Extracto
El control de radioresistance y potencial metastásico de las células cancerosas supervivientes es importante para mejorar la erradicación del cáncer por la irradiación craneal. El homeobox2 distal-less (
DLX2
) gen codifica para un factor de transcripción homeobox implicada en la morfogénesis y su desregulación fue encontrado en tumores sólidos humanos y malignidades hematológicas. Aquí se investigó el papel de DLX2 en asociación con epitelial inducido por la radiación de transición mesenquimal (EMT) y el vástago de propiedades de células y su regulación por Smad2 /3 de señalización en el A549 irradiado y MDA-MB-231 líneas celulares de cáncer humano. En A549 irradiado y las células MDA-MB-231, EMT se indujo como se ha demostrado por la expresión EMT marcador, la fosforilación de Smad2 /3, y capacidad migratoria e invasiva. Además, se irradia A549 y MDA-MB-231 células mostraron un aumento de las células madre del cáncer marcador (CSC). Curiosamente, DLX2 se sobreexpresa tras la irradiación. Por lo tanto, hemos examinado el papel de DLX2 en EMT y radioresistance inducida por radiación. La sobreexpresión de DLX2 EMT inducida por sí solo, la migración y la invasión, y la expresión de marcadores de CSC. La capacidad de formación de colonias reducida en células irradiadas fue parcialmente restaurada por la sobreexpresión DLX2. Por otro lado, el agotamiento de DLX2 utilizando si-RNA abolió EMT inducida por radiación, la expresión del marcador CSC, y la fosforilación de Smad2 /3 en A549 irradiado y las células MDA-MB-231. Además, el agotamiento de DLX2 aumentó la sensibilidad a la radiación en ambas líneas celulares. Por otra parte, desmontables de Smad2 /3, un activador clave de la vía de TGF-β1, abrogó la expresión DLX2 inducida por la radiación, lo que indica que la expresión DLX2 inducida por la radiación depende de Smad2 /3 de señalización. Estos resultados demostraron que DLX2 juega un papel crucial en radioresistance, EMT inducida por la radiación y la expresión de marcadores de CSC, y la expresión de DLX2 está regulada por Smad2 /3 de señalización en A549 y líneas de células MDA-MB-231.
cita: Expresión regulada-3 Choi YJ, Baek GY, Parque HR, Jo SK, Jung T (2016) Smad2 /de DLX2 está asociado con la radiación inducida por epitelio-mesenquimal transición y radioresistance de A549 y celulares de cáncer humano MDA-MB-231 Líneas. PLoS ONE 11 (1): e0147343. doi: 10.1371 /journal.pone.0147343
Editor: Aamir Ahmad, Escuela de Medicina de la Universidad Estatal de Wayne, Estados Unidos |
Recibido: Abril 8, 2015; Aceptado: 31 de diciembre de 2015; Publicado: 22 Enero 2016
Derechos de Autor © 2016 Choi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:.. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) subvención financiados por el gobierno de Corea (MSIP) (núm 2013M2A2A7043663)
Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la radioterapia es uno de los tratamientos más comunes para el cáncer, pero una de sus limitaciones es que algunos de sobrevivir el cáncer las células pueden obtener radioresistance [1] y la capacidad metastásica [2] después de la radioterapia repetido. La presencia de transición epitelial a mesenquimal (EMT) y las células madre del cáncer (CSC) ha sido implicado como una causa putativa de radioresistance tumor en los pacientes [2]. CSC son una población distinta de células tumorales con propiedades de auto-renovación y regeneración, y se han identificado en diversos tumores malignos humanos [3, 4, 5]. Los CSC muestran características típicas de la EMT [6, 7], y EMT se asocia de nuevo con radioresistance [8, 9]. Por esta razón, la investigación y desarrollo de biomarcadores predictivos y estrategia terapéutica blanco de CSC y EMT son especialmente importantes para la evaluación de pronóstico y mejora la radiosensibilidad en la terapia de radiación [10, 11]. marcadores CSC representativos incluyen Oct4, Sox2, barra /[12, 13, 14], y los informes recientes han identificado en particular CD44 como un biomarcador potencial relacionado con el CSC para la irradiación craneal en el pulmón y de mama células del cáncer [15, 16, 17].
En proceso de EMT de las células cancerosas, las expresiones de los genes epiteliales tales como e-cadherina y Vinculina son inhibidas, mientras que la expresión de los genes mesenquimales tales como N-cadherina y vimentina se han mejorado [18, 19, 20 ]. Como resultado de la EMT, las células adquieren propiedades metastásicas, incluyendo la pérdida de inhibición por contacto, el control del crecimiento desordenado, y la invasividad agresivo [18, 21]. EMT está regulada por factores de transcripción incluyendo Caracol, Twist, y ZEB [7, 22, 23, 24]. Las metaloproteinasas de matriz (MMPs) son también importantes mediadores de la EMT, que se descomponen ECM y permiten la migración y la invasión de células de cáncer a sitios distantes resultantes en la metástasis del tumor [25].
en una condición normal, actos TGF-beta como un supresor de tumores, pero también es conocido como promotor EMT y de apoyo a la angiogénesis en la última etapa de la tumorigénesis [26]. Recientemente, varios informes mostraron que IR promueve EMT a través de la señalización de TGF-β Smad-dependiente en líneas celulares de cáncer [6, 27, 28]. En vía de TGF-β, los receptores de TGF-ß reconocen ligandos y desencadenan la fosforilación de proteínas Smad asociadas al receptor (Smad2 /3) que se asocian con Smad4. Smad2 /3/4 complejos se acumulan en el núcleo y participan en la regulación de la expresión de genes diana [29].
Vertebrados homeobox2 distal-less (DLX2) actúa como un factor de transcripción homeo-cuadro y tiene un papel crucial en el desarrollo embrionario, el desarrollo craneofacial, la homeostasis del tejido. De acuerdo con informes recientes, se encontró que la desregulación de DLX2 en tumores sólidos humanos y las neoplasias malignas hematológicas [30, 31, 32], y se especula DLX2 estar implicado en la progresión tumoral a través de la regulación de la necrosis inducida por el estrés metabólico [33]. Por otra parte, DLX2 sí mismo es un gen diana de Smad dependiente de la señalización de TGF-β y actúa como un factor negativo votaciones de TGF-β de señalización [34]. Estos estudios nos hacen para centrarse en el papel potencial de DLX2 en la adquisición de CSC y características de la EMT a través de la señalización de TGF-β Smad dependiente en las células cancerosas tratadas con IR.
En este estudio, hemos investigado el papel de DLX2 en asociación con propiedades de células madre y transición epitelial a mesenquimal (EMT) y su regulación por Smad2 /3 de señalización en células de cáncer de pulmón humano A549 irradiados y MDA-MB-231 células de cáncer de mama humano. Presentamos aquí que IR indujo la expresión de DLX2 través de la activación de Smad2 /3, y DLX2 promovió la migración y la invasión, y radioresistance en A549 y líneas de células MDA-MB-231.
Materiales y Métodos
Los anticuerpos
Los anticuerpos contra DLX2, Smad2 /3, CD44, β-catenina, N-cadherina y e-cadherina se adquirieron de Thermo Scientific (Rockford, IL, EE.UU.). Anti-Snail, anti-vimentina y anticuerpos anti-vinculina se adquirieron de Tecnologías de Señalización Celular (Danvers, MA, EE.UU.). Un anticuerpo 3 /anti-pSmad2 se adquirió de Kerafast, Inc. (Boston, MA, EE.UU.). anticuerpo anti-β-actina fue adquirido de Santa Cruz de Biotecnología (Santa Cruz, CA, EE.UU.).
Cultivo de células y la irradiación
A549 (línea celular de cáncer de pulmón de células no pequeñas humano) y MDA-MB-231 (línea celular de cáncer de mama humano) fueron adquiridos de la célula de Corea line Bank (Seúl, Corea). Las células se mantuvieron en RPMI1640 suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS; Hyclone, UT, EE.UU.), 100 U /ml de penicilina, 100 mg /ml de estreptomicina a 37 ° C en una atmósfera humidificada 5% de CO
2 atmósfera. Las células se separaron de la placa de cultivo utilizando 0,25% de tripsina y se diluyeron a 1,5 × 10
5 células /ml. Las células se irradian con
137Cs los rayos gamma usando un Exactor Gammacell 40 (MDS Nordion, Ontario, Canada) en el KAERI y luego re-chapada en placas de cultivo o cámaras.
Construcción del vector de sobreexpresión DLX2 y transfección
Una inserción de DLX2 humana se amplificó a partir de pCMV-Sports6 /DLX2 (Corea del Banco de Genes humanos, Seúl, Corea) mediante PCR utilizando los siguientes cebadores:
EcoRI gratis (forward): 5 '-CGGAATTC ATGACTGGAGTCTTTGAC-3' y
Xho
I (inversión): 5'-CTCTGAGT TTAGAAAATCGTCCCCG-3 '. inserciones Dlx2 se clonó en el vector pcDNA3-myc que permite la expresión de la proteína etiquetada con c-myc en células de mamífero. a continuación, pcDNA3-myc /DLX2 o pcDNA3-myc fue entregado a las células (4 g /2,5 × 10
5 células) usando HilyMax (Dojindo Molecular Technologies, Rockville, ML, EE.UU.) reactivo de transfección de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de la incubación durante 24 h, se separaron y se irradiaron las células.
-pequeños ARN de interferencia (siRNA) transfección
El DLX2 si-ARN focalización y Smad2 /3 fueron adquiridos de Santa Cruz de Biotecnología ( Santa Cruz, CA, EE.UU.). Para la transfección, se sembraron las células y se cultivaron a 70 hasta 90% de confluencia. luego objetivo de Si-ARN o control negativo si-Ct fue entregado a las células (SI-DLX2: 50 micras /2.5 × 10
5 células; si-Smad2 /3: 100 M /2,5 × 10
5 células) usando el reactivo de transfección HilyMax de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de la incubación durante 24 h, se separaron las células y se irradiaron.
extracción de RNA y cuantitativa en tiempo real PCR
Después de 24 h de irradiación, extractos de ARN total (1 × 10
6 células ) fueron aislados por el reactivo Trizol (Ambion, Carlsbad, CA, EE.UU.) según el protocolo del fabricante. La transcripción inversa se llevó a cabo para la síntesis de ADNc mediante RT TOPscript DryMIX que contiene la transcriptasa inversa, RT buffer, mezcla de dNTP, Oligo dT (Enzynomics, Seúl, Corea). Cuantitativa en tiempo real PCR se realizó por un StepOne Real-Time PCR (Applied Biosystems, CA, EE.UU.) con SYBR Green reactivo (Enzynomics, Seúl, Corea). Los cebadores fueron diseñados utilizando Primer-BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) y las secuencias se presentan en la Tabla 1. El volumen total de reacción de la mezcla de PCR fue de 20 l, y la reacción las condiciones eran 15 min de desnaturalización inicial a 95 ° C y 40 ciclos de 10 segundos a 95 ° C, 15 seg a 60 ° C y 20 seg a 72 ° C. La comparativa C
t método fue utilizado y el nivel de expresión de mRNA relativa se calculó sobre la base de la normalización de ß-actina. Todos los experimentos se repitieron en tres veces de forma independiente.
ensayo clonogénico
Independiente células se expusieron a varias dosis de irradiación y se incubaron durante 7 días (A549) y 10 días (MDA-MB -231) a 37 ° C. El medio de todas las culturas se renueva cada 3 días. Las colonias se fijaron con 60% de metanol y se tiñeron con 0,5% de cristal violeta. Las colonias que contienen 50 o más células se contaron como células por clonación. Los valores de fracción de supervivencia reportados son la media de seis repeticiones de tres experimentos independientes.
La migración de células de ensayo
Para medir su migración, irradiado A549 y MDA-MB-231 células fueron sembradas en un transwell (Corning Incorporated, NY, EE.UU.) a una densidad de 2,5 × 10
4 células /pocillo en 200 l de medio libre de suero y se incubaron durante 7 h (A549) o 3 h (MDA-MB-231) en 37 DO. Después de la incubación, se retiró el medio. Las células se fijaron mediante incubación con 100% de metanol y se tiñeron con 0,5% de cristal violeta durante 15 minutos. La membrana se corta de cada cámara y las células migraron en la superficie inferior del filtro se contaron por filtro en microscópica aleatoria presentada con una ampliación de 200 veces (Leica, Heidelberg, Alemania). Los valores reportados son la media de tres experimentos independientes.
invasión de la célula de ensayo
La capacidad de A549 irradiado y las células MDA-MB-231 para pasar a través de filtros matrigel recubierto se midió en un Boyden ensayo de invasión de cámara. Matrigel se aplicó a la parte superior de un filtro de policarbonato (tamaño de poro, 8 micras). ensayos de invasión de la célula se realizaron usando un kit de ensayo de invasión de Matrigel (BD Biosciences, Bedford, MA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células se sembraron en la cámara superior a una densidad de 2,5 a 5 × 10
4 células /pocillo en 500 l de medio libre de suero y se incubaron durante 48 h (A549), 24 h (MDA-MB-231 ) a 37 ° C. Las células que invadieron la superficie inferior de cada membrana se fijaron con metanol al 100% y se tiñeron con 0,5% de cristal violeta durante 15 minutos. La membrana se corta de cada cámara y células invadidas en la superficie inferior del filtro se contaron por filtro en microscópica aleatoria presentada con una ampliación de 100 veces (Leica, Heidelberg, Alemania). Los valores presentados son la media de tres experimentos independientes.
Western blot
Después de 24 h de irradiación, lisados de células totales (2 × 10
6 células) usando tampón de lisis RIPA (Thermo Scientific, Rockford, IL, EE.UU.) que contiene phenylmethanesulphonylfluoride 10 mM (PMSF), 10 mM de fluoruro de sodio (NaF), ortovanadato de sodio 1 mM (Na
3Vo
4) y un cóctel completo de inhibidor de proteasa (Sigma Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.) y el contenido de proteína se midió usando el reactivo de ensayo de proteína BCA (Thermo Scientific, Rockford, IL, EE.UU.), con albúmina de suero bovino como patrón. Igual cantidad de proteína se resolvieron por 10% SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno (Amersham Hybond, Freiburg, Alemania). La membrana se lavó con solución salina tamponada con Tris (Tris 10 mM y NaCl 150 mM) que contiene 0,1% de Tween 20 (TBST), y se bloqueó con TBST que contiene 5% leche en polvo desnatada en polvo. La membrana se incubó durante la noche con el anticuerpo primario y de la transferencia se expuso a rábano anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa y desarrollado utilizando ECL Western blot reactivos de detección (Millipore Corporation, Billerica, MA, EE.UU.).
inmunofluorescencia (IF) tinción
Para analizar la localización intracelular de proteínas F-actina y marcadores, A549 y MDA-MB-231 células se sembraron en Lab-Tek cámara de diapositivas 8 así portaobjetos de vidrio (Nunc, Nueva York, EE.UU.) y la transfección con SI -Ct o si-DLX2 durante 24 h y después de la incubación durante 24 h después de IR. Las células fijadas en 4% de formaldehído se tiñeron a través de la incubación con el anticuerpo primario (anti cadherina-N-anticuerpo policlonal de conejo /vimentina /E-cadherina /Vinculina, diluido 1: 100) durante la noche a 4 ° C. Posteriormente fueron lavadas con PBS, se incubaron con tampón de bloqueo, y se trataron con un anticuerpo Alexa 546-conjugado anti-conejo (Molecular Probes, CA, EE.UU.) durante 3 horas a temperatura ambiente. Por último, intracelular de F-actina se tiñó usando Alexa-faloidina-488 (diluido 1: 300, Molecular Probes, CA, EE.UU.) durante 1 h. El núcleo de la célula se tiñó con TO-PRO-3 (Molecular Probes, Eugene, EE.UU.). Las células teñidas se montaron y imágenes utilizando un microscopio de barrido láser confocal (Leica, Heidelberg, Alemania).
Determinación de TGF-β1 en los sobrenadantes de cultivo de células
A549 y MDA-MB-231 (5 × 10
5 células /pocillo) células fueron expuestas a IR a 8 Gy, 4Gy y se incubaron a 37 ° C durante 24 h. El nivel de proteína TGF-β1 en los sobrenadantes de cultivo se midió usando un kit de ELISA de TGF-β1 (BD Biosciences, San Diego, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. La absorbancia a 450 nm se midió utilizando un lector de microplacas (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Los niveles de proteína TGF-β1 se determinaron a partir de tres experimentos diferentes y se expresan como pg /ml.
El análisis estadístico
Todos los experimentos se realizaron tres veces. Estadísticamente se identificaron diferencias significativas mediante la prueba t de Student. La probabilidad estadística de P & lt; 0,05 se consideró significativo. Los datos representan la media ± E.E.M. de los tres experimentos, cada uno realizado por triplicado.
Resultados
La radiación ionizante induce EMT y aumenta la expresión de CD44 y DLX2
primer lugar, analizó la sensibilidad a la radiación de carcinoma de pulmón humano A549 y MDA-MB-231 células de adenocarcinoma de mama en un ensayo clonogénico. En este ensayo, la supervivencia celular fue dependiente de la dosis se redujo por IR (0, 2, 4, 6, 8 Gy) en ambas líneas celulares, pero MDA-MB-231 células fueron más sensibles a IR que las células A549 (Figura 1A). Los cambios morfológicos de las células tras la exposición a IR fueron verificadas en las células A549 irradiados a las células 8 Gy y MDA-MB-231 en 4Gy. El A549 irradiado y MDA-MB-231cells mostraron morfologías fusiformes y alargadas, que son típicos de los fenotipos morfológicos EMT en comparación con las células control (Figura 1B).
(A)-Independiente células (1 × 10
5cells /ml) fueron expuestos a diferentes dosis de irradiación y se incubaron durante 7 días (A549) y 10 días (MDA-MB-231) a 37 ° C. Las colonias que contienen 50 o más células se contaron como células por clonación. La fracción superviviente se calculó dividiendo la eficacia de galvanoplastia de la muestra tratada con la eficiencia de chapado de control. eficiencia de plaqueo se calculó dividiendo el número de colonias con el número de células sembradas. Los valores reportados son la media de seis repeticiones de tres experimentos independientes. (B) IR induce cambios morfológicos en las células A549 y MDA-MB-231 después de 24 h de exposición (A549-8Gy, MDA-MB-231-4Gy). El aumento de la imagen es × 100. Ct, el control de la célula; IR, las células irradiadas.
A continuación se investigó los cambios en la dosis y dependiente del tiempo de CSC-y la expresión de marcadores relacionados con la EMT. En coherencia con los estudios anteriores, IR aumentó la expresión de TGF-β factor de señalización pSmad2 /3, un marcador CSC (CD44), EMT marcadores positivos (N-cadherina, vimentina), y factores de transcripción que regulan la EMT (Snail, β-catenina ), y la disminución de la expresión de EMT marcadores negativos (e-cadherina, Vinculina) en dependencia de IR de la dosis o el tiempo en ambas líneas celulares (Fig 2A y 2B). Curiosamente, la expresión de DLX2 también fue aumentado por IR en ambas líneas celulares. experimentos de dosis-respuesta revelaron que la inducción DLX2 se observó a 8 Gy en A549 y al 4Gy o superior en MDA-MB-231 (Fig 2A y S1 Fig), y los experimentos de curso temporal mostró que los niveles de proteína DLX2 se incrementaron drásticamente en 24 h después de irradiación en ambas líneas celulares (Fig 2B y S2 FIG). Además, IR activa la regulación positiva de los niveles de mRNA de los marcadores stemness (Oct4, SOX2, LIF), factores de transcripción (de la torcedura, Snail), y marcadores de metástasis (MMP2, MMP7) en ambas líneas celulares en 24 h después de la irradiación de una dosis única de 8 Gy para células A549 o 4Gy para MDA-MB-231 células (figura 2C y 2D)
.
(a) A549 y las células MDA-MB-231 fueron expuestas a IR en 0-8Gy y se incubaron a 37 ° C por 24 h. Los lisados se sometieron a análisis de transferencia Western con los anticuerpos marcados. Dos experimentos independientes obtuvieron resultados similares. (B) A549 y las células MDA-MB-231 se recogieron en 0/3/6/24 h después de 8 Gy (A549) o 4Gy (MDA-MB-231). Los lisados se sometieron a análisis de transferencia Western con los anticuerpos marcados. Dos experimentos independientes obtuvieron resultados similares. (C), (D) A549 y las células MDA-MB-231 fueron expuestas a IR en 8 Gy (A549) o 4Gy (MDA-MB-231) y se incubó a 37 ° C durante 24 h. Posteriormente, las células se aislaron por Trizol y se sometieron a análisis de PCR en tiempo real con los cebadores marcados. Todos los resultados se obtuvieron a partir de tres experimentos independientes (*** P & lt; 0,001, ** P & lt; 0,01, * P & lt; 0,05 frente a Ct). Ct, el control de la célula; IR, las células irradiadas.
La sobreexpresión de DLX2 mejora la EMT y radioresistance
Para examinar si DLX2 puede regular al alza la resistencia a la radiación y el potencial metastásico, A549 y células MDA-MB-231 fueron transfectadas transitoriamente con pcDNA3-myc vector DLX2 expresión o vector de control pcDNA3-myc, y se examinaron la expresión de marcadores de EMT CSC y por Western blot. La sobreexpresión de DLX2 aumentó la expresión de un marcador de CSC (CD44) y de EMT marcadores positivos (N-cadherina, vimentina) y la disminución de la expresión de EMT marcadores negativos (E-cadherina, Vinculina) en ambas líneas celulares. La irradiación indujo cambios similares de estos marcadores como la sobreexpresión DLX2. Sin embargo, la fosforilación de Smad2 /3 se redujo ligeramente (A549) o no cambiaron (MDA-MB-231) por DLX2 overexpressed pero aumentaron por irradiación en ambas líneas celulares. La sobreexpresión de DLX2 aumento de la expresión de Snail en A549 pero no en células MDA-MB-231. La expresión de β-catenina no fue alterada por la sobreexpresión DLX2 en ambas líneas celulares (Fig 3A).
Las células (A) se transfectaron con 4 g pcDNA-myc /DLX2 o pcDNA-myc y se incubaron a 37 ° C durante 24 h. Después de desprendimiento de las células, las células fueron expuestas a IR en 8 Gy (A549) o 4Gy (MDA-MB-231) y se incubaron a 37 ° C durante 24 h. Posteriormente, las células se lisaron y los lisados se sometieron a análisis de transferencia Western. Dos experimentos independientes obtuvieron resultados similares. (B) Las células fueron transfectadas con 4 g pcDNA-myc /DLX2 o pcDNA-myc y se incubaron a 37 ° C durante 24 h. Después de desprendimiento de las células, las células fueron expuestas a IR en 8 Gy (A549) o 4Gy (MDA-MB-231) y se incubaron a 37 ° C durante 6 h (A549), 3 h (MDA-MB-231), en transwell ( ensayo de migración). Las fotografías son campos representativos de células que migraron en la membrana. El gráfico indica la media del número de células migraron a partir de tres experimentos independientes ± SE (*** P & lt; 0,001 vs. las células de control del vector). (C) Las células fueron transfectadas con 4 g pcDNA-myc /DLX2 o pcDNA-myc y se incubaron a 37 ° C durante 24 h. Después de desprendimiento de las células, las células fueron expuestas a IR en 8 Gy (A549) o 4Gy (MDA-MB-231) y se incubaron a 37 ° C durante 48 h (A549), 24 h (MDA-MB-231), en matrigel ( ensayo de invasión). Las fotografías son campos representativos de células invadidas en la membrana. El gráfico indica el número promedio de célula invadida de tres experimentos independientes ± SE (*** P & lt; 0,001 frente a las células de control de vectores) guía empresas
Para investigar el efecto de DLX2 metastásico e IR en el A549. y se realizaron las células MDA-MB-231, la migración y ensayos de invasión. A549 DLX2-sobreexpresa y las células MDA-MB-231 exhibieron mejorada capacidad de migración por 3 y 4 pliegues, respectivamente, en comparación con el control de vector (Fig 3B). Además, la exposición a IR (8 Gy para A549, 4Gy para MDA-MB-231) aumentó la migración de los números de células en 3,2 pliegues en ambas líneas celulares (Fig 3B). Estos resultados mostraron que la sobreexpresión DLX2 y IR aumentó significativamente la motilidad celular de A549 y las células MDA-MB-231. Para examinar si la capacidad de invasión de células se incrementó de manera similar por IR o DLX2 sobreexpresión, A549 y células MDA-MB-231 se aplicaron a las cámaras de invasión y número de células adhesivas se contaron. A549 DLX2-sobreexpresa y las células MDA-MB-231 exhibieron mejoraron la capacidad invasiva por 3 y 5.3 pliegues, respectivamente (figura 3C). Además, la exposición a IR aumentó el número de células invasoras de A549 y las células MDA-MB-231 en 2,5 y 3,6 pliegues, respectivamente (figura 3C). Estos resultados demuestran que la sobreexpresión de DLX2 o IR mejora de forma significativa la capacidad migratoria e invasiva, así como los cambios de expresión de genes relacionados con el EMT CSC y en células A549 y MDA-MB-231.
Se determinó a continuación si DLX2 proporcionaría un aumento de la supervivencia de las células cancerosas después de la irradiación. DLX2 sobreexpresan A549 y las células MDA-MB-231 se irradiaron a 8 Gy y 4Gy, respectivamente, y luego se realizó ensayo clonogénico. La fracción superviviente de células transfectadas con vector de control se redujo después de la irradiación en comparación con las células no irradiadas. Sin embargo, las células Dlx2 sobreexpresan mostraron significativamente mayor tasa de supervivencia en comparación con las células transfectadas con el vector después de la irradiación (Fig 4A y 4B). En las células no irradiadas, la formación de colonias no fue afectada por DLX2-sobreexpresión (Fig 4A y 4B). Estos resultados indican que DLX2-sobreexpresión contribuye al menos parcialmente a radioresistance en A549 y las células MDA-MB-231.
Las células fueron transfectadas con 4 g pcDNA-myc /DLX2 o pcDNA-myc y se incubaron a 37 ° C por 24 h. Después de desprendimiento de las células, las células fueron expuestas a IR en 8 Gy (A549) o 4Gy (MDA-MB-231) y se incubaron a 37 ° C durante 7 días (A549), 10 días (MDA-MB-231) y clonogenicidad celular medidos por ensayo clonogénico en A549 (a) y MDA-MB-231 (B). Las fotografías son de placa representativa de las células de supervivencia. La gráfica representa el promedio de tres experimentos independientes ± SE (*** P & lt; 0,001 frente a las células expuestas IR).
El silenciamiento de DLX2 inhibe EMT inducida por IR y radioresistance
A continuación, se examinó si el silenciamiento DLX2 suprimiría el potencial metastásico y radioresistance conferida por IR. A549 y MDA-MB-231cells fueron transfectadas transitoriamente con 50 mM siRNA de DLX2 (si-DLX2) o control si-ARN (si-Ct) durante 24 h antes de la irradiación (8 Gy para A549, 4Gy para MDA-MB-231) . A continuación, analizamos la expresión de genes relacionados con la CSC y la EMT, la migración y la invasión de las habilidades y la capacidad de formación de colonias. El silenciamiento de DLX2 de siRNA EMT impedido como se demuestra por la reducción de los niveles de proteína de marcadores de EMT positivos (N-cadherina, vimentina) (Figura 5A, S3 Fig y S4 FIG) y el aumento del nivel de marcadores negativos EMT (E-cadherina, Vinculina) en irradiado Las células A549 y MDA-MB-231 (figura 5A, S5 y S6 Fig FIG). La inhibición de la DLX2 también previno la inducción de factores de transcripción críticos para EMT (Caracol y β-catenina), y un marcador de CSC (CD44) en A549 irradiado y las células MDA-MB-231. Curiosamente, la activación de factor de señalización de TGF-β, Smad2 /3, no se vio afectada por si-DLX2 en células irradiadas (Fig 5A).
Las células (A) se transfectaron con 50 M si-DLX2 o Si- Ct y se incubaron a 37 ° C durante 24 h, las células fueron expuestas a IR en 8 Gy (A549) o 4Gy (MDA-MB-231) y se incubaron a 37 ° C durante 24 h. Posteriormente, las células se lisaron y los lisados se sometieron a análisis de transferencia Western. Dos experimentos independientes obtuvieron resultados similares. (B) Las células fueron transfectadas con 50 mM si-si-DLX2 o Ct y se incubaron a 37 ° C durante 24 h. Después de desprendimiento de las células, las células fueron expuestas a IR en 8 Gy (A549) o 4Gy (MDA-MB-231) y se incubaron a 37 ° C durante 6 h (A549), 3 h (MDA-MB-231), en transwell ( ensayo de migración). Las fotografías son campos representativos de células que migraron en la membrana. El gráfico indica la media del número de células migraron a partir de tres experimentos independientes ± SE (*** P & lt; 0,001). (C) Las células se transfectaron con 50 mM si-si-DLX2 o Ct y se incubaron a 37 ° C durante 24 h. Después de desprendimiento de las células, las células fueron expuestas a IR en 8 Gy (A549) o 4Gy (MDA-MB-231) y se incubaron a 37 ° C durante 48 h (A549), 24 h (MDA-MB-231), en matrigel ( ensayo de invasión). Las fotografías son campos representativos de células invadidas en la membrana. El gráfico indica el número promedio de célula invadida de tres experimentos independientes ± SE (*** P & lt; 0,001).
Para investigar el efecto anti-metastásico del si-DLX2 en las células irradiadas, la migración y se llevaron a cabo ensayos de invasión. DLX2-silenciamiento en MDA-MB-231 células ligeramente reducidos capacidad de migración en comparación con las células si-Ct. También, en A549 irradiado y las células MDA-MB-231, la transfección de si-DLX2 disminuyó el número de células que migran en 1,7 pliegues en comparación con si-Ct transfección (Fig 5B). Estos resultados muestran que el silenciamiento de DLX2 por siRNA la motilidad celular, inhibió de A549 y las células MDA-MB-231. Para examinar si la capacidad de invasión de células se redujo de manera similar por el silenciamiento DLX2, se aplicaron células irradiadas a las cámaras de invasión y se contaron el número de células adhesivas. En las células no irradiadas, DLX2-silenciamiento inhibió la capacidad invasora de las células A549 en 1,4 pliegues, pero no se observó ningún cambio significativo en las células MDA-MB-231. En A549 irradiado y las células MDA-MB-231, la transfección de si-DLX2 disminuyó el número de células invasoras de A549 y las células MDA-MB-231 en 2,3 y 2,2 pliegues, respectivamente (Fig 5C). Estos resultados demostraron que el silenciamiento de DLX2 en A549 irradiado y las células MDA-MB-231 inhibió significativamente la expresión de genes asociados con la CSC y EMT, y capacidad migratoria e invasiva que fueron inducida por IR.
Se analizaron a continuación si DLX2-silenciamiento influye en la supervivencia de las células cancerosas después de la irradiación. Las células A549 y MDA-MB-231 transfectadas con si-DLX2 o si-Ct se irradiaron a 4Gy y 2Gy, respectivamente, y luego se examinó la formación de colonias. En las células no irradiadas, el silenciamiento DLX2 resultó en una ligera disminución de la fracción de supervivencia en ambas líneas celulares. En las células irradiadas, DLX2 silenciamiento con plomo a una disminución adicional en la supervivencia celular en una extensión significativa (disminución de 1,5 veces para A549 y la disminución de 1,6 veces para MDA-MB-231) (Fig 6A y 6B). Estos resultados indican que el silenciamiento de DLX2 suprimida EMT inducida por IR potencial y una mayor sensibilidad a la radiación.
Las células fueron transfectadas con 50 mM si-si-DLX2 o Ct y se incubaron a 37 ° C durante 24 h. Después de desprendimiento de las células, las células fueron expuestas a IR a 4Gy (A549) o 2Gy (MDA-MB-231) y se incubaron a 37 ° C durante 7 días (A549), 10 días (MDA-MB-231) y clonogenicidad celular medidos por ensayo clonogénico en A549 (a) y MDA-MB-231 (B). Las fotografías son de placa representativa de las células de supervivencia. La gráfica representa el promedio de tres experimentos independientes ± SE (*** P & lt; 0,001).
DLX2 expresión inducida por IR está regulado por Smad2 /3
IR promueve la EMT a través de Smad dependiente de la señalización de TGF-β en líneas celulares de cáncer [6, 27, 28], y DLX2 es un gen diana de Smad dependiente de la señalización de TGF-β y el factor de retroalimentación negativa [34]. Por lo tanto, hemos examinado la asociación de señalización con la expresión DLX2 IR inducida por TGF-β. La irradiación de las células A549 (8 Gy) y MDA-MB-231cells (4Gy) aumentó la cantidad de TGF-β1 secretado en el medio de cultivo (Fig 7A). Además, IR promueve la fosforilación del factor de la señalización de TGF-β Smad2 /3 (Figs 2A, 2B, 3A, 5A y 7C, S1 y S2 Fig Fig). Sin embargo, la sobreexpresión de DLX2 disminuyó más bien ligeramente la fosforilación de Smad2 /3 (Fig 3A). La fosforilación de Smad2 /3 no se vio afectada ya sea por si-DLX2 en A549 irradiado y las células MDA-MB-231 (Fig 5A). Por lo tanto, el próximo examinó si la inducción de DLX2 por IR está regulada por la señalización Smad2 3 /. Smad2 /3 silenciamiento de siRNA abrogó la expresión inducida por IR mRNA DLX2 (Fig 7B) y expresión de la proteína DLX2 (Fig 7C y 7D). Estos resultados indican que la expresión DLX2 IR inducida depende de Smad2 /3 de señalización.
(A) Los niveles de TGF-β1 inmunorreactivo se cuantificaron a partir de medio de cultivo celular por ELISA, como se describe en los Materiales y métodos (*** P & lt; 0,001, ** P & lt; 0,01, frente al Ct). Ct, el control de la célula; IR, las células irradiadas. (B) Las células se transfectaron con 100 mM si-Smad2 /3 o si-Ct, se incubaron a 37 ° C durante 24 h. A continuación, las células fueron expuestas a IR en 8 Gy (A549) o 4Gy (MDA-MB-231) y se incubaron a 37 ° C durante 24 h. ARN total fue aislado de las células y se sometió a análisis de PCR en tiempo real. El gráfico representa la media de tres experimentos independientes ± SE (*** P & lt; 0,001). (C) Las células se transfectaron con 100 mM si-Smad2 /3 o si-Ct y se incubaron a 37 ° C durante 24 h. A continuación, las células fueron expuestas a IR en 8 Gy (A549) o 4Gy (MDA-MB-231) y se incubaron a 37 ° C durante 24 h. Posteriormente, los lisados celulares se sometieron a análisis de transferencia Western. Tres experimentos independientes obtuvieron resultados similares. (D) Los niveles de proteína se cuantificaron por densitometría. Los datos se representan como valores relativos a las del SI-Ct después de la normalización con β-actina (*** P & lt; 0,001, ** P & lt; 0,01, * P & lt; 0,05 frente a si-Ct)
Discusión
la radioterapia es un componente crítico del tratamiento del cáncer, pero algunas de las células de cáncer que sobreviven ganar radioresistance [1] y la capacidad metastásica [2] en la radioterapia repetida.