó en mU /mg de proteínas. células LNCaP fueron transfectadas con siCTRL (luz barras grises) o SIAR (barras negras) y después se estimularon con R1881 durante 72 horas como se describió anteriormente. experimento representativo, (n = 3).
La AR está implicado en ARG1 y expresión ARG2
A medida que nuestros resultados sugieren que los andrógenos regulan la expresión de la arginasa, se evaluó la contribución de la AR . Nos inhibió la actividad de AR con la bicalutamida no esteroide anti-andrógenos (Casodex) (Figura 2D). Hemos observado una disminución de expresión de ARG1 con la concentración más alta (40 mM) de bicalutamida después de la estimulación R1881. La inducción de andrógenos ARG2 no fue bloqueado, incluso a la concentración más alta de bicalutamida. Como se ha documentado anteriormente [14], se observó que la bicalutamida tenía una actividad AR-agonista en células LNCaP cultivadas en ausencia de andrógenos. Hubo una inducción R1881-independiente de PSA y expresión ARG2 en las células LNCaP estimuladas con 20 M y 40 M de bicalutamida en ausencia de andrógenos. En esta misma condición, bicalutamida causó una disminución en la expresión ARG1. Estos resultados sugieren que la expresión ARG1 puede ser más sensible a la inhibición de AR ARG2, cuya expresión se indujo por el efecto agnóstico del inhibidor de la AR.
Decidimos para inhibir aún más la AR mediante el bloqueo de la expresión AR en las células LNCaP usando siRNA. La presencia de siRNA contra de la AR resultó en una inhibición significativa de la expresión del RA y en una expresión de PSA reducido tras la estimulación R1881 (Figura 2E). Tanto el ARG1 y la inducción después de la estimulación ARG2 R1881 fueron inhibidos por el tratamiento siRNA, que se tradujo en la ausencia de una regulación al alza de la actividad de arginasa (Figura 2F). Estos resultados sugieren que la AR regula la expresión de ARG1 y ARG2
in vitro
y que ARG1 y ARG2 tener una sensibilidad diferente a la inhibición de AR.
ARG2 expresión disminuida en pacientes con CaP siguiente ADT
en base a nuestra
in vitro
de datos, la hipótesis de que los andrógenos podrían modular la expresión de proteínas en pacientes con CaP ARG2 también. Hemos observado que, en comparación con el control de pacientes con cáncer (sólo la cirugía) pacientes (ADT antes de la cirugía) tenía expresión ARG2 significativamente menor tanto en los tejidos no malignos adyacentes al tumor (46,4 vs 23,5 unidades relativas, ADT tratados; p & lt; 0,001 , Mann-U) y los tejidos tumorales (41,7 vs 31,5 unidades relativas; p & lt; 0,01, Mann-U) (Figura 3A). También observó que la privación de andrógenos
in vitro
podría disminuir ARG2, pero no la expresión de proteínas arg1, en LNCaP y 22Rv1 células cultivadas durante siete días en ausencia de andrógenos (Figura 3B). Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que los andrógenos regulan la expresión de ARG2
in vivo
en pacientes con CaP como ADT reduce la expresión ARG2.
A) Análisis de la expresión ARG2 regulada por andrógenos en pacientes con CaP mediante técnicas de inmunohistoquímica . Los pacientes de control (barras de color gris claro, n = 40) y pacientes tratados con ADT (barras negras, n = 35). B) Disminución de la expresión de la proteína ARG2 en ausencia de andrógenos
in vitro
determinados por Western blot. Ran sirvió como control de carga. líneas celulares de CaP (LNCaP, 22Rv1, DU145 y PC3) se mantuvieron en RPMI 10% FBS o en RPMI suplementado con 10% de carbón despojado FBS durante 7 días (n = 3). Tenga en cuenta que la expresión ARG1 no varió pero que ARG2 se redujo en las células LNCaP y 22Rv1 en ausencia de andrógenos.
ARG1 y ARG2 son metabólicamente activas
Para evaluar si ARG1 y ARG2 expresado por las células LNCaP fueron metabólicamente activo, se inhibió la expresión de cualquiera de ARG1 o ARG2 por siRNA. En comparación con un siCTRL, tanto siRNA ARG1 o expresión ARG2 inhibió significativamente (Figura 4A). La inhibición de cualquiera de ARG1 o ARG2 dio lugar a disminución de la actividad enzimática de la arginasa (Figura 4B). Por HPLC, se determinó entonces el impacto de la inhibición de la expresión ARG1 y ARG2 sobre el metabolismo de L-arginina por células LNCaP. La ausencia de cualquiera de ARG1 o ARG2 condujo a mayores concentraciones de L-arginina en el medio condicionado que sugiere un menor metabolismo de la L-arginina por células LNCaP (Figura 4C). Además, hemos observado que la estimulación R1881 condujo a una disminución de la concentración extracelular de L-arginina, lo que corrobora los resultados que demuestra una expresión de la arginasa aumentado después de la estimulación androgénica. Se evaluó la expresión de la óxido nítrico sintasa (NOS), también conocido para metabolizar la L-arginina. Sin embargo, no se observó la expresión de la iNOS o nNOS (proteína), así como no hay producción de NO (función) en nuestro modelo (datos no mostrados).
células LNCaP fueron transfectadas ya sea con un siCTRL o una cóctel de tres siRNA contra el ARG1 o ARG2. Después de la transfección (24 horas), las células se sembraron en medio suplementado suero tratado con carbón vegetal durante 72 horas y después se estimularon durante 72 horas con 10 nM R1881. A) la inhibición de siRNA ARG1 y ARG2 expresión se evaluó mediante Western Blot. se muestra experimento representativo, (n = 4). B) Disminución de la actividad de la arginasa después de la transfección con siARG1 o siARG2 en células LNCaP. El Western blot correspondiente se muestra en el panel inferior. se muestra experimento representativo, (n = 3). C) Disminución del metabolismo de la L-arginina en la ausencia de expresión de la arginasa. Los medios condicionados de células LNCaP transfectadas con siCTRL, siARG1 o siARG2 se analizaron por HPLC para la concentración de L-arginina. El medio acondicionado se analizó por HPLC eran de las células LNCaP que se presentan en la Figura 4A. * Diferencia estadísticamente significativa (p & lt; 0,05, Mann-U). D) Disminución de la proliferación de células LNCaP en ausencia de la expresión de la arginasa. células LNCaP fueron transfectadas como se describió anteriormente. La proliferación se midió por recuento de células 96 horas después de la transfección. * Diferencia estadísticamente significativa (p & lt; 0,05, Mann-U), (n = 3). E) La inhibición de la ARG2 causas de expresión aumentó la proliferación de PBMC y de activación. PBMCs de donantes normales se activaron con anti-CD3 (OKT3, 1 mg /ml) con o sin IL-2 en presencia de medio fresco o medios de comunicación de las células LNCaP transfectadas con cualquiera de control, siCTRL, siARG1 o siARG2 acondicionado como se describió anteriormente. PBMCs de control se incubaron con el control de isotipo IgG (1 mg /ml) y con PBS en lugar de IL-2. Panel izquierdo: la proliferación de PBMC se cuantificó la incorporación de BrdU después de 120 horas de OKT3 e IL-2 estimulación. absorbancia media (n = 4) se muestra con error estándar (barras de error). Panel derecho: la secreción de PBMC de IFN-γ cuantificado por ELISA. El mismo experimento como se describe anteriormente, pero las PBMCs se activaron durante 24 horas sin IL-2. Se muestra la expresión representativa (n = 4) con el error estándar de la media (barras de error).
Como arginasas están implicados en la vía de síntesis de poliaminas necesaria para la proliferación celular, se evaluó el impacto de ARG1 y ARG2 sobre el crecimiento celular. Hemos observado que la inhibición de cualquiera de ARG1 o expresión ARG2 resultó en una proliferación de células LNCaP inferior mantenido en medio completo (p = 0,02 y p = 0,01, respectivamente, para siARG1 y siARG2) (Figura 4D). Además, con el fin de estudiar si ARG1 y expresión ARG2 por las células LNCaP afectados su potencial inmunosupresor, PBMCs de donantes sanos fueron activadas en presencia de medio acondicionado de LNCaP + siCTRL o LNCaP + siARG1 o LNCaP + siARG2. La inhibición de cualquiera de ARG1 o ARG2 traducido en un aumento de la proliferación de PBMC como se cuantifica la incorporación de BrdU (Figura 4E, panel izquierdo). aumento de esta proliferación se asoció con una elevada secreción de IFN-γ por las PBMC medido por ELISA (Figura 4E, panel derecho). No se observaron variaciones significativas en la secreción de IL-2 o IL-10 (datos no presentados). Por último, se evaluó si la expresión ARG2 correlacionada con el infiltrado inmune de las células del tumor primario que hemos publicado recientemente [10]. Hemos observado que la expresión ARG2 se correlaciona inversamente con la infiltración de linfocitos T y macrófagos dentro de la próstata (Tabla S2). En conjunto, estos resultados sugieren que ARG1 y arg2 expresado por las células LNCaP son enzimáticamente activas y participan en procesos fisiológicos importantes tales como la proliferación celular y la inmunosupresión derivado del tumor.
inducción de IL-8 de ARG1 y expresión ARG2
Como están bien documentados arginasas para participar en la escultura del microambiente inmunológica del tumor [15] y que las citoquinas son conocidos por inducir la expresión de la arginasa en modelos murinos [16], se evaluó si las citoquinas también podrían regular la expresión de la arginasa en PCa humana . El perfil de expresión de citocinas de las células LNCaP estimuladas con 10 nM de R1881 se evaluó cualitativamente utilizando una matriz de citoquinas Proteoma Profiler (R & amp; D Systems) (Figura 5A). Los datos proteómicos ilustran que las células LNCaP estimuladas con R1881 habían aumento de la expresión de IL-8 y Serpin E1 (Figura S2A). Además, investigó el papel de IL-8 en la expresión de la arginasa como IL-8 se ha vinculado recientemente a la expresión de genes regulada por andrógenos en el CaP [17]. de este modo se cuantificó la expresión elevada de IL-8 en células LNCaP siguiente expresión R1881 (Figura 5B). Esta IL-8 de inducción era dependiente de la AR como la inhibición de la expresión de AR de siRNA impedido IL-8 secreción después de la estimulación de andrógenos (Figura 5C). A continuación, evaluó si la inhibición de IL-8 podría disminuir ARG1 y ARG2 expresión después de la estimulación R1881. El uso de un siRNA contra IL-8, podríamos disminuir significativamente la secreción de IL-8 (Figura 5D). Esta reducción de la producción de IL-8 se asoció con una reducción de ARG1 y ARG2 24 horas después de la estimulación R1881 (Figura 5E). El tratamiento de las células LNCaP con Siil-8 también se tradujo en una disminución de la actividad de la arginasa (Figura S2B). Finalmente, se estimularon las células LNCaP andrógeno-privada con aumento de la concentración de IL-8 exógeno durante 72 horas y se controló la expresión de ARG1 y ARG2. Por análisis de transferencia de Western, se observó que tanto 50 ng /ml y 100 ng /ml de IL-8 inducida por la expresión de ARG1 y ARG2 en comparación con las células control LNCaP (Figura 5F). La disminución de la expresión de la proteína ARG1 y ARG2 con 250 ng /ml de IL-8 se correlacionaron con IL-8 inducida por la toxicidad celular. También se observó una inducción de
ARG2
, pero no
ARG1
, la expresión génica después de una estimulación de 24 horas (Figura S2C). Por último, como lo fue informado anteriormente que el rojo de fenol podría activar la AR [18], también estimularon las células LNCaP con IL-8 en los medios de fenol libre de rojo RPMI. Estos experimentos de control demostraron que la inducción de IL-8 dependiente de ARG1 y ARG2 podría ocurrir en ausencia de rojo de fenol (Figura S2D). En conjunto, los datos muestran claramente que los andrógenos regulan la expresión de IL-8, que en sí mismo puede inducir la expresión de tanto ARG1 y ARG2.
Evaluación del perfil de la expresión de citoquinas de las células LNCaP después de la estimulación R1881. A) Los medios condicionados de células LNCaP estimuladas como se ha descrito anteriormente se analizaron con un proteoma Profiler ™ (R & amp; D Systems). B) Se analizaron los medios condicionados de las células LNCaP estimuladas con el tiempo, ya sea con el control de etanol (luz barras grises) y R1881 (barras negras) para la producción de IL-8 por ELISA. El experimento representativo mostró se realizó con el mismo medio condicionado utilizado para el análisis del proteoma de perfiles en 5a, (n = 3). C) Cuantificación de la secreción de IL-8 por las células LNCaP transfectadas con SIAR y estimuladas con R1881 tal como se describe anteriormente. se muestra experimento representativo, (n = 3). D) La cuantificación de IL-8 secreción por las células LNCaP transfectadas con Siil-8 y se estimularon con R1881 tal como se describe anteriormente. se muestra experimento representativo, (n = 3). Para 5b y 5c, no había IL-8 secreción detectado en ausencia de estimulación R1881. E) Expresión de ARG1 y ARG2 en células LNCaP después de la transfección de la estimulación Siil-8 y R1881 durante 24 horas. se muestra experimento representativo, (n = 3). F) células LNCaP se sembraron en medio suplementado suero tratado con carbón vegetal durante 72 horas y durante 24 horas en RPMI libre de suero. Las células fueron estimuladas durante 72 horas con 10 nM de R1881 o con 50, 100 o 250 ng /ml de IL-8 en RPMI libre de suero. ARG1 y los niveles de expresión ARG2 se detectaron por transferencia de Western. experimento representativo, (n = 3). Tenga en cuenta la inducción de tanto ARG1 y ARG2 a 50 y 100 ng /ml de IL-8 de concentración en ausencia de R1881.
Discusión
Una minuciosa comprensión más inmunológica de la próstata mecanismos microambiente pueden mejorar la eficacia clínica de inmunoterapias actuales contra el CaP. Nosotros y otros han demostrado que ADT conduce a cambios drásticos en la próstata microambiente inmunológico [9], [10]. La vía de la arginasa participa en el desarrollo de un estado de inmunosupresión en el tumor primario de pacientes con CaP [7]. Sin embargo, la regulación de la expresión de la arginasa por células de CaP aún no está definido.
En este informe, se observó que los andrógenos inducen la expresión de ambos ARG1 y ARG2 en líneas celulares de CaP SA. La AR fue implicado en este reglamento como bicalutamida y SIAR transfección ARG1 impedido y la sobreexpresión ARG2 después de la estimulación R1881. Recíprocamente, la privación de andrógenos y ADT una expresión reducida ARG2
in vitro Opiniones y en el tumor primario de pacientes con CaP, respectivamente. células LNCaP expresan ARG1 enzimáticamente funcional y ARG2 que, una vez se inhibió su expresión de la proteína, causó una disminución en la proliferación celular y en su potencial inmunosupresor. Por último, hemos demostrado que la IL-8 también estaba regulado por R1881 y podría estimular la expresión de ARG1 y ARG2 independiente de andrógenos. En conjunto, nuestros resultados proporcionan la primera evidencia de una vía mecanicista inmunosupresor andrógenos impulsada en el CP a través de la expresión de arg1, ARG2 e IL-8 por las células de CaP.
Se demuestra que las células de CaP expresan tanto ARG1 y ARG2. ARG2 se expresó principalmente por las líneas celulares de CaP SA y por tejidos de la próstata no malignas. Estos resultados corroboran los datos que describen una expresión ARG2 inferior en líneas de andrógenos insensible CaP celulares (DU145 y PC3) y en los tejidos tumorales y de recursos humanos de pacientes con CaP publicados [6], [19]. Sin embargo, hasta donde sabemos, somos el primer grupo para estudiar la expresión de ARG1 por células de CaP y definir las consecuencias mecánicas que conducen a su inducción regulada por andrógenos. Similar a ARG2, inhibición de la expresión ARG1 condujo a la disminución de la proliferación celular del tumor, disminución del metabolismo de la L-arginina y la reducción de su potencial inmunosupresor. Sobre la base de la expresión de la proteína (Figura 1B, panel inferior) y en la actividad de la arginasa de células de CaP (Figura 1B, panel superior), nuestros datos sugieren que ARG2 puede, no obstante, tener un papel más prominente que ARG1 en el potencial de actividad de la arginasa de células de CaP [20].
Además, nuestros datos muestran que ARG1 y ARG2 fueron diferencialmente regulados por los andrógenos. Contrariamente a ARG2 gen y la expresión de proteínas, hemos demostrado claramente que la expresión de genes y proteínas de ARG1 no se correlacionó. Esto sugiere que los andrógenos pueden influir en una regulación post-transcripcional de ARG1 como se informó anteriormente en Xenopus [21] y en modelos de levadura [22]. Dado que la expresión ARG2 se localiza en las mitocondrias, se evaluó si la proliferación celular independiente de los andrógenos podría inducir la expresión ARG2 en las células LNCaP. En un ensayo de proliferación con EGF en lugar de R1881, no se observó inducción ARG2 (datos no mostrados). En conjunto, nuestros resultados revelan que, aunque ambos inducida por R1881, las vías de señalización que conducen a ARG1 y expresión ARG2 son diferentes para las dos enzimas y necesitan ser examinado más a fondo.
La implicación de una expresión regulada por andrógenos de ARG1 y ARG2 en la carcinogénesis de próstata requiere una mayor investigación. la expresión de la arginasa y la síntesis de poliaminas son elevados en el CP [23], [24] y asociados con el grado del tumor [25]. Una alta actividad de la arginasa se correlaciona con aumento de la proliferación de cáncer de mama [26], cáncer de colon [27] y las líneas celulares de riñón [28]. Sin embargo, se observó que los tejidos tumorales o de recursos humanos expresan menos ARG2 que los tejidos no malignos. Es posible que las células tumorales no adquieren la expresión de estas enzimas como un medio para explotar aún más su potencial inmunosupresor, un aspecto asociado con la progresión del tumor. De hecho, ya que la próstata es el órgano con la mayor producción de poliamina, la expresión de la arginasa por células de la próstata puede preceder el desarrollo de cáncer, como la producción de poliaminas es esencial para la proliferación de las células de la próstata. Por lo tanto, la ventaja inmunosupresor adquirida por células de la próstata puede ser secundario a la función proliferativa desempeñado por las arginasas. A partir de nuestros datos y la de los demás, que postula que la arginasa puede estar implicado en las primeras etapas sensibles a las hormonas de la carcinogénesis prostática mediante la promoción de la proliferación de células cancerosas y el desarrollo de un entorno inmunosupresor regulada por andrógenos.
Finalmente, observó que la IL-8 se upregulated después de la estimulación de andrógenos y podría inducir la expresión de ARG1 y ARG2. IL-8 media sus efectos a través de la activación de dos receptores de alta afinidad acoplados a proteína G, CXCR1 y CXCR2 [29], los cuales son expresados por las células LNCaP [30], [31]. Es importante tener en cuenta que la expresión de ARG1 y ARG2 siguiente IL-8 estimulación no fue tan importante como la estimulación con R1881 lo que sugiere que otras vías de andrógenos reguladas podrían estar involucrados.